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高中生物苏教版 (2019)选择性必修3 生物技术与工程第一节 发酵工程的培养基第1课时教学设计
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这是一份高中生物苏教版 (2019)选择性必修3 生物技术与工程第一节 发酵工程的培养基第1课时教学设计，共19页。
第一节 基因工程概述
第1课时 基因工程的发展历程和工具
1．简述基因工程的发展历程。
2．掌握限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用、特点。(重、难点)
3．掌握质粒的含义、特性及其在基因工程中的作用。(重、难点)
基 因 工 程 的 发 展 历 程 和 概 念
1．理论与技术基础的发展
1953年：沃森和克里克建立了DNA分子双螺旋结构模型。
↓
1957年：科恩伯格等首次发现DNA聚合酶。
↓
1958年：梅塞尔森和斯塔尔发现DNA半保留复制的机理。克里克提出中心法则。
↓
1961～1966年：尼伦伯格等破译遗传密码。
↓
1967年：罗思和赫林斯基发现运转工具质粒和DNA连接酶。
↓
1970年：特明和巴尔的摩各自在RNA病毒中发现逆转录酶。史密斯等人分离到限制性核酸内切酶。
↓
1977年：桑格首次完整基因组的测序工作。
2．重组DNA技术的发展
(1)1972年科学家伯格等实验。
①过程：
②成就：世界上首次DNA分子体外重组。
(2)1973年科学家科恩等实验。
重组DNA分子大肠杆菌―→子代大肠杆菌(双重抗性)
(3)不同物种间DNA重组实验。
①过程：非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段＋大肠杆菌质粒→重组DNA→转入大肠杆菌→转录出相应 mRNA。
②成就：打破了传统的种间遗传物质不能交换的重重壁垒，开创了基因工程。
3．基因工程的概念
方法
在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法
原理
对生物的基因进行改造和重新组合
操作水平
基因水平
目的
产生人类需要的基因产物
使大米拥有某些细菌才具有的抗虫基因能够减少化学杀虫剂的使用量，既高产又环保。
请你结合以上内容探究以下问题。
探讨：你知道拥有某些细菌抗虫基因的大米是通过何种技术培育出来的吗？
提示：基因工程。
探讨：通过分析基因工程的概念，讨论基因工程的原理是什么？与有性杂交育种有何区别？
提示：原理：基因重组。
区别：打破物种限制，实现不同物种间的基因交流。
探讨：将人的胰岛素基因导入大肠杆菌体内，通过大肠杆菌能大量生产人胰岛素。请分析人胰岛素基因能在大肠杆菌体内表达的理论基础是什么？
提示：生物共用一套遗传密码。
1．基因重组的三种主要类型
(1)交叉互换：减数第一次分裂四分体时期，同源染色体上的非姐妹染色单体间的交叉互换。
(2)自由组合：减数第一次分裂后期，非同源染色体上的非等位基因随着非同源染色体的自由组合而组合。
(3)基因工程：转基因生物因外源基因导入而获得的新性状是可以遗传的。
2．基因工程的理论基础
(1)拼接的基础：
①基本组成单位相同：不同生物的DNA分子都是由脱氧核苷酸构成的。
②空间结构相同：不同生物的DNA分子一般都是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链形成的规则的双螺旋结构。
③碱基配对方式相同：不同生物的DNA分子中两条链之间的碱基配对方式均是A与T配对，G与C配对。
(2)表达的基础：生物界共用一套遗传密码，相同的遗传信息在不同生物体内可表达出相同的蛋白质。
1．干扰素是治疗癌症的重要药物，它必须从血液中提取，每升人血中只能提取0.5 μg，所以价格昂贵。美国加利福尼亚的某生物制品公司用如下方法生产干扰素。如图所示，可以看出该公司生产干扰素运用的方法是( ) 【导学号：10210006】
A．个体间的杂交 B．基因工程
C．细胞融合 D．器官移植
【解析】 从图中可以看出整个过程为将人的淋巴细胞中控制干扰素合成的基因与质粒结合后导入酵母菌，并从酵母菌产物中提取干扰素，这项技术为基因工程。
【答案】 B
2．下列对基因工程的理解，正确的是( )
①它是一种按照人们的意愿，定向改造生物遗传特性的工程 ②可对基因随意进行人为改造 ③是体外进行的人为的基因重组 ④在实验室内，利用相关的酶和原料合成DNA ⑤主要技术为体外DNA重组技术和转基因技术 ⑥在DNA分子水平上进行操作
⑦一旦成功，便可遗传
A．①②③④⑤⑥ B．①③④⑤⑥⑦
C．①③⑤⑥⑦ D．①②③⑤⑥⑦
【解析】 基因工程可以对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物，而不是对基因进行人为改造。
【答案】 C
基 因 工 程 的 工 具——酶 与 载 体
1．限制性核酸内切酶(也称“限制酶”)
(1)来源：主要来自于原核生物。
(2)特点：具有专一性。
①识别双链DNA分子的某种特定的脱氧核苷酸序列。
②切割特定脱氧核苷酸序列中的特定位点。
(3)作用：断开每一条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
(4)结果：产生黏性末端或平口末端。
2．DNA连接酶——“分子针线”
(1)作用：将双链DNA片段“缝合”，恢复被限制性核酸内切酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
(2)结果：形成重组DNA分子。
3．载体——运载工具
(1)功能：将外源基因导入受体细胞。
(2)种类：质粒、λ噬菌体的衍生物以及一些动、植物病毒。
(3)质粒
①本质：来自于细菌细胞中的一种很小的环状DNA分子，是最早应用的载体。
②组成：最简单的质粒载体必须包括复制区、标记基因、目的基因插入位点。
我国科学家已成功将与植物花青素代谢有关的基因导入花卉植物矮牵牛中，转基因矮牵牛呈现出自然界没有的颜色变异，大大提高了花卉的观赏价值。请你依据以上材料探究以下问题：
探讨：科学家进行转基因技术操作时，需要用到哪些基本的工具？
提示：限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体。
探讨：结合DNA复制的过程分析，限制性核酸内切酶和DNA解旋酶的作用部位有何不同？
提示：限制性核酸内切酶作用于磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键，DNA解旋酶作用于碱基对之间的氢键。
探讨：下图所示过程是哪类酶作用的结果？该酶识别的碱基序列及切点是什么？这体现了该类酶具有什么特性？
提示：限制性核酸内切酶。识别的碱基序列为：GAATTC，切点在G和A之间。特异性。
探讨：质粒的化学本质是什么？来源于何类生物？
提示：化学本质：环状DNA分子。来源：细菌、酵母菌。
1．限制性核酸内切酶与DNA连接酶的比较
(1)区别：
作用
应用
限制性核酸内切酶
使特定部位的磷酸二酯键断开
用于提取目的基因和切割载体
DNA连接酶
在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键
用于基因表达载体的构建
(2)两者的关系可表示为：
2．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
项目
DNA连接酶
DNA聚合酶
相同点
催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键
不同点
模板
不需要模板
需要DNA的一条链为模板
作用对象
游离的DNA片段
单个的脱氧核苷酸
作用结果
形成完整的DNA分子
形成DNA的一条链
用途
基因工程
DNA复制
[特别提醒]
(1)不同DNA分子用同一种限制性核酸内切酶切割形成的黏性末端都相同；同一个DNA分子用不同的限制性核酸内切酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
(2)DNA连接酶无识别的特异性，DNA连接酶对于黏性末端或平口末端都能催化其“缝合”，重新形成DNA分子。
3．载体的作用、条件、种类及质粒的相关知识
作用
将外源基因送入受体细胞
条件
①能在宿主细胞内复制并稳定地保存
