2020-2021学年第1章 发酵工程第2节 微生物的培养技术及应用一 微生物的基本培养技术导学案

这是一份2020-2021学年第1章 发酵工程第2节 微生物的培养技术及应用一 微生物的基本培养技术导学案，共24页。学案主要包含了师问导学，智涂笔记，师说核心，检测反馈，网络建构，主干落实等内容，欢迎下载使用。
课程标准
1．阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。
2．阐明无菌技术是在操作过程中保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。
3．概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室进行微生物分离和纯化的常用方法。
素养达成
1．根据微生物的代谢类型分析培养基的组成。(科学思维)
2．讨论并掌握无菌技术的实验操作方法；讨论并掌握微生物的纯培养的方法。(科学探究)
同学们，右图中正在进行科学研究的老人是谁？他是法国微生物学家和化学家巴斯德！19世纪中期的法国，葡萄酒酿成后的变酸问题，一直困扰着酿酒业主。巴斯德研究证明，酒质变酸是发酵液体中的细菌在捣鬼。他经过一次又一次试验，最终发现把葡萄酒加温到55摄氏度，既消灭了细菌，又保持了酒的美味不变，一个困扰酿酒业的难题终于解决了。由此人们认识到保持培养物纯净的重要性。
防止杂菌入侵，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。在实验室培养微生物，一方面需要为培养的微生物提供合适的营养和环境条件，另一方面需要确保其他微生物无法混入。本节课我们将通过酵母菌的纯培养实验，学习微生物培养的基本技术。
探究点一 培养基的配制
【师问导学】
1．下表是培养两种细菌的培养基的配方，据此回答问题。
表一 培养基A
表二 培养基B(牛肉膏蛋白胨固体培养基)
(1)表一中的碳源是________，氮源是________。表二中的氮源是__________________，琼脂________(填“提供”或“不提供”)营养成分，其作用是作为________。
(2)由上表可以看出，虽然培养不同微生物的具体配方不同，但一般都要有________、________、________、________这四类物质。请从活细胞的元素组成方面说明其原因。
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)不同培养基还要满足不同微生物生长对________、________________以及________的要求。
2．能够利用无机碳源的微生物的同化作用类型是什么？
3．牛肉膏蛋白胨培养基是一种常见的细菌培养基，其中牛肉膏、蛋白胨能够提供哪些营养成分？
4．在科研和生产上，研究和应用微生物的前提是什么？在实验室中培养微生物应注意哪些问题？
【智涂笔记】
[易错提醒]
有关培养基营养物质的四点提醒
(1)培养不同的微生物所需要的营养物质可能不同。
①自养型微生物的培养基中可不添加有机碳源，因其可利用CO2等无机碳源。
②异养型微生物的培养基中必须添加有机碳源。
(2)对异养微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源、能源。
(3)微生物需要补充生长因子，是由于缺乏合成生长因子所需要的酶或合成能力有限。
(4)微生物需要量最大的营养物质是碳源。能合成含碳有机物的是自养型，反之则为异养型。
【师说核心】
1．培养基的配制原则
(1)目的要明确：不同的微生物需求不同，根据培养目的进行配制。
(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。
(3)pH要适宜：为维持pH的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，常用K2HPO4－KH2PO4。
2．培养基的成分及功能
3.几种微生物的营养和能量来源
【检测反馈】
1．下列关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述，错误的是( )
A．操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
B．将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯
C．待培养基冷却至50 ℃左右时倒平板
D．待培养基冷却凝固后将平板倒过来放置
2．回答下列与细菌培养相关的问题。
(1)在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是________(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是________________________________________________________________________。
硝化细菌在没有碳源的培养基上________(填“能够”或“不能”)生长，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)用平板培养细菌时一般需要将平板________(填“倒置”或“正置”)。
(3)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过________处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
探究点二 无菌技术
【师问导学】
1．无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
