高考生物二轮课件：8.17 基因工程与细胞工程

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第十七讲　基因工程与细胞工程
将目的基因导入受体细胞　
DNA与RNA杂交　
1.限制酶具有特异性,即一种限制酶只能识别特定的碱基序列,并在特定的位点上进行切割。2.质粒是常用的目的基因的载体,它是一种小型的环状DNA分子,具有一个至多个限制酶切割位点及标记基因。3.目的基因的获取有从基因文库中获取和人工合成两类方法。4.基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。5.目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法;导入动物细胞常用显微注射技术,导入微生物细胞常用感受态细胞法。
6.植物组织培养需要各种营养成分和植物激素,动物细胞培养也需要各种营养成分及血清、血浆等一些天然成分。7.植物体细胞杂交可用于作物育种,动物细胞融合可用于单克隆抗体的制备。8.产生单克隆抗体的细胞是杂交瘤细胞,它既能产生单克隆抗体又能无限增殖。
(　　)1.质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外,并且具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。(　　)2.在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中,不需要用选择培养基筛选导入目的基因的细胞。(2015北京,5B改编)(　　)3.DNA分子经限制酶切割后产生的DNA片段末端是黏性末端。(　　)4.胰岛素基因表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得。(2015重庆,6A改编)(　　)5.启动子是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位。
(　　)6.PEG是促细胞融合剂,可直接诱导植物细胞融合。(2016江苏,9A)(　　)7.植物的每个细胞在植物体内和体外都能表现出细胞的全能性。(　　)8.骨髓瘤细胞经免疫处理,可直接获得单克隆抗体。(2016江苏,9C)(　　)9.原代培养的细胞遗传物质没有改变,而传代培养的细胞有的已经发生突变,获得了不死性。(　　)10.动物细胞融合技术和植物体细胞杂交技术类似,也可获得杂种动物。
考向1基因工程及转基因技术的安全性(2016全国乙卷,40)某一质粒载体如图所示,外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用Bam HⅠ酶切后,与用Bam HⅠ酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题:
(1)质粒载体作为基因工程的工具,应具备的基本条件有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出两点即可),而作为基因表达载体,除满足上述基本条件外,还需具有启动子和终止子。 
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选,在上述四种大肠杆菌细胞中,未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　;并且　　　　　　　　　和　　　　　　　　　　　　　　　　　　的细胞也是不能区分的,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落,还需使用含有　　　的固体培养基。 (3)基因工程中,某些噬菌体经改造后可以作为载体,其DNA复制所需的原料来自于　　　　　　　　　。 
答案: (1)能自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点(答出两点即可)(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均不生长含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒)二者均含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均能生长　四环素(3)受体细胞