②具有多个限制性核酸内切酶切点
③具有某些标记基因
种类
常用的载体有质粒、λ噬菌体、动植物病毒
质粒
①质粒是最早应用的载体②结构：细菌细胞中的很小的环状DNA分子③特性：质粒的存在对宿主细胞无影响④重组质粒的形成：用同一种限制性核酸内切酶切割质粒和外源DNA分子，并通过DNA连接酶的连接，就能将质粒和外源DNA分子组成一个重组质粒(重组DNA分子)
[特别提醒]
(1)一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。
(2)常见的标记基因有抗生素抗性基因、产生特定颜色的表达产物基因、发光基因等。
(3)注意与细胞膜上载体的区别，两者的化学本质和作用都不相同。
(4)质粒能自我复制，既可在自身细胞、受体细胞内，也可在体外。
1．基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是( ) 【导学号：10210007】
A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达
C．具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件
D．能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选
【解析】 载体作为目的基因的运输工具，能将目的基因导入受体细胞。作为载体必须具备三个条件：①能够在宿主细胞中稳定地保存，并能够复制，以便提供大量的目的基因；②有一个至多个限制酶切割位点，便于与外源基因结合；③具有标记基因，便于进行检测和筛选。
【答案】 A
2．目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如下图所示。
(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于_______________________________________________________________。
(2) pBR322分子中有单个EcoR Ⅰ限制酶作用位点，EcoR Ⅰ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G和A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoR Ⅰ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoR Ⅰ切割后所形成的黏性末端：_______________________________________________。
(3)pBR322分子中另有单个的Bcom HⅠ限制酶作用位点，现将经Bam HⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶Bgl Ⅱ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复________键，成功获得了重组质粒，说明_______________________________________________
_______________________________________________。
(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)，与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是______________________________________________，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是
_______________________________________________。
【解析】 (1)质粒作为基因表达载体的条件之一是要有抗性基因，以便于鉴别目的基因是否导入受体细胞或筛选导入目的基因的受体细胞。
(2)同一限制酶切割DNA分子产生的黏性末端相同，根据题意可知：该目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端为：
目的基因
—G AATTC—……—G AATTC—
—CTTAA G—……—CTTAA G—
(3)DNA连接酶催化两个DNA片段形成磷酸二酯键；而通过DNA连接酶作用能将两个DNA分子片段连接，表明经两种限制酶(BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ)切割得到的DNA片段，其黏性末端相同。
(4)由题意知：由于与图三空圈相对应的大肠杆菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，故可推知与图三空圈相对应的图二中的菌落能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素。由图二、图三结果显示，多数大肠杆菌都能抗氨苄青霉素，而经限制酶BamH Ⅰ 作用后，标记基因tetR被破坏，故导入目的基因的大肠杆菌不能抗四环素，即多数大肠杆菌导入的是pBR322质粒。
【答案】 (1)鉴别目的基因是否导入受体细胞或筛选导入目的基因的受体细胞
(2)如下所示：
目的基因
—G AATTC—……—G AATTC—
—CTTAA G—……—CTTAA G—
(3)磷酸二酯 两种限制酶(BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ)切割得到的黏性末端相同
(4)能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素 pBR322质粒
1．基因工程是一种新兴生物技术，实施该工程的最终目的是( )
A．定向提取生物体DNA分子
B．定向对DNA分子进行人工“剪切”
C．在生物体外对DNA分子进行改造
D．定向改造生物的遗传性状
【解析】 基因工程也称DNA重组技术，它是按照人类的意愿，将某种基因有计划地转移到另一种生物中去的新技术，故实施该工程的最终目的是定向改造生物的遗传性状。
【答案】 D
2．(2016·湖北襄阳期末)限制性内切酶的作用实际上就是把DNA上某些化学键打断，一种能对GAATTC专一识别的限制酶，打断的化学键是( )
【导学号：10210008】
A．G与A之间的键 B．G与C之间的键
C．A与T之间的键 D．磷酸与脱氧核糖之间的键
【解析】 限制酶主要从原核生物中分离纯化出来，它能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。限制酶的作用部位是磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键，而一条链中相邻两个碱基之间的化学键为—脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖—。
【答案】 D
3．如下图，两个核酸片段在适宜条件下，经X酶的催化作用，发生下述变化，则X酶是( )
A．DNA连接酶 B．RNA聚合酶
C．DNA聚合酶 D．限制性核酸内切酶
【解析】 DNA连接酶的作用是将两个黏性末端的磷酸基和脱氧核糖连接在一起；RNA聚合酶是在RNA复制或转录过程中，把核糖核苷酸连接在一起；DNA聚合酶是在DNA复制过程催化脱氧核苷酸的聚合反应；限制性核酸内切酶是在获取目的基因时识别特定的碱基序列，切出黏性末端或平口末端。图示为将两个黏性末端的磷酸基和脱氧核糖连接在一起。
【答案】 A
4．下列四条DNA片段，可能是由同一种限制酶切割而成的是( )
A．①② B．②③
C．③④ D．②④
【解析】 只有②和④的黏性末端的碱基都是互补的，它们可能是由同一种限制酶切割而成的。
【答案】 D
5．关于限制性核酸内切酶识别序列和切开部位的特点，叙述错误的是( )
A．所识别的序列都可以找到一条中轴线
B．中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列
C．只识别和切断特定的脱氧核苷酸序列
D．在任何部位都能将DNA切开
【解析】 一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。
