高考生物二轮复习核心考点冲刺专题16《基因工程与细胞工程》（含详解）

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专题十六：基因工程与细胞工程之核心考点
[重温考纲]　1.基因工程的诞生(Ⅰ)。2.基因工程的原理及技术(含PCR)(Ⅱ)。3.基因工程的应用(Ⅱ)。4.蛋白质工程(Ⅰ)。5.植物的组织培养(Ⅱ)。6.动物细胞培养与体细胞克隆(Ⅱ)。7.细胞融合与单克隆抗体(Ⅱ)。



核心考点1　基因工程与蛋白质工程
一、要点整合
1．掌握基因工程的3种基本工具
(1)限制性核酸内切酶：识别特定核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子。
(2)DNA连接酶：①E·coli DNA连接酶只能连接黏性末端；②T4 DNA连接酶能连接黏性末端和平末端。
(3)载体：①能在宿主细胞内稳定存在并大量复制；②有一个至多个限制酶切割位点；③具有特殊的标记基因——以便对含目的基因的受体细胞进行筛选。
提醒　(1)限制酶≠DNA酶≠解旋酶
限制酶是切割某种特定的脱氧核苷酸序列，并使两条链在特定的位置断开；DNA酶是将DNA水解为基本组成单位；解旋酶是将DNA的两条链间的氢键打开形成两条单链。
(2)使用限制酶的注意点
①一般用同种限制酶切割载体和目的基因。
②不同的限制酶也能切割出相同的黏性末端。
(3)DNA连接酶≠DNA聚合酶
DNA连接酶连接两个DNA片段，而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上。
2．理清基因工程的操作流程
(1)获取目的基因的3种途径
①从基因文库中获取。
②利用PCR技术扩增。
③化学方法人工合成。
提醒　(1)PCR技术扩增
①原理：DNA双链复制。
②条件：模板DNA、引物、脱氧核苷酸、热稳定性DNA聚合酶。
③过程、
(2)化学方法人工合成
已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。
(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建
①基因表达载体的组成

②构建过程

提醒　(1)基因工程中的载体与细胞膜上的载体不同。
(2)启动子、终止子
①启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)。
②终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA上)。
(3)目的基因插入位置：启动子与终止子之间。
(3)根据受体种类确定基因工程的受体细胞
①植物：植物体细胞或受精卵——导入方法常用农杆菌转化法、花粉管通道法、基因枪法(本法针对单子叶植物)
②动物：受精卵或体细胞——导入方法为“显微注射法”
③微生物：细菌——导入方法为“感受态法”
(4)目的基因的检测与鉴定的方法
①检测目的基因是否导入受体细胞：DNA分子杂交技术。
②检测目的基因是否转录出mRNA：分子杂交技术。
③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原—抗体杂交技术。
④个体生物学水平鉴定：根据表达性状判断。
3．理清蛋白质工程

二、考向设计
1．(全国Ⅰ，38)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用__________作为载体，其原因是_________________________________________。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_______
____________________________________________________________(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
【答案】　(1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A　(2)噬菌体　噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕　(3)繁殖快、容易培养　(4)蛋白A的抗体　(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体

2．(全国Ⅱ，38)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是_________________________________________________________。
提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是________________________________。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是_______________________________________________________________________
________________________________________________________________(答出两点即可)。
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是___________。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是___________________________________________
________________________________________________________________________。
【答案】(1)嫩叶中基因表达强烈，相应的mRNA多(或嫩叶组织细胞易破碎)　防止提取的mRNA被RNA酶降解
(2)在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对原则合成cDNA　(3)质粒载体中有启动子、终止子，便于目的基因的表达；质粒载体中有标记基因便于筛选；质粒载体中含有复制原点等　(4)磷酸二酯键
(5)几丁质酶基因没有转录或转录的mRNA没有翻译
【解析】(1)由于嫩叶中几丁质酶转录的mRNA较多，因此在进行基因工程操作时，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止提取的mRNA被RNA酶降解。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，原理是mRNA可根据碱基互补配对原则逆转录合成cDNA。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是：质粒载体中有启动子、终止子，便于目的基因的表达；质粒载体中有标记基因便于筛选；质粒载体中含有复制原点等。
(4)DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。
(5)基因表达包括转录和翻译两个步骤，若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，其可能的原因是几丁质酶基因没有转录或转录的mRNA没有翻译。
3．(2015·全国Ⅱ，40)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因，所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：___________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过_______
和____________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得目的基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。
【答案】(1)氨基酸序列(或结构)(其他答案合理也可)
(2)P　P1　DNA和RNA(或遗传物质)　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)
(3)设计蛋白质的结构　推测氨基酸序列　功能