2．用于生物消毒的微生物具有什么特点？
3．消毒和灭菌技术：
(1)消毒和灭菌的原理是什么？
(2)消毒和灭菌都能杀死所有的微生物吗？
(3)消毒和灭菌是否适用于所有的生物和物品？
(4)选择以下材料或用具所需的无菌技术。
①吸管 ②培养细菌用的培养基 ③培养皿 ④实验操作者的双手 ⑤烧瓶 ⑥接种针 ⑦试管 ⑧接种环 ⑨玻璃棒
消毒：________________
灼烧灭菌：________________
干热灭菌：________________
高压蒸汽灭菌：________________
(5)注射药液前，常用酒精擦拭注射部位，这是消毒还是灭菌？体积分数为70%和95%的酒精，哪种效果更好？为什么？
【智涂笔记】
有关消毒和灭菌的几点提醒
1．酒精消毒液中酒精浓度对杀菌效果的影响：70%的酒精杀菌效果最好。原因是浓度过高，菌体表面蛋白质变性过快而凝固成一层保护膜，酒精不能渗入其中；浓度过低，杀菌能力减弱。
2．无菌技术措施的选择原则。
(1)考虑效果：灭菌的效果比消毒要好。
(2)考虑操作对象的承受能力：接种环或接种针等金属用具一般用灼烧灭菌；培养皿等玻璃器皿用干热灭菌；培养基用高压蒸汽灭菌。操作者双手一般用酒精擦拭，即化学消毒。牛奶用巴氏消毒法。
【师说核心】
1．无菌技术的重要性
防止杂菌污染是获得纯净培养物的关键。防止外来杂菌污染培养物，离不开无菌技术；要防止培养物污染人体和环境，也离不开无菌技术。
2．常用灭菌与消毒方法的比较
【检测反馈】
1．高温灭菌的原理是( )
A．每种微生物生长的最适温度是一定的
B．微生物对于高温环境不适应
C．高温破坏了微生物的蛋白质等生物大分子，影响其生命活动
D．高温降低了环境中氧的浓度
2．关于灭菌和消毒的不正确的理解是( )
A．灭菌是指杀死环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子
B．消毒和灭菌实质上是相同的
C．接种环用灼烧的方法灭菌
D．常用灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌等
3．在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。请回答下列问题：
(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能________________。在照射前，适量喷洒________，可强化消毒效果。
(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是________________________。
探究点三 微生物的纯培养
【师问导学】
阅读教材P11～13内容，结合下图，回答问题。
1．为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
2．从防止杂菌污染的角度思考，培养基冷却凝固后将培养皿倒置的原因是什么？
3．采用平板划线法接种菌种时，哪些操作可防止杂菌污染？
4．在做第二次划线以及其后的操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
5．接种操作时每次划线接种前与接种后都要灼烧接种环或接种针，其目的分别是什么？
6．接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个接种的培养基放在一起培养？未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键。如果有菌落生长，说明了什么？
【智涂笔记】
[方法技巧]
单细胞菌落的获得
(1)利用平板划线法接种时，单细胞菌落从后划线的区域挑取。
(2)利用稀释涂布平板法接种时，只有合适的稀释度才能得到单细胞菌落。
[归纳提升]
倒平板操作的注意事项
(1)培养基灭菌后需要冷却至50 ℃左右时才能倒平板。温度过高，培养基凝固后皿盖上冷凝水过多，落入培养基，造成污染；温度过低，培养基又会凝固。
(2)将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。
(3)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板应弃用，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
(4)整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。
【师说核心】
1．平板划线法
平板划线操作及培养结果：接种环在固体培养基表面连续划线，将聚集的菌种逐步分散到培养基的表面。平板划线示意图(A)及培养后菌落分布示意图(B)如下图所示。
2．稀释涂布平板法
(1)主要操作环节：系列稀释和涂布平板。
(2)系列稀释和涂布平板后培养结果如图所示：
3．平板划线法与稀释涂布平板法的注意事项
(1)平板划线法：
①接种环的灼烧：
a．第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物。
b．每次划线前：杀死残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端。
c．划线结束后：杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者。
②灼烧接种之后，要冷却后再进行操作，以免温度太高杀死菌种。
③划线时最后一区域不要与第一区域相连。
④划线用力要大小适当，防止用力过大划破培养基。
(2)稀释涂布平板法：
