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生物选择性必修3 生物技术与工程第一节 发酵工程的培养基第2课时教案
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这是一份生物选择性必修3 生物技术与工程第一节 发酵工程的培养基第2课时教案，共21页。
第2课时 基因工程的实施过程
1．简述基因工程的一般过程。
2．理解获取目的基因的方法。(重、难点)
3．掌握将目的基因导入受体细胞的方法。(重点)
4．掌握目的基因的检测和鉴定方法。(重点)
获取目的基因和构建基因表达载体
1．获取目的基因
(1)通过基因文库获取目的基因：
①基因文库的含义：将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片段，分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。这个受体菌群体就被称为基因文库。
②种类：
a．基因组文库：含有一种生物所有的基因。
b．部分基因文库：含有一种生物的一部分基因。
(2)利用PCR技术扩增目的基因：
①原理：DNA分子半保留复制。
②场所：生物体外(PCR仪)。
③优点：操作简单、容易掌握、结果可靠、较短时间内大量扩增。
④发明家：美国科学家穆里斯。
(3)通过化学方法直接人工合成目的基因：
①仪器：DNA合成仪。
②基因特点：比较小、脱氧核苷酸序列已知。
2．构建基因表达载体
(1)目的：使目的基因进入受体细胞并有效表达，能稳定存在且遗传给后代。
(2)组成：一个基因表达载体除了目的基因外，还应包括启动子、终止子和标记基因等。
基因表达载体的构建是基因工程的核心，下面图1为基因表达载体的构建过程图，图2为基因表达载体模式图。请据图分析：
图2
探讨：图1中的①是什么物质？切割目的基因和载体要选用同一种①吗？为什么？
提示：限制性核酸内切酶。选用同一种①，因为：选用同一种限制性核酸内切酶切割会产生相同的黏性末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。
探讨：图1中②是什么物质？试探讨用②连接目的基因和载体DNA时产生几种可能的连接方式？哪一种是符合要求的连接方式。
提示：DNA连接酶。可能有3种连接方式，即目的基因和目的基因相连、载体DNA和载体DNA相连、目的基因和载体DNA相连。其中符合要求的是目的基因和载体DNA相连形成的重组DNA分子。
探讨：图2中的抗生素抗性基因属于什么基因？能否将目的基因插入该基因中？为什么？
提示：标记基因。不能。标记基因用于鉴定受体细胞是否成功导入目的基因，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进一步筛选。
1．获取目的基因
(1)来源。
目的基因可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工方法合成。
(2)具体方法。
①从已有的物种中分离：从基因文库中提取目的基因。
②化学合成法：对于比较小，核苷酸序列已知的目的基因一般用人工合成的方法。如已知氨基酸序列，合成DNA。
③反转录法：它是以目的基因的mRNA为模板，合成碱基互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA。
④利用PCR技术扩增目的基因。
a．PCR的含义：一项在生物体外通过酶促反应有选择地大量扩增目的基因或DNA序列的技术。
b．目的：短时间内大量扩增目的基因或DNA序列。
c．原理：DNA分子半保留复制。
d．特点：操作简单、易掌握、结果可靠，能在短时间内大量复制目的基因或DNA序列。
e．步骤：第一步，向离心管加入模板、原料、引物及Taq DNA聚合酶。
第二步，加热至94 ℃，双链DNA解旋为单链DNA。
第三步，冷却至55 ℃，引物与两条单链DNA上的特定部位相互配对。
第四步，加热至72 ℃，热稳定DNA聚合酶(Taq聚合酶)从引物起始进行互补链的合成。
如此重复循环多次。
f．特点：指数形式扩增。
2．PCR技术扩增目的基因与DNA复制的比较
PCR技术
DNA复制
相同点
原则
碱基互补配对
原料
四种脱氧核苷酸
条件
模板、ATP、酶
不同点
解旋方式
DNA在高温下
变性解旋
解旋酶催化
场所
体外复制
细胞核内
酶
热稳定的DNA
聚合酶(Taq聚
合酶)
细胞内含有的
DNA聚合酶
结果
在短时间内形成
大量的DNA片段
形成整个DNA
分子
[特别提醒]
提取目的基因的三种方法的应用情况
(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过用受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中去获取目的基因。
(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以通过DNA合成仪利用化学方法人工合成。
(3)如果知道扩增目的基因及两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，则可以通过PCR技术扩增目的基因。
3．构建基因表达载体
(1)基因表达载体结构。
(2)分析。
①启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于目的基因上游的一段核苷酸序列，是RNA聚合酶识别和结合的部位。
②目的基因：编码相关蛋白质，并形成基因工程产品或产生新的生物性状。
③终止子：一段有特殊结构的DNA片段，位于目的基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。
④标记基因：一般为抗生素抗性基因或荧光蛋白基因等，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因(或目的基因是否导入成功)。
(2)基因表达载体的功能。
将目的基因导入受体细胞并使之有效表达。