【答案】 D
课堂小结：
网络构建
核心回扣
1.基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。2.基因工程的原理是基因重组，处理对象是DNA或基因。
3.限制性核酸内切酶是能够识别和切割DNA分子的酶，又叫限制酶。DNA连接酶能将被限制性核酸内切酶切开的磷酸二酯键重新形成。
4.载体的作用是与含有外源基因(即目的基因)的DNA片段结合，将外源基因送入受体细胞中。
学业分层测评(一)
(建议用时：45分钟)
[学业达标]
1．下列有关基因工程叙述错误的是( )
A．最常用的载体是大肠杆菌的质粒
B．工具酶主要有限制性核酸内切酶和DNA连接酶
C．该技术人为地增加了生物变异的范围，实现种间遗传物质的交换
D．基本原理是基因突变
【解析】 基因工程的基本原理是基因重组，不同生物的DNA具有相同的结构以及遗传信息传递和表达方式相同是基因工程赖以完成的基础；基因工程中的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶，最常用的载体是大肠杆菌质粒。该技术可克服生殖隔离现象，实现种间遗传物质交换，按照人的意愿使生物发生变异。
【答案】 D
2．(2013·大纲全国卷)下列实践活动包含基因工程技术的是( ) 【导学号：10210009】
A．水稻F1花药经培养和染色体加倍，获得基因型纯合新品种
B．抗虫小麦与矮秆小麦杂交，通过基因重组获得抗虫矮秆小麦
C．将含抗病基因的重组DNA导入玉米细胞，经组织培养获得抗病植株
D．用射线照射大豆使其基因结构发生改变，获得种子性状发生变异的大豆
【解析】 A项属于单倍体育种，原理是染色体变异；B项属于杂交育种，原理是基因重组；C项属于基因工程育种，原理是基因重组；D项属于诱变育种，原理是基因突变。
【答案】 C
3．下列有关基因工程技术的叙述，正确的是( )
A．重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和载体
B．所有的限制酶都只能识别同一种特定的脱氧核苷酸序列
C．一般选用细菌的质粒作为基因进入受体细胞的载体
D．细菌体内的质粒可以直接作为基因工程中的载体
【解析】 此题考查基因工程的基本工具及相关知识。解答此类题目须明确以下知识：(1)基因操作的工具酶有限制性核酸内切酶(简称限制酶)和DNA连接酶。(2)一种限制酶只能识别特定的脱氧核苷酸序列，并从特定的位点切开，不同的限制酶识别的脱氧核苷酸序列是不同的。(3)载体是基因的运载工具，一般选用细菌的质粒作为载体，它既可以携带外源基因进入受体细胞，或独立复制或整合到受体细胞的DNA上，又有特殊的遗传标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。但在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
【答案】 C
4．下列说法中不正确的有( )
①限制性核酸内切酶全部是从真核生物中分离纯化而来的 ②DNA连接酶全部是从原核生物中分离得到的 ③所有限制性核酸内切酶识别的脱氧核苷酸序列均由6个核苷酸组成 ④不同限制性核酸内切酶切割DNA的位点不同 ⑤有的质粒是单链DNA
A．①②④⑤ B．①②③⑤
C．②③④⑤ D．①③④⑤
【解析】 限制性核酸内切酶主要是从原核生物中分离得到的，所以①错误；DNA连接酶中的一类是从原核生物大肠杆菌中分离得到的，另一类是从T4噬菌体中得到的，所以②错误；不同的限制性核酸内切酶识别的脱氧核苷酸序列不同，不一定都是6个核苷酸，所以③错误；质粒都是双链环状DNA分子，所以⑤错误。
【答案】 B
5．下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是( )
【导学号：10210010】
A．将单个核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸二酯键
B．将断开的两个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键
C．连接两条DNA链上碱基之间的氢键
D．只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，而不能将双链DNA片段平口末端之间进行连接
【解析】 DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键。DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，将两个DNA片段连接成重组DNA分子。DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已存在的核酸片段上形成磷酸二酯键，合成新的DNA分子。
【答案】 B
6．据图判断，有关工具酶功能的叙述错误的是( )
A．限制性核酸内切酶可以切断a处
B．DNA聚合酶可以连接a处
C．解旋酶可以使b处解开
D．DNA连接酶可以连接c处
【解析】 a处指的是两个相邻脱氧核苷酸之间的脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键，而c处指的是同一个脱氧核苷酸内的脱氧核糖和磷酸之间的化学键，DNA连接酶不能连接此化学键。
【答案】 D
7．作为基因工程中的“分子运输车”——载体，应具备的条件是( )
①必须有一个或多个限制性核酸内切酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上 ②载体必须具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制 ③必须带有标记基因，以便进行重组后的筛选 ④必须是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去 ⑤大小应合适，太大则不易操作
A．①②③④ B．①②③⑤
C．①③④⑤ D．①②③④⑤
【解析】 基因操作中运输目的基因的载体必须有一个或多个限制性核酸内切酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上；载体必须具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制；必须带有标记基因，以便进行重组后的筛选；必须是安全的；大小应合适，太大则不易操作。
【答案】 D
8．下图表示限制性核酸内切酶切割某DNA分子的过程，下列有关叙述，不正确的是( )
【导学号：10210011】
A．该限制酶能识别的碱基序列是GAATTC，切点在G和A之间
B．用此酶切割含有目的基因的片段时，必须用相应的限制性核酸内切酶切割载体，产生与目的基因相同的黏性末端
C．要把目的基因与载体“缝合”起来，要用到基因工程的另一个工具——DNA聚合酶
D．限制酶切割DNA分子时，是破坏了同一条链上相邻脱氧核苷酸之间的化学键，而不是两条链上互补配对的碱基之间的氢键
【解析】 由图示可知，该限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切点在G和A之间；要获得重组DNA分子，必须用限制性核酸内切酶切割载体和目的基因，得到相同的黏性末端；将目的基因与载体“缝合”起来的是DNA连接酶，而不是DNA聚合酶；限制性核酸内切酶切割的是同一条链上相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
【答案】 C
9．限制酶是一种核酸切割酶，可识别并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下图为四种限制酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ以及Bgl Ⅱ的识别序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列是什么( )
A．BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ 末端互补序列为AATT—
B．BamH Ⅰ和Hind Ⅲ 末端互补序列为GATC—