4．(泰安二模)研究人员欲对拟芥兰叶片中某种蛋白质进行改造，使其能结合空气中微量的黄色炸药挥发分子，导致叶片产生特定颜色变化，从而有助于检测公共场所是否存在爆炸物。请回答下列问题：
(1)科研人员从上述预期蛋白质的功能出发，设计________结构，然后推测相应目的基因的________序列，最终人工合成目的基因。
(2)将目的基因导入拟芥兰细胞通常采用____________的方法。首先将目的基因插入到Ti质粒的________上，并最终整合到拟芥兰细胞染色体的DNA上。
(3)在________和人工控制的条件下，将上述拟芥兰细胞培养在人工配制的培养基上，诱导其产生________，最终形成转基因植株。该过程的原理是__________________________________。
(4)在转基因植株附近放置________________，从个体生物学水平鉴定出目的基因成功表达的转基因植株。
【答案】(1)蛋白质　脱氧核苷酸(或碱基)　(2)农杆菌转化　T—DNA　(3)无菌　愈伤组织　植物细胞的全能性　(4)黄色炸药

5．(邯郸二模)科学家利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了光合作用过程中Rubisco酶对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合作用速率，请回答下列问题：
(1)PCR过程所依据的原理是______________，该过程需要加入的酶是__________________。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成________。
(2)该技术不直接改造Rubisco酶，而是通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是____________________________________________。和传统基因工程技术相比较，定点突变技术最突出的优点是________________________________________，PCR定点突变技术属于____________的范畴。
(3)可利用定点突变的DNA构建基因表达载体。常用______________将基因表达载体导入植物细胞，将该细胞经植物组织培养技术培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是__________________。
【答案】(1)DNA双链复制　热稳定性DNA聚合酶(或Taq酶)　引物　(2)蛋白质空间结构较为复杂，改造困难　能生产出自然界不存在的蛋白质　蛋白质工程
(3)农杆菌转化法　植物细胞的全能性
【解析】(1)PCR过程所依据的原理是DNA双链复制，该过程需要加入的酶是热稳定性DNA聚合酶。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
(2)该技术不直接改造Rubisco酶，而是通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是蛋白质空间结构较为复杂，改造困难。和传统基因工程技术相比较，定点突变最突出的优点是获得的产物一般是自然界中不存在的蛋白质，PCR定点突变技术属于蛋白质工程的范畴。
(3)可利用定点突变的DNA构建基因表达载体，常用农杆菌转化法将基因表达载体导入植物细胞，将该细胞经植物组织培养技术培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是植物细胞的全能性。
核心考点2　细胞工程
一、要点整合
1．明确细胞工程技术的原理
(1)植物组织培养：细胞的全能性。
(2)植物体细胞杂交：细胞的全能性、细胞膜的流动性。
(3)动物细胞培养：细胞的增殖。
(4)体细胞核移植：动物细胞核的全能性。
(5)单克隆抗体的制备：细胞膜的流动性，细胞的增殖。
(6)动物细胞融合：细胞膜的流动性。
2．理清植物组织培养的流程

提醒　(1)条件：无菌、离体。
(2)培养基组成：无机营养、有机营养、激素、琼脂。
(3)植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。
(4)植物组织培养的目的不同，培养阶段也就不同：
①若生产人工种子，则培养到胚状体阶段。
②若提取细胞产品，则一般培养到愈伤组织阶段。
③若培育新个体，则应培养到试管苗阶段。
3．理清植物体细胞杂交技术
(1)酶解方法：用纤维素酶和果胶酶处理。
(2)促融方法：①物理法：离心、振动、电激等；
②化学法：聚乙二醇(PEG)。
(3)植物体细胞杂交即将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的过程，不管是染色体数、基因型还是染色体组数都采用直接相加的方法。
4．理清动物细胞培养流程