①稀释操作时：每支试管及其中的9 mL水、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2 cm处。
②涂布平板时：
a．涂布器浸在体积分数为70%的酒精中，取出时，让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
b．不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。
c．酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不接触任何物体。
4．两种纯化细菌方法的比较
【检测反馈】
1．下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法错误的是( )
A．①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行
B．步骤①中待倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖
C．步骤③中，每次划线前后都需对接种环进行灭菌处理
D．划线接种结束后，将图④平板倒置后放入培养箱中培养
2．下图甲、乙是微生物接种常用的两种方式，回答相关问题：
(1)图甲是利用____________法进行微生物接种的，图乙是利用________________法进行微生物接种的。这两种方法所用的接种工具分别是________和________；对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是____________和酒精消毒。
(2)平板划线时，为保证微生物的数目随划线次数的增加而逐步减少，每次划线都要从________________________开始，平板划线结束后，最后一次划的线不能与第一次划的线________。
(3)接种操作为什么一定要在酒精灯火焰附近进行？________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)下图是接种后培养的效果图解，其接种方法是________(填“图甲”或“图乙”)所示方法。
(5)假设用图乙所示方法接种培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是什么？__________________________________________。
【网络建构】
【主干落实】
1．各种培养基都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质。
2．获得纯净微生物培养物的关键是防止杂菌污染。
3．消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
4．灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
5．由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
6．菌落是分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
1.不同培养基的具体配方不同，但一般都含( )
A．碳源、磷酸盐和维生素
B．氮源和维生素
C．水、碳源、氮源和无机盐
D．碳元素、氧元素、氢元素、氮元素
2．采用干热灭菌、灼烧灭菌、高压蒸汽灭菌、紫外线照射等几种方法，可分别杀死哪些部位的杂菌( )
A．接种环、吸管、培养基、接种室
B．吸管、接种环、培养基、接种箱
C．培养基、吸管、接种环、接种箱
D．培养皿、吸管、培养基、双手
3．下列有关平板划线操作的描述，错误的是( )
A．将接种环放在酒精灯火焰上灼烧，直到接种环烧红
B．接种环在平板上划线的位置是随机的
C．在挑取菌种前和接种完毕后均要将试管口通过酒精灯火焰
D．最后一区的划线不能与第一区相连
4．下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是( )
A．培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌
B．接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧
C．接种后的培养皿要倒置，以防培养基被污染
D．菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基
5．下表是培养某微生物的培养基的配方，请回答下列问题：
(1)培养基的类型很多，但培养基中一般都含有水、碳源、________和无机盐。上述培养基配方中能充当碳源的成分是________________。培养基配制完成以后，一般还要调节pH并对培养基进行________处理。
(2)在配制培养基时，除考虑营养条件外，还要考虑________、________和渗透压等条件。
(3)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行________(填“消毒”或“灭菌”)；操作者的双手需进行清洗和________；空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质________，还能损伤DNA的结构。
(4)分离纯化微生物最常使用的接种方法是____________和____________。
(5)在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
第1小节
(一)从社会中来