C．EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ 末端互补序列为AATT—
D．BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ 末端互补序列为GATC—
【解析】 图中四种限制酶切割DNA分子所形成的黏性末端分别是
可知BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ切割DNA分子产生的末端的碱基是互补的。
【答案】 D
10．科学家通过基因工程，需要从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫基因，放入棉花细胞中发挥作用，回答有关问题：
(1)从苏云金芽孢杆菌中切割抗虫基因所用的工具是________________。此工具主要存在于_______________________________________________
中，其特点是_______________________________________________
_______________________________________________。
(2)将抗虫基因导入棉花细胞需要的运输工具具有的特点是_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________，
最常用的载体是________，除了它还有________、________。
【答案】 (1)限制性核酸内切酶 细菌 一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割 (2)有一个至多个限制性核酸内切酶切割位点，在受体细胞中可进行自我复制，具标记基因 质粒 λ噬菌体的衍生物 动植物病毒
[能力提升]
11．下面是四种不同质粒的示意图，其中ori为复制必需的序列，amp为氨苄青霉素抗性基因，tet为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性核酸内切酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是( )
【导学号：10210012】
【解析】 A项破坏了复制必需的序列。B项氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都完好，在四环素培养基上和氨苄青霉素培养基上都能生长。C项氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因完好，能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长。D项氨苄青霉素抗性基因完好，四环素抗性基因被破坏。
【答案】 C
12．下图表示一项重要的生物技术，对图中物质a、b、c、d的描述，正确的是( )
A．a的基本骨架是磷酸和核糖交替连接而成的结构
B．要获得相同的黏性末端，要用相同的b去切割a和d
C．c连接双链间的氢键，使黏性末端处碱基互补配对
D．若要获得未知序列的d，可到基因文库中去寻找
【解析】 a是载体质粒，b是限制性核酸内切酶切割质粒，c是DNA连接酶，连接质粒和目的基因，d是目的基因。质粒是环状DNA，其基本骨架是磷酸和脱氧核糖交替连接而成的。要想获得同一种黏性末端要用同一种限制性核酸内切酶。DNA连接酶连接的是磷酸和脱氧核糖之间的键，不是氢键。对于未知序列的目的基因是无法从基因文库中获取的。
【答案】 B
13．(2016·天津一中月考)现有一长度为3 000碱基对(bp)的线性DNA分子，用限制性核酸内切酶酶切后，进行凝胶电泳，使降解产物分开。用酶H单独酶切，结果如图1。用酶B单独酶切，结果如图2。用酶H和酶B同时酶切，结果如图3。该DNA分子的结构及其酶切图谱是( )
【解析】 从图中所示的结果看，酶H单独酶切时会将DNA切割成两种长度(分别为2000bp、1000bp)，可以排除D选项；酶B单独酶切时使DNA切割成三种长度(分别为2000bp、600bp、400bp)，由此可排除BC选项。
【答案】 A
14．根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。
(2)质粒运载体用EcoR Ⅰ切割后产生的片段如下：
AATTC……G
G……CTTAA
为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoR Ⅰ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是_______________________________________________
_______________________________________________。
(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。
(4)基因工程中除质粒外，________和________也可作为运载体。
(5)请画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。
【解析】 当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平口末端。为使运载体与目的基因相连，用另一种限制酶切割后形成的黏性末端必须与EcoR Ⅰ切割形成的黏性末端相同。根据酶的来源不同，可以将DNA连接酶分为两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为大肠杆菌DNA连接酶；另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为T4DNA连接酶。基因工程中除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等也可作为运载体。
【答案】 (1)黏性末端 平口末端 (2)切割产生的DNA片段末端与EcoR Ⅰ切割产生的相同 (3)大肠杆菌 T4 (4)λ噬菌体的衍生物 动植物病毒
(5)―→＋
15．(2016·江苏扬州期中)基因工程又叫做基因拼接技术。该技术能够通过对生物的基因进行改造和重新组合，产生出人类所需要的基因产物。自20世纪70年代基因工程发展起来以后，人们开始采用高新技术生产各种基因产品。下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1和图2表示基因工程部分操作过程：
限制酶
BamH Ⅰ
Hind Ⅰ
EcoR Ⅰ
Sma Ⅰ
识别序列及切割位点
G↓GATC C
C CTAG↑G
A↓AGCT T
T TCGA↑A
G↓AATT C
C TTAA↑G
CCC↓GGG
GGG↑CCC
(1)从表中四种酶的切割位点看，可以切出平口末端的酶是________。
(2)将目的基因与质粒DNA缝合时，两条链上的磷酸、脱氧核糖在________酶的作用下连接起来，形成磷酸二酯键；两条链间的碱基对通过______连接起来。
(3)图2中的质粒分子可被表中________酶切割，切割后的质粒含有________个游离的磷酸基团。
(4)若对图中质粒进行改造，插入的Sma Ⅰ 酶切位点越多，质粒的热稳定性越________。
(5)在相关酶的作用下，甲与乙能否拼接起来？并说明理由：_______________________________________________
_______________________________________________。
【解析】 (1)由表格中四种限制酶切割位置可知，Sma Ⅰ可切出平口末端。(2)目的基因与质粒缝合时用DNA连接酶进行连接，形成磷酸二酯键，两条链之间的碱基通过碱基互补配对原则形成氢键。(3)根据质粒的碱基序列可知，质粒分子可被EcoR Ⅰ酶切割，切割后形成链状DNA，有2个游离的磷酸基团。(4)热稳定性越高的DNA分子中CG配对越多，可知，Sma Ⅰ酶切割的序列中碱基对都是CG，所以Sma Ⅰ酶切位点越多，质粒的热稳定性越高。(5)由图可知，甲和乙的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下可以拼接起来。
【答案】 (1)Sma Ⅰ酶 (2)DNA连接 氢键