提醒　(1)动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同：
第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞。
第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。
(2)传代细胞的特点
传代培养到10代以内的细胞核型稳定，10～50代时部分细胞核型发生变化，50代以后遗传物质可能发生变化。
(3)原代培养与传代培养的区别
区分原代培养和传代培养的关键是是否分瓶培养。贴壁生长到一定程度需要用胰蛋白酶处理，然后再分瓶培养，原代培养结束，开始传代培养。
(4)动物细胞培养的条件
①无菌、无毒的环境；②特殊营养：血清、血浆；③适宜的温度和pH；④气体环境：含95%空气加5%CO2的混合气体。
5．理清动物体细胞核移植

提醒　(1)选择受体细胞为去核卵母细胞的原因
①营养丰富；②体积大，易操作；③含有激发细胞核全能性表达的物质。
(2)核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：
①克隆动物遗传物质来自两个亲本。
②发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。
③外界环境可能引起不遗传的变异。
6．关注制备单克隆抗体常考点
(1)3种细胞特点不同
①免疫后的B淋巴细胞：能分泌抗体，不能大量增殖。
②骨髓瘤细胞：能大量增殖，不能分泌抗体。
③杂交瘤细胞：既能分泌抗体，又能大量增殖。
(2)2次筛选目的不同
第一次筛选：利用特定选择培养基筛选，获得杂交瘤细胞，即AB型细胞(A为B淋巴细胞，B为骨髓瘤细胞)，该细胞既能分泌抗体又能大量增殖，筛选掉A、B、AA、BB型细胞。
第二次筛选：利用多孔板法和抗原—抗体杂交法筛选，获得产生特异性抗体的杂交瘤细胞。
二、考向设计
1．(广州市二模)研究人员利用植物组织培养技术，通过图一所示的流程进行育种实验，培育出具有耐盐性的植株。

回答下列问题：
(1)图一所示的实验流程中，再分化发生在________(填“①”“②”“③”或“④”)过程；用γ射线照射愈伤组织的目的是________________。实验过程应注意无菌操作，对所用的培养基要进行________处理，对外植体进行________处理。
(2)将经γ射线照射和不经照射处理的愈伤组织，分别转移到含不同浓度NaCl的分化培养基中培养，愈伤组织再分化出幼苗的比例如图二所示，据图分析：
Ⅰ.本实验的两个自变量分别是____________________。用剂量为10 Gy的γ射线照射愈伤组织后，获得耐盐性幼苗的比例________(填“升高”“不变”或“降低”)。
Ⅱ.通过本实验________(填“能”或“不能”)确定在分化培养基中NaCl浓度大于1.0%时，不经γ射线照射的愈伤组织不能分化出幼苗。判断的理由是_____________________________
________________________________。
【答案】(1)④　诱发其基因突变(提高突变率)　灭菌　消毒　(2)Ⅰ.NaCl浓度、是否照射γ射线　升高　Ⅱ.不能　未获取NaCl浓度为1.0%～1.5%的实验数据，因此不能确定
2．(2013·全国Ⅱ，40)甲、乙是染色体数目相同的两种二倍体药用植物，甲含有效成分A，乙含有效成分B。某研究小组拟培育同时含有A和B的新型药用植物。
回答下列问题：
(1)为了培育该新型药用植物，可取甲和乙的叶片，先用________酶和________酶去除细胞壁，获得具有活力的________，再用化学诱导剂诱导二者融合。形成的融合细胞进一步培养形成________组织，然后经过________形成完整的杂种植株。这种培育技术称为______________。
(2)上述杂种植株属于多倍体，多倍体是指__________________________________________。假设甲与乙有性杂交的后代是不育的，而上述杂种植株是可育的，造成这种差异的原因是________________________________________________________________________。
(3)这种杂种植株可通过制作人工种子的方法来大量繁殖。经植物组织培养得到的_________等材料用人工薄膜包装后可得到人工种子。
【答案】　(1)纤维素　果胶　原生质体　愈伤　再分化(分化)　植物体细胞杂交技术　(2)体细胞中含有三个或三个以上染色体组的个体　在减数分裂过程中，前者染色体联会异常，而后者染色体联会正常　(3)胚状体、不定芽、顶芽、腋芽