提示：应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。
(二)旁栏思考题
1．培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。
2．无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
(三)探究·实践
1．在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染。
2．提示：能观察到单一菌落，这些菌落的颜色、形状和大小一致。如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。
3．根据实际情况回答。
(四)思维训练
提示：所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括一些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果‘酵素’可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。可以通过查阅专业学术期刊上发表的有关研究论文，或亲自检测水果“酵素”中的成分，获取科学可靠的证据进行全面论证。
(五)练习与应用
概念检测
1．(1)× (2)√ (3)×
2．提示：日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低温储存等。干制可以降低食品的水分含量；腌制可以通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；低温则是通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
拓展应用
1．(1)培养皿和培养基
(2)提示：接种。
(3)提示：通过实验结果可以看到，洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。
可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
2．(1)意味着培养液中O2含量不同。
(2)在一定转速范围内，摇床的转速越高酵母菌的种群密度越大。其原因是摇床转速越高，培养基中O2越充足。
(3)提示：培养基中营养物质和溶氧量是有限的，此时，酵母菌种群数量已经达到了环境容纳量，种群密度达到稳定。
第1课时 微生物的基本培养技术
互动·探究·智涂
探究点一
【师问导学】
1．(1)葡萄糖 尿素 牛肉膏、蛋白胨 不提供 凝固剂
(2)水 碳源 氮源 无机盐 微生物细胞的化学组成与其他生物的大体相同，也是由C、H、O、N、P、S以及其他元素组成，其中C、H、O、N占细胞干重的90%以上，这些元素最终来自外界环境中的各种无机化合物和有机化合物。这些化合物可以归纳成碳源、氮源、水、无机盐四大类。所以，虽然培养不同微生物的具体培养基配方不同，但一般都要有这四类物质
(3)pH 特殊营养物质 O2
2．提示：能利用无机碳源的微生物的同化作用类型是自养型微生物。
3．提示：牛肉膏、蛋白胨能够提供碳源、氮源、维生素(生长因子)和无机盐。
4．提示：在科研和生产上，研究和应用微生物的前提是防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物。在实验室中培养微生物，一方面要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件，另一方面要确保其他微生物无法混入。
【检测反馈】
1．解析：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板，其顺序不能颠倒，A错误；牛肉膏比较黏稠，所以称好后需将称量纸一同放入烧杯中加热，当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸，B正确；待培养基冷却至50 ℃左右，开始倒平板，C正确；培养基冷却凝固后需将平板倒置，D正确。
答案：A
2．解析：(1)细菌培养时常用牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏能提供碳源、氮源、磷酸盐、维生素，蛋白胨能提供碳源、氮源、维生素，而葡萄糖不能提供氮源，NaNO3不能为微生物提供碳源。不同细菌生长繁殖所需要的最适pH是不同的，应该根据培养细菌的不同来调节培养基的pH。硝化细菌是化能自养型细菌，可以空气中的CO2为碳源，因此在没有碳源的培养基上能够生长。(2)用平板培养细菌时，一般需将平板倒置，这样可以防止皿盖上的水珠落入培养基。(3)不同种类的细菌所形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一定的特征，不同种细菌在一定培养条件下表现出各自稳定的菌落特征，可以作为菌种鉴定的重要依据。(4)使用后的培养基在丢弃前需进行灭菌处理，以免污染环境。
答案：(1)蛋白胨 不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同 能够 硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源
(2)倒置
(3)在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
(4)灭菌
探究点二
【师问导学】
1．提示：无菌技术还能有效避免操作者被微生物感染。
2．提示：用于生物消毒的微生物能产生杀死其他微生物的代谢产物或是寄生性的微生物。
3．(1)提示：都是使微生物的蛋白质变性，借此杀死微生物。