(3)EcoR Ⅰ 2 (4)高 (5)能 二者具有相同的黏性末端
第一节 基因工程概述
第1课时 基因工程的发展历程和工具
1．简述基因工程的发展历程。
2．掌握限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用、特点。(重、难点)
3．掌握质粒的含义、特性及其在基因工程中的作用。(重、难点)
基 因 工 程 的 发 展 历 程 和 概 念
1．理论与技术基础的发展
1953年：沃森和克里克建立了DNA分子双螺旋结构模型。
↓
1957年：科恩伯格等首次发现DNA聚合酶。
↓
1958年：梅塞尔森和斯塔尔发现DNA半保留复制的机理。克里克提出中心法则。
↓
1961～1966年：尼伦伯格等破译遗传密码。
↓
1967年：罗思和赫林斯基发现运转工具质粒和DNA连接酶。
↓
1970年：特明和巴尔的摩各自在RNA病毒中发现逆转录酶。史密斯等人分离到限制性核酸内切酶。
↓
1977年：桑格首次完整基因组的测序工作。
2．重组DNA技术的发展
(1)1972年科学家伯格等实验。
①过程：
②成就：世界上首次DNA分子体外重组。
(2)1973年科学家科恩等实验。
重组DNA分子大肠杆菌―→子代大肠杆菌(双重抗性)
(3)不同物种间DNA重组实验。
①过程：非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段＋大肠杆菌质粒→重组DNA→转入大肠杆菌→转录出相应 mRNA。
②成就：打破了传统的种间遗传物质不能交换的重重壁垒，开创了基因工程。
3．基因工程的概念
方法
在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法
原理
对生物的基因进行改造和重新组合
操作水平
基因水平
目的
产生人类需要的基因产物
使大米拥有某些细菌才具有的抗虫基因能够减少化学杀虫剂的使用量，既高产又环保。
请你结合以上内容探究以下问题。
探讨：你知道拥有某些细菌抗虫基因的大米是通过何种技术培育出来的吗？
提示：基因工程。
探讨：通过分析基因工程的概念，讨论基因工程的原理是什么？与有性杂交育种有何区别？
提示：原理：基因重组。
区别：打破物种限制，实现不同物种间的基因交流。
探讨：将人的胰岛素基因导入大肠杆菌体内，通过大肠杆菌能大量生产人胰岛素。请分析人胰岛素基因能在大肠杆菌体内表达的理论基础是什么？
提示：生物共用一套遗传密码。
1．基因重组的三种主要类型
(1)交叉互换：减数第一次分裂四分体时期，同源染色体上的非姐妹染色单体间的交叉互换。
(2)自由组合：减数第一次分裂后期，非同源染色体上的非等位基因随着非同源染色体的自由组合而组合。
(3)基因工程：转基因生物因外源基因导入而获得的新性状是可以遗传的。
2．基因工程的理论基础
(1)拼接的基础：
①基本组成单位相同：不同生物的DNA分子都是由脱氧核苷酸构成的。
②空间结构相同：不同生物的DNA分子一般都是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链形成的规则的双螺旋结构。
③碱基配对方式相同：不同生物的DNA分子中两条链之间的碱基配对方式均是A与T配对，G与C配对。
(2)表达的基础：生物界共用一套遗传密码，相同的遗传信息在不同生物体内可表达出相同的蛋白质。
1．干扰素是治疗癌症的重要药物，它必须从血液中提取，每升人血中只能提取0.5 μg，所以价格昂贵。美国加利福尼亚的某生物制品公司用如下方法生产干扰素。如图所示，可以看出该公司生产干扰素运用的方法是( ) 【导学号：10210006】
A．个体间的杂交 B．基因工程
C．细胞融合 D．器官移植
【解析】 从图中可以看出整个过程为将人的淋巴细胞中控制干扰素合成的基因与质粒结合后导入酵母菌，并从酵母菌产物中提取干扰素，这项技术为基因工程。
【答案】 B
2．下列对基因工程的理解，正确的是( )
①它是一种按照人们的意愿，定向改造生物遗传特性的工程 ②可对基因随意进行人为改造 ③是体外进行的人为的基因重组 ④在实验室内，利用相关的酶和原料合成DNA ⑤主要技术为体外DNA重组技术和转基因技术 ⑥在DNA分子水平上进行操作
⑦一旦成功，便可遗传
A．①②③④⑤⑥ B．①③④⑤⑥⑦
C．①③⑤⑥⑦ D．①②③⑤⑥⑦
【解析】 基因工程可以对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物，而不是对基因进行人为改造。
【答案】 C
基 因 工 程 的 工 具——酶 与 载 体
1．限制性核酸内切酶(也称“限制酶”)
(1)来源：主要来自于原核生物。
(2)特点：具有专一性。
①识别双链DNA分子的某种特定的脱氧核苷酸序列。
②切割特定脱氧核苷酸序列中的特定位点。
(3)作用：断开每一条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
(4)结果：产生黏性末端或平口末端。
2．DNA连接酶——“分子针线”
(1)作用：将双链DNA片段“缝合”，恢复被限制性核酸内切酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
(2)结果：形成重组DNA分子。
3．载体——运载工具
(1)功能：将外源基因导入受体细胞。
(2)种类：质粒、λ噬菌体的衍生物以及一些动、植物病毒。
(3)质粒
①本质：来自于细菌细胞中的一种很小的环状DNA分子，是最早应用的载体。
②组成：最简单的质粒载体必须包括复制区、标记基因、目的基因插入位点。
我国科学家已成功将与植物花青素代谢有关的基因导入花卉植物矮牵牛中，转基因矮牵牛呈现出自然界没有的颜色变异，大大提高了花卉的观赏价值。请你依据以上材料探究以下问题：
探讨：科学家进行转基因技术操作时，需要用到哪些基本的工具？
提示：限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体。
探讨：结合DNA复制的过程分析，限制性核酸内切酶和DNA解旋酶的作用部位有何不同？
提示：限制性核酸内切酶作用于磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键，DNA解旋酶作用于碱基对之间的氢键。
探讨：下图所示过程是哪类酶作用的结果？该酶识别的碱基序列及切点是什么？这体现了该类酶具有什么特性？
提示：限制性核酸内切酶。识别的碱基序列为：GAATTC，切点在G和A之间。特异性。
探讨：质粒的化学本质是什么？来源于何类生物？
提示：化学本质：环状DNA分子。来源：细菌、酵母菌。
1．限制性核酸内切酶与DNA连接酶的比较
(1)区别：
作用
应用
限制性核酸内切酶
使特定部位的磷酸二酯键断开
用于提取目的基因和切割载体
DNA连接酶
在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键
用于基因表达载体的构建
(2)两者的关系可表示为：
2．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
项目
DNA连接酶
DNA聚合酶
相同点
催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键
不同点
模板
不需要模板
需要DNA的一条链为模板
作用对象
游离的DNA片段
单个的脱氧核苷酸
作用结果
形成完整的DNA分子
形成DNA的一条链
用途
基因工程
DNA复制
[特别提醒]
(1)不同DNA分子用同一种限制性核酸内切酶切割形成的黏性末端都相同；同一个DNA分子用不同的限制性核酸内切酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
(2)DNA连接酶无识别的特异性，DNA连接酶对于黏性末端或平口末端都能催化其“缝合”，重新形成DNA分子。
3．载体的作用、条件、种类及质粒的相关知识
作用
将外源基因送入受体细胞
条件
①能在宿主细胞内复制并稳定地保存
②具有多个限制性核酸内切酶切点
③具有某些标记基因
种类
常用的载体有质粒、λ噬菌体、动植物病毒
质粒
①质粒是最早应用的载体②结构：细菌细胞中的很小的环状DNA分子③特性：质粒的存在对宿主细胞无影响④重组质粒的形成：用同一种限制性核酸内切酶切割质粒和外源DNA分子，并通过DNA连接酶的连接，就能将质粒和外源DNA分子组成一个重组质粒(重组DNA分子)