3．(钦州二模)回答下列关于现代生物科技的问题：
(1)动物细胞培养时为了将组织分散成单个细胞，常用____________处理剪碎的组织块，并用培养液将细胞稀释制成____________。
(2)动物细胞培养时需要通入5%的CO2，其目的是__________________，为了防止杂菌污染，通常要在培养基中添加________。
(3)动物细胞核移植时普遍使用的去核方法是______________；常选用处于________(时期)的卵母细胞作为受体细胞，主要是因为卵细胞大，易操作，含有促进______________表达的相关物质。
【答案】　(1)胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)　细胞悬液　(2)维持培养基的pH　抗生素　(3)显微操作去核法　MⅡ中期(减数第二次分裂中期)　细胞核全能性
【解析】　动物细胞培养的过程：取动物组织块→剪碎组织→用胰蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养液中(原代培养)→放入二氧化碳培养箱培养→贴满瓶壁的细胞用酶分散为单个细胞，制成细胞悬液→转入培养液(传代培养)→放入二氧化碳培养箱培养。动物细胞培养需要满足以下条件：①无菌、无毒的环境；②营养；③温度和pH；④气体环境：95%空气＋5%CO2。
(1)动物细胞培养过程中，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理剪碎的组织块，可以将组织分散成单个细胞，并用培养液将细胞稀释制成细胞悬液。
(2)动物细胞培养时需要通入5%的CO2，其目的是为了维持培养基的pH；培养基中加入抗生素的目的是防止杂菌污染。
(3)动物细胞核移植时常用显微操作去核法去除细胞核，并选用处于MⅡ中期的卵母细胞作为受体细胞，主要是因为卵细胞大，易操作，且含有促进细胞核全能性表达的相关物质。
4．(全国Ⅲ，38)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。