解析: 本题考查基因工程的相关知识。解题的切入点是基因工程中所用载体的特点及目的基因导入受体细胞后的筛选。(1)基因工程中的载体应具备如下条件:必须有一个或多个限制酶切点;具有自我复制能力;具有标记基因;对宿主细胞无害。(2)未转化的和仅含环状目的基因的细胞不能在含有氨苄青霉素的培养基上生长,故不能区分;而含有质粒载体和重组质粒的细胞在含有氨苄青霉素的培养基上都能生长,也不能区分。因目的基因插入位点在抗四环素基因上,抗四环素基因被破坏,丧失了原有的功能,故含有重组质粒的大肠杆菌不抗四环素。将获得的单个菌落各挑取少许分别接种到含有四环素的培养基上,不能生长的即为所筛选的菌落,即含有重组质粒的大肠杆菌。(3)噬菌体是营寄生生活的,利用受体细胞内的原料进行自身DNA的复制和蛋白质的合成。
1.有关基因工程概念及工具的8个错混点(1)限制酶是一类酶,而不是一种酶。(2)限制酶的成分为蛋白质,其作用的发挥需要适宜的理化条件,高温、强酸或强碱均易使之变性失活。(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶,目的是产生相同的黏性末端。(4)将一个基因从DNA分子上切割下来,需要切两处,同时产生4个黏性末端。(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同,同一个DNA分子用不同的限制酶切割,产生的黏性末端一般不相同。
(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外,不能破坏标记基因,以便于进行检测。(7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子,能将目的基因导入受体细胞内;膜载体是蛋白质,与细胞膜的通透性有关。(8)基因工程中有3种工具,但工具酶只有2种。
2.有关基因工程操作过程的4个错混点(1)基因表达需要启动子与终止子的调控,所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。(2)目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程,称为转化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。(3)标记基因的作用——筛选、检测目的基因是否导入受体细胞,常见的有抗生素抗性基因、发光基因(表达产物为带颜色的物质)等。
(4)受体细胞常用植物受精卵或体细胞(经组织培养培养成新个体)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物(大肠杆菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌(需内质网、高尔基体的加工、分泌);一般不用支原体,原因是它营寄生生活;一定不能用哺乳动物成熟的红细胞,原因是它无细胞核,不能合成蛋白质。3.有关基因工程应用与蛋白质工程的2个错混点(1)基因治疗后,缺陷基因没有改变。基因治疗是把正常基因导入受体细胞中,以表达正常产物从而治疗疾病,对原来细胞中存在缺陷的基因没有清除或改变。(2)对蛋白质分子进行改造,其本质是改变其基因组成。如果对蛋白质直接改造,即使改造成功,被改造的蛋白质分子还是无法遗传。
考查角度1　考查基因工程操作的基本工具和流程1.(2016河北石家庄期末调研,4)请回答以下有关基因工程的问题。(1)基因工程中切割DNA的工具酶是　　　　　　　　　　　　　。DNA连接酶根据其来源不同,分为　　　　　　　　　　　　　　和　　　　　　　　　　　　。 (2)利用PCR技术扩增目的基因的前提,是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便根据这一序列合成　　　　　　　　　　　　　。 
(3)　　　　　　　　　　　　是基因工程的核心步骤。启动子是　　　　　　　　　识别和结合的部位,它能驱动基因转录出mRNA。 (4)将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (5)要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因,采用的方法是　　　　　　　　　　　　　　　技术。 