[特别提醒]
(1)一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的载体进行人工改造。
(2)常见的标记基因有抗生素抗性基因、产生特定颜色的表达产物基因、发光基因等。
(3)注意与细胞膜上载体的区别，两者的化学本质和作用都不相同。
(4)质粒能自我复制，既可在自身细胞、受体细胞内，也可在体外。
1．基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是( ) 【导学号：10210007】
A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B．具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达
C．具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件
D．能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选
【解析】 载体作为目的基因的运输工具，能将目的基因导入受体细胞。作为载体必须具备三个条件：①能够在宿主细胞中稳定地保存，并能够复制，以便提供大量的目的基因；②有一个至多个限制酶切割位点，便于与外源基因结合；③具有标记基因，便于进行检测和筛选。
【答案】 A
2．目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如下图所示。
(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于_______________________________________________________________。
(2) pBR322分子中有单个EcoR Ⅰ限制酶作用位点，EcoR Ⅰ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G和A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoR Ⅰ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoR Ⅰ切割后所形成的黏性末端：_______________________________________________。
(3)pBR322分子中另有单个的Bcom HⅠ限制酶作用位点，现将经Bam HⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶Bgl Ⅱ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复________键，成功获得了重组质粒，说明_______________________________________________
_______________________________________________。
(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无ampR和tetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)，与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是______________________________________________，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是
_______________________________________________。
【解析】 (1)质粒作为基因表达载体的条件之一是要有抗性基因，以便于鉴别目的基因是否导入受体细胞或筛选导入目的基因的受体细胞。
(2)同一限制酶切割DNA分子产生的黏性末端相同，根据题意可知：该目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端为：
目的基因
—G AATTC—……—G AATTC—
—CTTAA G—……—CTTAA G—
(3)DNA连接酶催化两个DNA片段形成磷酸二酯键；而通过DNA连接酶作用能将两个DNA分子片段连接，表明经两种限制酶(BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ)切割得到的DNA片段，其黏性末端相同。
(4)由题意知：由于与图三空圈相对应的大肠杆菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，故可推知与图三空圈相对应的图二中的菌落能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素。由图二、图三结果显示，多数大肠杆菌都能抗氨苄青霉素，而经限制酶BamH Ⅰ 作用后，标记基因tetR被破坏，故导入目的基因的大肠杆菌不能抗四环素，即多数大肠杆菌导入的是pBR322质粒。
【答案】 (1)鉴别目的基因是否导入受体细胞或筛选导入目的基因的受体细胞
(2)如下所示：
目的基因
—G AATTC—……—G AATTC—
—CTTAA G—……—CTTAA G—
(3)磷酸二酯 两种限制酶(BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ)切割得到的黏性末端相同
(4)能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素 pBR322质粒
1．基因工程是一种新兴生物技术，实施该工程的最终目的是( )
A．定向提取生物体DNA分子
B．定向对DNA分子进行人工“剪切”
C．在生物体外对DNA分子进行改造
D．定向改造生物的遗传性状
【解析】 基因工程也称DNA重组技术，它是按照人类的意愿，将某种基因有计划地转移到另一种生物中去的新技术，故实施该工程的最终目的是定向改造生物的遗传性状。
【答案】 D
2．(2016·湖北襄阳期末)限制性内切酶的作用实际上就是把DNA上某些化学键打断，一种能对GAATTC专一识别的限制酶，打断的化学键是( )
【导学号：10210008】
A．G与A之间的键 B．G与C之间的键
C．A与T之间的键 D．磷酸与脱氧核糖之间的键
【解析】 限制酶主要从原核生物中分离纯化出来，它能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。限制酶的作用部位是磷酸和脱氧核糖之间的磷酸二酯键，而一条链中相邻两个碱基之间的化学键为—脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖—。
【答案】 D
3．如下图，两个核酸片段在适宜条件下，经X酶的催化作用，发生下述变化，则X酶是( )
A．DNA连接酶 B．RNA聚合酶
C．DNA聚合酶 D．限制性核酸内切酶
【解析】 DNA连接酶的作用是将两个黏性末端的磷酸基和脱氧核糖连接在一起；RNA聚合酶是在RNA复制或转录过程中，把核糖核苷酸连接在一起；DNA聚合酶是在DNA复制过程催化脱氧核苷酸的聚合反应；限制性核酸内切酶是在获取目的基因时识别特定的碱基序列，切出黏性末端或平口末端。图示为将两个黏性末端的磷酸基和脱氧核糖连接在一起。
【答案】 A
4．下列四条DNA片段，可能是由同一种限制酶切割而成的是( )
A．①② B．②③
C．③④ D．②④
【解析】 只有②和④的黏性末端的碱基都是互补的，它们可能是由同一种限制酶切割而成的。
【答案】 D
5．关于限制性核酸内切酶识别序列和切开部位的特点，叙述错误的是( )
A．所识别的序列都可以找到一条中轴线
B．中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列
C．只识别和切断特定的脱氧核苷酸序列
D．在任何部位都能将DNA切开
【解析】 一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。
【答案】 D
课堂小结：
网络构建
核心回扣
1.基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。2.基因工程的原理是基因重组，处理对象是DNA或基因。