回答下列问题：
(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是___________________________________________________________。
(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为________，加入了______________________作为合成DNA的原料。
(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。
①由图2可知：当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是___________________________________。
细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是__________________。
②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少________(填“A” “B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
【答案】　(1)编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子　(2)模板　四种游离的脱氧核苷酸　(3)①进行细胞传代培养　维持培养箱中的pH ②C
【解析】　(1)因为编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子，因此所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙。
(2)PCR技术扩增目的基因的条件需要：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定性DNA聚合酶(Taq 酶)。序列甲作为模板DNA，合成DNA的原料为四种游离的脱氧核苷酸。
(3)①动物细胞可以通过细胞培养(传代培养)继续增殖。细胞培养过程中，需要气体环境，其中CO2气体的作用是维持培养箱中的pH。②分析坐标图：对比甲和乙蛋白刺激T淋巴细胞增殖情况发现：最终效果相当，只是增殖时间不同，可以推断出A、E片段编码的肽段不会降低T淋巴细胞增殖效果。将丙蛋白分别与甲和乙蛋白刺激T淋巴细胞增殖情况比较发现：丙蛋白促进T淋巴细胞增殖的作用很弱。丙序列与甲和乙序列相比较，缺少了C片段，也就是说若缺少C片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
5．(揭阳市二模)癌胚抗原(CEA)是某些癌细胞表面产生的一种糖蛋白，临床上通过制备CEA的单克隆抗体来诊断癌症。回答下列问题：
(1)一般不直接用单个的B淋巴细胞培养形成细胞群的办法来生产单克隆抗体。原因是______
________________________________________________________________________。
(2)制备CEA的单克隆抗体时，给小鼠注射的CEA相当于________，能使小鼠产生免疫反应。
(3)杂交瘤细胞的扩大培养，既可在体外培养，也可注射到小鼠________内培养。体内培养与体外培养相比，其优点是________________________________________________。
(4)已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。小鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得融合细胞(一般只考虑细胞两两融合)，并生产单克隆抗体。请回答下列问题：
①试管中除融合的杂种细胞外，还有________种融合细胞。
②设计一方法(不考虑机械方法)，从培养液中分离出杂种细胞，并说原理。
方法：用______________的培养液培养经融合诱导后的细胞，收集能增殖的细胞。
原理：________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
【答案】　(1)B淋巴细胞不能无限增殖　(2)抗原　(3)腹腔　无需提供营养物质以及无菌环境，操作简便　(4)①2
②添加氨基嘌呤　加入氨基嘌呤后，使D合成途径阻断，仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及彼此融合的骨髓瘤细胞就不能增殖，(B淋巴细胞及彼此融合的B淋巴细胞也不能增殖，)但B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞中可以利用B淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖
【解析】 (1)由于B淋巴细胞不能无限增殖，因此一般不直接用单个的B淋巴细胞培养形成细胞群的办法来生产单克隆抗体。
(2)制备CEA的单克隆抗体时，给小鼠注射的CEA相当于抗原，能使小鼠产生免疫反应。
(3)杂交瘤细胞的扩大培养，既可在体外培养，也可注射到小鼠腹腔内培养。与体外培养相比，体内培养的优点是无需提供营养物质以及无菌环境，操作简便。
(4)①试管中除融合的杂种细胞外，还有2种融合细胞，即骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合、B淋巴细胞与B淋巴细胞融合。
②依题意可知：加入氨基嘌呤后，使合成DNA的D途径被阻断，仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的骨髓瘤细胞就不能增殖，(B淋巴细胞及彼此融合的B淋巴细胞也不能增殖，)但在B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞中可以利用B淋巴细胞中的S途径合成DNA而进行增殖。依据上述原理，欲从培养液中分离出杂种细胞，其方法为：用添加氨基嘌呤的培养液培养经融合诱导后的细胞，收集能增殖的细胞。
专题强化练
1．(湛江二模)番茄果实中含丰富的番茄红素，对人体防治肿瘤、心血管疾病以及延缓衰老具有一定作用。请回答下列问题：
(1)科学家为构建高产番茄红素的酵母细胞应用了转基因技术，其核心步骤是__________。下图是其部分模式图，位点1、2、3、4对应的限制酶分别是PacⅠ、SexAⅠ、AscⅠ、 PmeⅠ，则获取目的基因使用的限制酶是________；PacⅠ能否切割位点2？________；为什么？__________________________________________。

(2)为确定目的基因已导入番茄细胞中，常用______________技术进行检测，最后再进行个体水平的鉴定。
(3)科学家运用____________________技术培育出了“番茄—马铃薯”杂种植株，但并没有获得预期的性状，主要原因是_________________________________________________。
(4)转基因技术和植物体细胞杂交技术在育种上具有的共同意义是____________________。
【答案】　(1)构建基因表达载体(目的基因与载体结合)　SexAⅠ和AscⅠ　不能　因为限制酶具有特异性(合理即可)　(2)DNA分子杂交　(3)植物体细胞杂交　基因的表达不是孤立的，是相互调控、相互影响的(合理即可)
(4)能克服物种间远缘杂交不亲和障碍(合理即可)

2．科学家将鱼抗冻蛋白基因转入番茄，使番茄的耐寒能力大大提高，可以在相对寒冷的环境中生长。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、HindⅢ、AluⅠ等四种限制性核酸内切酶切割位点，如图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图(ampr为抗氨苄青霉素基因)，其中①～④是转基因抗冻番茄培育过程中的相关步骤，Ⅰ、Ⅱ表示相关结构或细胞。请据图作答：

(1)在构建重组DNA时，可用一种或多种限制性核酸内切酶进行切割，为了避免目的基因和载体在酶切后产生的末端发生任意连接，在此实验中应该选用限制性核酸内切酶________________分别对____________________和________进行切割，切割后产生的DNA片段分别为________种和________种。
(2)培养基中的氨苄青霉素会抑制番茄愈伤组织细胞的生长，要利用该培养基筛选已导入鱼的抗冻蛋白基因的番茄细胞，应使Ⅰ重组DNA中含有________________作为标记基因。
(3)研究人员通常采用____________法将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞内。
【答案】　(1)PstⅠ、SmaⅠ　含鱼抗冻蛋白基因的DNA　质粒　4　2　(2)抗氨苄青霉素基因　(3)农杆菌转化