答案: (1)限制性核酸内切酶(限制酶)　E·cli DNA连接酶T4DNA连接酶(顺序可颠倒)(2)引物(引物对)(3)基因表达载体的构建　RNA聚合酶(4)农杆菌转化法(5)DNA分子杂交
解析: (1)切割DNA的工具酶是限制性核酸内切酶,DNA连接酶按来源不同可分为E·cli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。(2)利用PCR技术,要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便根据这一序列合成引物。(3)第二步,基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,它能驱动基因转录出mRNA。(4)将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法。(5)要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因,采用的方法是DNA分子杂交技术。
考查角度2　考查基因工程在生产、科技中的应用2.(2016安徽六安一中一模,40)多聚半乳糖醛酸酶(PG)能降解果胶使细胞壁破损,成熟的番茄果实中,PG合成显著增加,能使果实变红变软,但不利于保鲜。利用基因工程减少PG基因的表达,可延长果实保质期。科学家将PG基因反向接到Ti质粒上,导入番茄细胞中,得到转基因番茄,具体操作流程如图。据图回答下列问题:
(1)提取目的基因:①若已获取PG的mRNA,可通过　　　　　　　获取PG基因;②在该基因上游加结构A可确保基因的反向转录,结构A上应具有　　　　　　　　　　结合位点;③重组质粒转移到大肠杆菌中的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。(2)用含目的基因的农杆菌感染番茄原生质体后,可用含有　　　　　　　的培养基进行筛选,培养24~48 h后取样,在质量浓度为0.3 g/mL的蔗糖溶液中,观察细胞　　　　　　　　　　　　现象来鉴别细胞壁是否再生。 
(3)由于导入的目的基因能转录出反义RNA,且能与　　　　　　　　　　　　　　　　互补结合,因此可抑制PG基因的正常表达。若转基因番茄的保质期比非转基因番茄　　　　　　　,则可确定转基因番茄培育成功。 (4)获得的转基因番茄产生的种子不一定保留目的基因,科研人员常采用　　　　　　　　　　　　方法使子代保持转基因番茄的优良性状。 
答案: (1)①反转录　②RNA聚合酶　③使目的基因随质粒的复制而增加(2)卡那霉素　是否发生质壁分离(3)天然PG基因转录的mRNA　长(4)无性繁殖(或植物组织培养)
解析: (1)已获取PG的mRNA,可通过逆转录(反转录)的方法获得目的基因。因转录的产物是mRNA,在转录时需要RNA聚合酶。重组质粒转化到大肠杆菌中的目的是大量复制目的基因。(2)由图可知,重组质粒中含卡那霉素抗性基因而四环素抗性基因被破坏,故可用含卡那霉素的培养基进行筛选。植物细胞在质量浓度为0.3 g/mL的蔗糖溶液中会发生质壁分离现象,所以可以用来鉴别细胞壁是否再生。(3)由以上分析可知,反义RNA与天然PG基因转录的mRNA结合,从而抑制翻译过程。若转基因番茄的保质期比非转基因番茄长,则肯定转基因番茄成功。(4)获得的转基因番茄产生的种子不一定保留目的基因,植物组织培养属于无性繁殖,故科研人员常采用植物组织培养方法使子代保持转基因的优良性状。
考向2克隆技术及其伦理道德问题1.(2014课标Ⅰ卷,40)某研究者用抗原(A)分别免疫3只同种小鼠(X、Y和Z),每只小鼠免疫5次,每次免疫一周后测定各小鼠血清抗体的效价(能检测出抗原抗体反应的血清最大稀释倍数),结果如下图所示。
若要制备杂交瘤细胞,需取免疫后小鼠的B淋巴细胞(染色体数目40条),并将该细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞(染色体数目60条)按一定比例加入试管中,再加入聚乙二醇诱导细胞融合,经筛选培养及抗体检测,得到不断分泌抗A抗体的杂交瘤细胞。回答下列问题:(1)制备融合所需的B淋巴细胞时,所用免疫小鼠的血清抗体效价需达到16 000以上,则小鼠最少需要经过　　　　次免疫后才能有符合要求的。达到要求后的X、Y、Z这3只免疫小鼠中,最适合用于制备B淋巴细胞的是　　　小鼠,理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