3.限制性核酸内切酶是能够识别和切割DNA分子的酶，又叫限制酶。DNA连接酶能将被限制性核酸内切酶切开的磷酸二酯键重新形成。
4.载体的作用是与含有外源基因(即目的基因)的DNA片段结合，将外源基因送入受体细胞中。
学业分层测评(一)
(建议用时：45分钟)
[学业达标]
1．下列有关基因工程叙述错误的是( )
A．最常用的载体是大肠杆菌的质粒
B．工具酶主要有限制性核酸内切酶和DNA连接酶
C．该技术人为地增加了生物变异的范围，实现种间遗传物质的交换
D．基本原理是基因突变
【解析】 基因工程的基本原理是基因重组，不同生物的DNA具有相同的结构以及遗传信息传递和表达方式相同是基因工程赖以完成的基础；基因工程中的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶，最常用的载体是大肠杆菌质粒。该技术可克服生殖隔离现象，实现种间遗传物质交换，按照人的意愿使生物发生变异。
【答案】 D
2．(2013·大纲全国卷)下列实践活动包含基因工程技术的是( ) 【导学号：10210009】
A．水稻F1花药经培养和染色体加倍，获得基因型纯合新品种
B．抗虫小麦与矮秆小麦杂交，通过基因重组获得抗虫矮秆小麦
C．将含抗病基因的重组DNA导入玉米细胞，经组织培养获得抗病植株
D．用射线照射大豆使其基因结构发生改变，获得种子性状发生变异的大豆
【解析】 A项属于单倍体育种，原理是染色体变异；B项属于杂交育种，原理是基因重组；C项属于基因工程育种，原理是基因重组；D项属于诱变育种，原理是基因突变。
【答案】 C
3．下列有关基因工程技术的叙述，正确的是( )
A．重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和载体
B．所有的限制酶都只能识别同一种特定的脱氧核苷酸序列
C．一般选用细菌的质粒作为基因进入受体细胞的载体
D．细菌体内的质粒可以直接作为基因工程中的载体
【解析】 此题考查基因工程的基本工具及相关知识。解答此类题目须明确以下知识：(1)基因操作的工具酶有限制性核酸内切酶(简称限制酶)和DNA连接酶。(2)一种限制酶只能识别特定的脱氧核苷酸序列，并从特定的位点切开，不同的限制酶识别的脱氧核苷酸序列是不同的。(3)载体是基因的运载工具，一般选用细菌的质粒作为载体，它既可以携带外源基因进入受体细胞，或独立复制或整合到受体细胞的DNA上，又有特殊的遗传标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。但在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
【答案】 C
4．下列说法中不正确的有( )
①限制性核酸内切酶全部是从真核生物中分离纯化而来的 ②DNA连接酶全部是从原核生物中分离得到的 ③所有限制性核酸内切酶识别的脱氧核苷酸序列均由6个核苷酸组成 ④不同限制性核酸内切酶切割DNA的位点不同 ⑤有的质粒是单链DNA
A．①②④⑤ B．①②③⑤
C．②③④⑤ D．①③④⑤
【解析】 限制性核酸内切酶主要是从原核生物中分离得到的，所以①错误；DNA连接酶中的一类是从原核生物大肠杆菌中分离得到的，另一类是从T4噬菌体中得到的，所以②错误；不同的限制性核酸内切酶识别的脱氧核苷酸序列不同，不一定都是6个核苷酸，所以③错误；质粒都是双链环状DNA分子，所以⑤错误。
【答案】 B
5．下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是( )
【导学号：10210010】
A．将单个核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸二酯键
B．将断开的两个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键
C．连接两条DNA链上碱基之间的氢键
D．只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，而不能将双链DNA片段平口末端之间进行连接
【解析】 DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键。DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，将两个DNA片段连接成重组DNA分子。DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已存在的核酸片段上形成磷酸二酯键，合成新的DNA分子。
【答案】 B
6．据图判断，有关工具酶功能的叙述错误的是( )
A．限制性核酸内切酶可以切断a处
B．DNA聚合酶可以连接a处
C．解旋酶可以使b处解开
D．DNA连接酶可以连接c处
【解析】 a处指的是两个相邻脱氧核苷酸之间的脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键，而c处指的是同一个脱氧核苷酸内的脱氧核糖和磷酸之间的化学键，DNA连接酶不能连接此化学键。
【答案】 D
7．作为基因工程中的“分子运输车”——载体，应具备的条件是( )
①必须有一个或多个限制性核酸内切酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上 ②载体必须具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制 ③必须带有标记基因，以便进行重组后的筛选 ④必须是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去 ⑤大小应合适，太大则不易操作
A．①②③④ B．①②③⑤
C．①③④⑤ D．①②③④⑤
【解析】 基因操作中运输目的基因的载体必须有一个或多个限制性核酸内切酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上；载体必须具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制；必须带有标记基因，以便进行重组后的筛选；必须是安全的；大小应合适，太大则不易操作。
【答案】 D
8．下图表示限制性核酸内切酶切割某DNA分子的过程，下列有关叙述，不正确的是( )
【导学号：10210011】
A．该限制酶能识别的碱基序列是GAATTC，切点在G和A之间
B．用此酶切割含有目的基因的片段时，必须用相应的限制性核酸内切酶切割载体，产生与目的基因相同的黏性末端
C．要把目的基因与载体“缝合”起来，要用到基因工程的另一个工具——DNA聚合酶
D．限制酶切割DNA分子时，是破坏了同一条链上相邻脱氧核苷酸之间的化学键，而不是两条链上互补配对的碱基之间的氢键
【解析】 由图示可知，该限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切点在G和A之间；要获得重组DNA分子，必须用限制性核酸内切酶切割载体和目的基因，得到相同的黏性末端；将目的基因与载体“缝合”起来的是DNA连接酶，而不是DNA聚合酶；限制性核酸内切酶切割的是同一条链上相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。
【答案】 C
9．限制酶是一种核酸切割酶，可识别并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下图为四种限制酶BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ以及Bgl Ⅱ的识别序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位，其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合？其正确的末端互补序列是什么( )
A．BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ 末端互补序列为AATT—
B．BamH Ⅰ和Hind Ⅲ 末端互补序列为GATC—
C．EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ 末端互补序列为AATT—