3．(石家庄二质检)苏云金芽孢杆菌产生的Bt毒蛋白在害虫的消化道内能被降解成有毒的多肽，最终造成害虫死亡，因此Bt基因广泛应用于培育转基因抗虫植物。回答下列问题：
(1)培育转基因抗虫棉所需的目的基因来自________________的基因组，再通过PCR技术扩增。PCR反应中温度呈现周期性变化，其中加热到90～95 ℃的目的是____________，然后冷却到55～60 ℃使引物与互补DNA链结合，继续加热到70～75 ℃，目的是_______________
___________________________________________________________________________。
(2)限制酶主要是从________中获得，其特点是能够识别DNA分子某种__________________，并在特定位点切割DNA。
(3)科研人员培育某品种转基因抗虫棉的过程中，发现植株并未表现抗虫性状。可能的原因是________________________________。
(4)在基因表达载体中，目的基因的首端和尾端必须含有________这样目的基因才能准确表达。
【答案】　(1)苏云金芽孢杆菌　DNA解链(或DNA受热变性后解链为单链)　Taq酶从引物起始进行互补链的合成　(2)原核生物　特定的核苷酸序列　(3)所转的基因未成功导入，也可能导入的基因未能准确表达　(4)启动子和终止子
【解析】　(1)培育转基因抗虫棉所需的目的基因来自苏云金芽孢杆菌的基因组。PCR反应中加热到90～95 ℃的目的是使DNA解链(或DNA受热变性后解链为单链)。冷却后继续加热到70～75 ℃，目的是在DNA聚合酶的作用下从引物开始延伸子链(Taq酶从引物起始进行互补链的合成)。
(2)限制酶主要是从原核生物中获得，其特点是能够识别DNA分子某种特定的核苷酸序列，并在特定位点切割DNA。
(3)科研人员培育某品种转基因抗虫棉的过程中，发现植株并未表现抗虫性状。可能的原因是所转的基因未成功导入，也可能是导入的基因未能准确表达。
(4)在基因表达载体中，目的基因的首端和尾端必须含有启动子和终止子，这样目的基因才能准确表达。
4．(深圳一调研)根据基因工程的有关知识回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增目的基因时，需要加入两种引物，原因是__________________________，引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异的复制________________的DNA序列，一个DNA分子经过三轮复制以后，含有两种引物的DNA分子有________个。
(2)基因工程的核心步骤是________________。其目的是使目的基因在受体细胞中_________，并可遗传给下一代。
(3)大肠杆菌作为受体细胞最常用的转化方法是：首先用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为________细胞。
(4)检测目的基因是否发挥功能作用的第一步是____________________。
【答案】　(1)DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增　处于两个引物之间　6　(2)构建基因表达载体　稳定存在、表达和发挥作用　(3)感受态　(4)目的基因是否能转录形成mRNA(DNA—RNA分子杂交)

5．(绵阳市二模)请回答下列有关动物细胞培养的问题：
(1)在动物细胞培养中，通常在合成培养基中加入一定量的抗生素，其目的是____________。
(2)在使用合成培养基时，通常需要加入血清等一些天然成分，作用是_____________________
________________________________________________________________________。
(3)在动物细胞培养时，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面相互接触时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的________，因此要定期用________处理细胞，使贴壁生长的细胞脱落形成细胞悬浮液，否则，贴壁细胞分裂生长到相互接触时，细胞会停止分裂增殖。
(4)在细胞培养过程中，通常在________条件下保存细胞。
(5)若在营养全面的动物细胞培养液中不慎混入了一种细菌，结果所培养的细胞全部死亡。从科学严谨性的角度考虑，能不能直接认为这些细胞的死亡就是该种细菌作用而导致的？____，理由是_________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
【答案】　(1)防止细菌污染　(2)补充培养基中缺乏的物质
(3)接触抑制　胰蛋白酶　(4)冷冻(或超低温、液氮)
(5)不能　也可能是环境中其他因素或操作错误或取材不当导致了细胞的死亡