(2)细胞融合实验完成后,融合体系中除含有未融合的细胞和杂交瘤细胞外,可能还有　　　　　　　　　　　　　,体系中出现多种类型细胞的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (3)杂交瘤细胞中有　　 　个细胞核,染色体数目最多是　　　条。 (4)未融合的B淋巴细胞经多次传代培养后都不能存活,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。〚导学号06890037〛 
答案: (1)4　Y　Y小鼠的血清抗体效价最高(2)B淋巴细胞相互融合形成的细胞、骨髓瘤细胞相互融合形成的细胞　细胞融合是随机的,且融合率达不到100%(3)1　200(4)不能无限增殖
解析: 本题考查动物单克隆抗体技术的原理及应用。(1)由图看出,到第4次免疫时,Y和Z的血清抗体效价已达到要求,即16 000 以上,而前3次免疫后,3只小鼠的血清抗体效价均未达到要求。从第3次开始,Y小鼠的血清抗体效价最高,所以Y小鼠最适合用于制备B淋巴细胞。(2)仅考虑细胞之间的两两融合。该融合体系中有5种类型的细胞:2种未融合型(B淋巴细胞、骨髓瘤细胞),3种融合型(B淋巴细胞+B淋巴细胞、骨髓瘤细胞+骨髓瘤细胞、B淋巴细胞+骨髓瘤细胞),由此可看出细胞融合具有随机性。(3)杂交瘤细胞是B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成的,有1个细胞核,核内染色体数为40+60=100,在有丝分裂后期,核内染色体数为200。(4)B淋巴细胞不能无限增殖,所以经多次传代培养后都不能存活。
2.(2013课标Ⅱ卷,40)甲、乙是染色体数目相同的两种二倍体药用植物,甲含有效成分A,乙含有效成分B。某研究小组拟培育同时含有A和B的新型药用植物。回答下列问题:(1)为了培育该新型药用植物,可取甲和乙的叶片,先用　　　　　　　酶和　　　　　　　酶去除细胞壁,获得具有活力的　　　　　　　,再用化学诱导剂诱导二者融合,形成的融合细胞进一步培养形成　　　　　　组织,然后经过　　　　　　　　　形成完整的杂种植株。这种培养技术称为　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
(2)上述杂种植株属于多倍体,多倍体是指　　　　　　　　　　　　　　　　　　。假设甲与乙有性杂交的后代是不育的,而上述杂种植株是可育的,造成这种差异的原因是　　　　　　　　　　　　。 (3)这种杂种植株可通过制作人工种子的方法来大量繁殖。经植物组织培养得到的　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　等材料用人工薄膜包装后可得到人工种子。 
答案: (1)纤维素　果胶　原生质体　愈伤　再分化(或分化)　植物体细胞杂交技术(2)体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体　在减数分裂过程中,前者染色体联会异常,而后者染色体联会正常(其他合理答案也可)(3)胚状体、不定芽、顶芽、腋芽(答对其中一个即可)解析: (1)利用植物体细胞杂交技术培育新品种的过程中,应先用纤维素酶和果胶酶去掉植物细胞的细胞壁,获得有活力的原生质体,经诱导融合后培养成为愈伤组织,再经再分化形成完整植物体。(2)多倍体是指由受精卵发育来的、细胞内含有三个或三个以上染色体组的个体。(3)欲通过人工种子大量繁殖这种杂种植株,则可将经再分化形成的胚状体、不定芽、顶芽、腑芽等材料经人工薄膜包装来获得人工种子。
1.辨析植物细胞工程的3个错混点(1)植物体细胞杂交即两个细胞融合成一个细胞,不管是染色体数、基因型还是染色体组都采用直接相加的方法。(2)利用植物组织培养生产细胞产物时,有时只需将外植体培养到愈伤组织,从愈伤组织中获取产物。(3)人工种子发育初期需要的营养物质由人工胚乳提供。
2.辨析动物细胞培养与体细胞核移植的3个错混点(1)植物组织培养和动物细胞培养都存在细胞的培养过程,但植物细胞可以先分裂再分化,而动物细胞不分化只分裂。(2)区分原代培养和传代培养的关键是是否分瓶培养。贴壁生长到一定程度需要用胰蛋白酶处理,然后再分瓶培养,原代培养结束,开始了传代培养。(3)核移植过程中供体理论上是提供细胞核,但操作过程中可以把整个体细胞注入去核的卵母细胞中去,原因是体细胞体积相对较小,取核难度较大,另外细胞膜对核融合的障碍性较小。