D．BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ 末端互补序列为GATC—
【解析】 图中四种限制酶切割DNA分子所形成的黏性末端分别是
可知BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ切割DNA分子产生的末端的碱基是互补的。
【答案】 D
10．科学家通过基因工程，需要从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫基因，放入棉花细胞中发挥作用，回答有关问题：
(1)从苏云金芽孢杆菌中切割抗虫基因所用的工具是________________。此工具主要存在于_______________________________________________
中，其特点是_______________________________________________
_______________________________________________。
(2)将抗虫基因导入棉花细胞需要的运输工具具有的特点是_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________，
最常用的载体是________，除了它还有________、________。
【答案】 (1)限制性核酸内切酶 细菌 一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割 (2)有一个至多个限制性核酸内切酶切割位点，在受体细胞中可进行自我复制，具标记基因 质粒 λ噬菌体的衍生物 动植物病毒
[能力提升]
11．下面是四种不同质粒的示意图，其中ori为复制必需的序列，amp为氨苄青霉素抗性基因，tet为四环素抗性基因，箭头表示一种限制性核酸内切酶的酶切位点。若要得到一个能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长的含重组DNA的细胞，应选用的质粒是( )
【导学号：10210012】
【解析】 A项破坏了复制必需的序列。B项氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都完好，在四环素培养基上和氨苄青霉素培养基上都能生长。C项氨苄青霉素抗性基因被破坏，四环素抗性基因完好，能在四环素培养基上生长而不能在氨苄青霉素培养基上生长。D项氨苄青霉素抗性基因完好，四环素抗性基因被破坏。
【答案】 C
12．下图表示一项重要的生物技术，对图中物质a、b、c、d的描述，正确的是( )
A．a的基本骨架是磷酸和核糖交替连接而成的结构
B．要获得相同的黏性末端，要用相同的b去切割a和d
C．c连接双链间的氢键，使黏性末端处碱基互补配对
D．若要获得未知序列的d，可到基因文库中去寻找
【解析】 a是载体质粒，b是限制性核酸内切酶切割质粒，c是DNA连接酶，连接质粒和目的基因，d是目的基因。质粒是环状DNA，其基本骨架是磷酸和脱氧核糖交替连接而成的。要想获得同一种黏性末端要用同一种限制性核酸内切酶。DNA连接酶连接的是磷酸和脱氧核糖之间的键，不是氢键。对于未知序列的目的基因是无法从基因文库中获取的。
【答案】 B
13．(2016·天津一中月考)现有一长度为3 000碱基对(bp)的线性DNA分子，用限制性核酸内切酶酶切后，进行凝胶电泳，使降解产物分开。用酶H单独酶切，结果如图1。用酶B单独酶切，结果如图2。用酶H和酶B同时酶切，结果如图3。该DNA分子的结构及其酶切图谱是( )
【解析】 从图中所示的结果看，酶H单独酶切时会将DNA切割成两种长度(分别为2000bp、1000bp)，可以排除D选项；酶B单独酶切时使DNA切割成三种长度(分别为2000bp、600bp、400bp)，由此可排除BC选项。
【答案】 A
14．根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。
(2)质粒运载体用EcoR Ⅰ切割后产生的片段如下：
AATTC……G
G……CTTAA
为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoR Ⅰ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是_______________________________________________
_______________________________________________。
(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。
(4)基因工程中除质粒外，________和________也可作为运载体。
(5)请画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。
【解析】 当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平口末端。为使运载体与目的基因相连，用另一种限制酶切割后形成的黏性末端必须与EcoR Ⅰ切割形成的黏性末端相同。根据酶的来源不同，可以将DNA连接酶分为两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为大肠杆菌DNA连接酶；另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为T4DNA连接酶。基因工程中除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等也可作为运载体。
【答案】 (1)黏性末端 平口末端 (2)切割产生的DNA片段末端与EcoR Ⅰ切割产生的相同 (3)大肠杆菌 T4 (4)λ噬菌体的衍生物 动植物病毒
(5)―→＋
15．(2016·江苏扬州期中)基因工程又叫做基因拼接技术。该技术能够通过对生物的基因进行改造和重新组合，产生出人类所需要的基因产物。自20世纪70年代基因工程发展起来以后，人们开始采用高新技术生产各种基因产品。下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1和图2表示基因工程部分操作过程：
限制酶
BamH Ⅰ
Hind Ⅰ
EcoR Ⅰ
Sma Ⅰ
识别序列及切割位点
G↓GATC C
C CTAG↑G
A↓AGCT T
T TCGA↑A
G↓AATT C
C TTAA↑G
CCC↓GGG
GGG↑CCC
(1)从表中四种酶的切割位点看，可以切出平口末端的酶是________。
(2)将目的基因与质粒DNA缝合时，两条链上的磷酸、脱氧核糖在________酶的作用下连接起来，形成磷酸二酯键；两条链间的碱基对通过______连接起来。
(3)图2中的质粒分子可被表中________酶切割，切割后的质粒含有________个游离的磷酸基团。
(4)若对图中质粒进行改造，插入的Sma Ⅰ 酶切位点越多，质粒的热稳定性越________。
(5)在相关酶的作用下，甲与乙能否拼接起来？并说明理由：_______________________________________________
_______________________________________________。
【解析】 (1)由表格中四种限制酶切割位置可知，Sma Ⅰ可切出平口末端。(2)目的基因与质粒缝合时用DNA连接酶进行连接，形成磷酸二酯键，两条链之间的碱基通过碱基互补配对原则形成氢键。(3)根据质粒的碱基序列可知，质粒分子可被EcoR Ⅰ酶切割，切割后形成链状DNA，有2个游离的磷酸基团。(4)热稳定性越高的DNA分子中CG配对越多，可知，Sma Ⅰ酶切割的序列中碱基对都是CG，所以Sma Ⅰ酶切位点越多，质粒的热稳定性越高。(5)由图可知，甲和乙的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下可以拼接起来。
【答案】 (1)Sma Ⅰ酶 (2)DNA连接 氢键
(3)EcoR Ⅰ 2 (4)高 (5)能 二者具有相同的黏性末端
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