6．(邯郸一模)2016年5月13日，美国国家卫生院科学家发表报告，他们在艾滋病病毒上发现一种由8个氨基酸组成的融合肽，它是病毒入侵细胞的关键性物质。这一发现为艾滋病的预防和治疗开辟了一条新途径。欲将融合肽设计为疫苗进行免疫预防，可能需要改造其部分结构。请回答下列问题：
(1)一般流程是：预期新型融合肽的功能→设计新型融合肽结构→推测________________→找到对应的脱氧核苷酸序列。然后用______________(答一种仪器)合成目的基因。要获得大量的目的基因，需要用________扩增。该技术的前提是要有________________________序列，以便根据这一序列合成引物。
(2)欲用牛乳腺生物反应器大量生产新型融合肽，在构建基因表达载体时，需要加入________________启动子，通常选用________作为受体细胞。
(3)欲大量生产融合肽抗体用于免疫治疗，可将融合肽反复多次注入小鼠体内，从小鼠脾脏提取________细胞，将其与小鼠骨髓瘤细胞融合，并在特定的培养基上筛选出杂交瘤细胞，再通过____________________________，筛选出能产生融合肽抗体的杂交瘤细胞，在小鼠腹腔或体外扩大培养，获得大量融合肽抗体。
【答案】　(1)应有的氨基酸序列　DNA合成仪　PCR　一段已知目的基因的核苷酸　(2)牛乳腺蛋白基因　受精卵　(3)B淋巴　(多次)克隆化培养和(专一)抗体(阳性)检测
【解析】(1)蛋白质工程的一般流程：预期新型融合肽的功能→设计新型融合肽结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列。如果目的基因中核苷酸序列已知且数量较少，可以用DNA合成仪合成目的基因。要获得大量的目的基因，需要用PCR技术扩增。该技术的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
(2)为了在转基因牛的乳汁中提取到新型融合肽，需要在新合成的目的基因之前加入牛乳腺蛋白基因的启动子，确保新型融合肽在乳腺细胞内表达并随乳汁分泌出来。这一过程的受体细胞通常选受精卵。
(3)欲大量生产融合肽抗体用于免疫治疗，可将融合肽反复多次注入小鼠体内，从小鼠脾脏提取B淋巴细胞，将其与小鼠骨髓瘤细胞融合，并在特定的培养基上筛选出杂交瘤细胞，再通过(多次)克隆化培养和(专一)抗体(阳性)检测，筛选出能产生融合肽抗体的杂交瘤细胞，在小鼠腹腔或体外扩大培养，获得大量融合肽抗体。
7．(汕头一模)青蒿素主要从青蒿植株的地上部分提取而来，是最有效的抗疟药之一，最新研究表明，青蒿素还可用于糖尿病的治疗。研究人员利用基因工程培育出高产的转基因青蒿。回答下列问题：
(1)青蒿的cDNA文库，是以从青蒿细胞中提取的________为模板，通过________(方法)建立起来的。青蒿的cDNA文库含有青蒿基因组中的全部基因吗？________。
(2)研究人员从青蒿的cDNA文库中获取了合成青蒿素所需的两种关键酶的基因。在对这两个目的基因分别进行PCR扩增时，向反应体系中加入的物质中，除了模板不同以外，________也肯定不同。
(3)构建表达载体时，应在目的基因的首端和尾端分别安插上________和终止子，使目的基因能够________。构建好的目的基因表达载体一般通过________法而导入到青蒿细胞中，最终获得转基因植株。
(4)有人另辟蹊径，成功培育出能生产青蒿素的转基因酵母菌。试指出利用转基因酵母菌生产青蒿素的两点优势：______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
【答案】　(1)mRNA　逆转录　不含有　(2)引物　(3)启动子　转录(或表达)　农杆菌转化　(4)酵母菌繁殖快、易培养、成本低可以工业化生产；生产不受季节、气候、地域限制