3.辨析动物细胞融合与单克隆抗体的3个错混点(1)灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力,但是并不破坏这些病原体的抗原结构。(2)除了受到注射的抗原的刺激,小鼠在生活过程中还可能受到其他抗原的刺激,因此从小鼠体内取出的多个B淋巴细胞可能产生多种不同抗体,所以进行第二次筛选是非常必要的。(3)单克隆抗体制备过程中,进行了多次动物细胞培养的操作,说明动物细胞培养是动物细胞工程的基础。
考查角度1　考查植物细胞工程1.(2016甘肃张掖一诊,40)利用相关工程技术可以获得抗黑腐病杂种黑芥—花椰菜植株,已知野生黑芥具有黑腐病的抗性基因,而花椰菜易受黑腐病菌的危害而患黑腐病,技术人员用一定剂量的紫外线处理黑芥原生质体可使其染色体片段化,并丧失再生能力,再利用此原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜原生质体融合,流程如下图。
据图回答下列问题:(1)该过程用到的工程技术有　　　和　　　　　。 (2)过程①所需的酶是　　　　　　　　　　　　,过程②PEG的作用是　　　　　　　　　　　,经过②操作后,需筛选出融合的杂种细胞,显微镜下观察融合的活细胞中有供体的叶绿体存在可作为初步筛选杂种细胞的标志。 (3)原生质体培养液中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压,其作用是　　　　　　　　　　　　　。原生质体经过细胞壁再生,进而分裂和脱分化形成　　　　　　　　　。 (4)若分析再生植株的染色体变异类型,应剪取再生植株和双亲植株的根尖,制成装片,然后在显微镜下观察比较染色体的　　　　　　　　　;将杂种植株栽培在含有　　　　　　　　　的环境中,可筛选出具有高抗性的杂种植株。 
答案: (1)植物体细胞杂交　植物组织培养(2)纤维素酶和果胶酶　促进原生质体的融合(3)保持原生质体完整性　愈伤组织(4)形态和数目　黑腐病菌
解析: (1)据图可知,该流程图表示先去掉两种植物细胞的细胞壁,然后诱导融合获得杂种细胞,通过植物组织培养获得杂种植株,该过程是植物体细胞杂交。(2)植物细胞细胞壁的成分是纤维素和果胶,因此采用纤维素酶和果胶酶去掉植物细胞的细胞壁;聚乙二醇(PEG)的作用是让原生质体融合。(3)去掉细胞壁后获得的原生质体需要放在适宜浓度的甘露醇溶液中,保持原生质体完整性,避免失水或吸水;在植物组织培养中,经过脱分化后形成愈伤组织。(4)由于染色体在显微镜下能看见,因此可以制作临时装片,观察染色体的形态和数目,以确定是否发生染色体变异;对杂种植株进行鉴定最简单的方法是从个体水平上进行检测,即接种黑腐病菌,观察植物的性状。
考查角度2　考查动物细胞工程及应用2.(2016贵州高校招生适应考试,40)近年来,由于食品安全、环境污染等问题的加重,胃癌的发病率不断增加。常见的切除、化疗、放疗等治疗手段对病人的身体副作用较大,而“生物导弹”(借助单克隆抗体的导向作用,能将药物定向带到癌细胞所在位置)的定向治疗为胃癌患者带来了福音。下图是“生物导弹”——抗人体胃癌的单克隆抗体的制备过程。
回答下列问题:(1)幽门螺旋杆菌的感染与胃癌的发生密切相关,幽门螺旋杆菌从细胞结构上与人体细胞相比,最显著的特点是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (2)从免疫学的角度分析,图中实验小鼠注射的甲是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,从小鼠的　　　　(免疫器官)中可获得相应的B淋巴细胞。 (3)诱导细胞融合形成细胞乙的原理是　　　　　　　　　　　。若只考虑细胞的两两联合,理论上乙有　　　种类型,符合要求的细胞特点是　　　　　　　　　　。 
(4)丙需进行克隆化培养和专一抗体检测,经多次筛选后可获得数量较多的能分泌所需抗体的细胞丁,细胞丁可在体外条件下大规模培养,也可以注射到小鼠　　　　内进行体内培养,从而获得大量的单克隆抗体。该抗胃癌单克隆抗体与从动物血清中分离的抗体相比,最主要的优点是　　　　　　　　　　。 
答案: (1)没有核膜包被的细胞核(2)能与抗人体胃癌抗体特异性结合的抗原　脾脏(3)细胞膜的流动性　3　既能大量繁殖又能产生特异性抗体(4)腹腔　特异性强,灵敏度高,并可大量制备