(2)提示：灭菌可杀死处理材料中的全部微生物(包括芽孢和孢子)，而消毒仅杀死部分微生物(一般不包括芽孢和孢子)。
(3)提示：不是，无菌技术既要考虑效果，又要考虑操作对象的承受能力。例如，活体生物材料、操作者的手等只能消毒，而不能灭菌。
(4)④ ⑥⑧ ①③⑤⑦⑨ ②
(5)提示：酒精擦拭属于消毒，酒精消毒时，70%的酒精杀菌效果最好。浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜，酒精分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌能力减弱。
【检测反馈】
1．解析：高温灭菌主要是使微生物的蛋白质等生物大分子发生不可逆转的变性。
答案：C
2．解析：消毒是指用温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物(不包括芽孢和孢子)，灭菌则是用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
答案：B
3．解析：(1)在实验室中，能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属材质的实验器具等可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。(2)巴氏消毒法或高温瞬时消毒法与煮沸消毒法相比，其优点表现为在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。(3)紫外线照射能消毒的原因是其能够破坏微生物细胞中的DNA分子。在利用紫外线照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可强化消毒效果。(4)自来水通常是采用氯气进行消毒的。(5)采用高压蒸汽灭菌时，若压力达到设定要求，而温度未达到相应要求，最可能的原因是没有排尽高压蒸汽灭菌锅内的冷空气。
答案：(1)可以 (2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少 (3)破坏DNA结构 消毒液 (4)氯气 (5)未将锅内冷空气排尽
探究点三
【师问导学】
1．提示：对瓶口进行灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
2．提示：培养基冷却凝固后，培养皿的皿盖上会凝结水珠，将培养皿倒置，可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。
3．提示：(1)接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。
(2)接种环蘸取菌液前后，要将试管口通过火焰。
(3)划线时将培养皿的皿盖打开一条缝隙，将蘸有菌种的接种环迅速伸入平板内，划线后及时盖上皿盖。
(4)每次划线结束后，灼烧接种环，冷却后再进行下一次划线。
(5)整个接种过程要在酒精灯火焰旁进行。
4．提示：划线末端含有的菌体数目较少，每次从上一次划线的末端开始划线能够使菌体的数目随划线次数的增加而逐渐减少，最终分散成单个的菌体。
5．提示：划线前灼烧是为了杀死上次划线结束后残留的菌种。划线结束后灼烧，能及时杀死接种环或接种针上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。
6．提示：培养未接种培养基的作用是对照，未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的。若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染了，需要重新制备。
【检测反馈】
1．解析：由图可知，①是倒平板，②是用接种环蘸取菌液，③是进行平板划线，④是培养。①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行，防止被杂菌污染，A正确；倒完平板后应立即盖上培养皿，冷却后将平板倒过来放置，B错误；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落，C正确；划线接种结束后，将平板倒置后放入培养箱中培养，可以避免培养基中的水分过快地挥发和防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，D正确。
答案：B
2．解析：(1)图甲和图乙分别是利用平板划线法和稀释涂布平板法进行微生物接种的，这两种方法所用的接种工具分别是接种环和涂布器。(2)平板划线时，每次划线前都要从上一次划线的末端开始，最后一次划线不能与第一次划线相连。(3)在酒精灯火焰附近存在着无菌区域，因此接种常在火焰附近进行。(4)培养基上的菌落分布均匀，接种方法为稀释涂布平板法。(5)采用稀释涂布平板法进行菌种分离时，稀释度要足够高，否则会使微生物不能分散成单个细胞。
答案：(1)平板划线 稀释涂布平板 接种环 涂布器 灼烧灭菌 (2)上一次划线的末端 相连(或相接、相交、交叉等) (3)酒精灯火焰附近存在着无菌区域 (4)图乙 (5)稀释倍数不够，菌液的浓度太高
随堂·巩固·达标
1．解析：培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，此外还应考虑pH、特殊营养物质及O2等条件。
答案：C
2．解析：干热灭菌是将灭菌物品放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃下加热2～3 h，适用于耐高温且需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等；灼烧灭菌是利用酒精灯火焰的充分燃烧层灭菌，如接种针、接种环等；高压蒸汽灭菌是用高压蒸汽灭菌锅，一般在压力为100 kPa、温度为121 ℃的条件下，维持15～30 min，主要用于培养基灭菌；紫外线照射适用于物体表面灭菌和空气灭菌，如接种室、接种箱、超净工作台等，使用前用紫外线照射约30 min。
答案：B
3．解析：接种环在平板上划线的位置并不是随机的：将蘸有菌种的接种环伸入平板内，划三至五条平行线后应盖上皿盖，并灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线，重复以上操作，在三、四、五区域内划线。
答案：B
4．解析：接种室、接种箱等常用紫外线消毒法处理，接种环等常用灼烧灭菌法处理，吸管、培养皿等常用干热灭菌法处理，培养基及多种器材用高压蒸汽灭菌法处理，A错误；为了防止杂菌污染，每次接种前后，接种环都要进行灼烧灭菌，B正确；接种后，培养皿需要倒置，以防皿盖上水珠落入培养基造成污染，C正确；分离菌种可以用平板划线法和稀释涂布平板法，后者还可以用于微生物的计数，所用培养基为固体培养基，D正确。
答案：A
5．解析：(1)培养基中都应含有水、无机盐、碳源和氮源。培养基配制完成后要调pH和灭菌。牛肉膏、蛋白胨中含碳元素，可作为有机碳源。(2)配制培养基时，除考虑营养条件外，还要考虑温度、酸碱度和渗透压等条件。(3)灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，所以要对培养基和培养皿进行灭菌。消毒是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物，故操作者的双手需要进行清洗和消毒。紫外线能使蛋白质变性，还能损伤DNA的结构。(4)分离纯化微生物常采用平板划线法和稀释涂布平板法。(5)培养微生物时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生。
答案：(1)氮源 牛肉膏和蛋白胨 灭菌 (2)温度 酸碱度 (3)灭菌 消毒 变性 (4)平板划线法 稀释涂布平板法 (5)将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生
成分
KH2PO4
Na2HPO4
MgSO4·7H2O
葡萄糖
尿素
琼脂
含量/g
1.4
2.1
0.2
10.0
1.0
15.0
将上述物质溶解后，加蒸馏水定容至1 000 mL
成分
牛肉膏
蛋白胨
NaCl
含量/g
5.0
10.0
5.0
将上述物质溶解后，添加蒸馏水，定容至1 000 mL，调节pH为7.0～7.2，并加入15～20 g琼脂
营养
物质
作用
功能
主要来源
碳源
能为微生物的代谢提供碳元素
构成生物体的细胞物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质
无机碳源：CO2、NaHCO3等；有机碳源：糖类、脂质、蛋白质、有机酸等
氮源
能为微生物的代谢提供氮元素
合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物
无机化合物：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等；有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
水
是生命活动所必需的
不仅是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定
外界摄入
无机盐
为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素
细胞内的组成成分，生理调节物质，某些化能自养菌的能源，酶的激活剂
无机化合物
微生物
碳源
氮源
能源
蓝细菌
CO2
NHeq \\al(＋,4)、NOeq \\al(－,3)等
光能
硝化细菌
CO2
NH3
NH3的氧化
根瘤菌
糖类等有机物
N2
有机物
大肠杆菌
糖类、蛋白质
等有机物
蛋白质等
有机物
灭菌和消毒的种类
主要方法
应用范围
灭
菌
湿热灭菌(高压蒸汽灭菌法)
100 kPa、121 ℃维持15～30 min
培养基及多种器材、物品
干热灭菌
干热灭菌箱160～170 ℃加热2～3 h
玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品
灼烧灭菌
酒精灯火焰灼烧
微生物接种工具，如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中的试管口或瓶口等
消毒
煮沸消毒法
100℃煮沸5～6 min
家庭餐具等生活用品
巴氏消毒法
62～65 ℃煮30 min或80～90 ℃煮30 s～1 min
牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体
紫外线消毒
30 W紫外灯照射30 min
接种室空气
化学药物消毒
用体积分数为70%～75%的乙醇、碘酒涂抹，来苏尔喷洒等
皮肤、伤口、动植物组织表面和空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等
项目
优点
缺点
平板划线法
可以观察菌落特征，对混合菌进行分离
不能计数
稀释涂布平板法
可以计数，可以观察菌落特征
吸收量较小，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
组分
牛肉膏
蛋白胨
NaCl
琼脂
水
用量
5 g
10 g
5 g
20 g
1 000 mL