(3)基因表达载体的构建步骤。
①用同一种限制酶切割目的基因和质粒，使其产生相同末端。
②将切下的目的基因片段与切开的质粒混合，再加入适量DNA连接酶，使目的基因插入质粒的切口处，形成一个重组DNA分子(重组质粒)。
[特别提醒]
启动子和终止子、起始密码子与终止密码子的区别
(1)启动子和终止子都在DNA上，在遗传信息转录时起作用。启动子是启动转录的开始，终止子是DNA分子上决定转录停止的一段DNA序列，其组成单位都是脱氧核苷酸。
(2)起始密码子和终止密码子都是mRNA上三个相邻碱基。起始密码子决定翻译的开始，终止密码子决定翻译的停止。
1．下列属于获取目的基因的方法的是( )
【导学号：10210013】
①利用mRNA反转录形成 ②从基因文库中提取 ③从受体细胞中提取 ④利用PCR技术 ⑤利用DNA转录 ⑥人工合成
A．①②③⑤ B．①②⑤⑥
C．①②③④ D．①②④⑥
【解析】 获取目的基因的方法包括从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术扩增目的基因和利用DNA合成仪用化学方法直接人工合成。目的基因属于外源基因，不能从受体细胞中提取，利用DNA转录合成的是RNA，不是目的基因。
【答案】 D
2.
右图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ的酶切位点， ampr为青霉素抗性基因，tetr为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ在内的多种酶的酶切位点。据图回答：
(1)将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoR Ⅰ酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有_______________________________________________、
____________、____________三种。
(2)用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有____________；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有____________。
(3)目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是____________，其合成的产物是____________。
(4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是__________________。
【解析】 (1)将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoR Ⅰ酶切，所产生的黏性末端相同，用DNA连接酶处理后，不同的片段随机结合，可形成3种不同的连接物：目的基因——目的基因、目的基因——载体、载体——载体。(2)在上述三种产物中，插入目的基因的都不能在四环素培养基上生长，只有载体——载体连接产物才能在含四环素的培养基上生长。(3)启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可启动转录过程，合成mRNA。(4)由图示和题目中提供的信息可知，同时运用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行酶切可有效防止酶切后产生的末端发生任意连接。
【答案】 (1)目的基因——载体连接物 载体——载体连接物 目的基因——目的基因连接物
(2)载体——载体连接物 目的基因——载体连接物、载体——载体连接物
(3)启动子 mRNA (4)EcoR Ⅰ和BamHⅠ
目 的 基 因 的导 入、 检 测 和 鉴 定
1．导入目的基因
(1)将目的基因导入植物细胞最常用的是农杆菌转化法。
(2)将目的基因导入动物细胞常用的是显微注射法。
(3)将目的基因导入微生物细胞常用的方法是Ca2＋处理法。
2．检测和鉴定目的基因
(1)从DNA水平检测：DNA分子杂交法。
(2)从RNA水平检测重组体：分子杂交技术。
(3)从蛋白质水平检测：抗原—抗体杂交。
(4)从个体水平对其生物学特定性状进行检测。
将苏云金芽孢杆菌(图一)的毒蛋白基因提取出来导入普通棉花(图二)细胞可培育成转基因抗虫棉(图三)，依据以上内容探究以下问题。
探讨：为什么植物的体细胞可以作为受体细胞，而动物的体细胞不能作为受体细胞？
提示：植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物体细胞全能性受到限制，不能发育为一个新个体，因此动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。
探讨：从细胞器的功能上分析，若通过基因工程生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌作受体细胞吗？
提示：不可以。糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。
探讨：检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？
提示：用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。
探讨：DNA分子杂交的原理是什么？有哪些应用？
提示：碱基互补配对原则。可用于亲子鉴定、刑事侦查、生物亲缘关系鉴定等。
1．导入目的基因
目的基因导入受体细胞的方法。
细胞类型
方法
转化过程
特点
植物细胞
农杆菌转化法
目的基因插入到Ti质粒的TDNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达
经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物
动物细胞
显微注射法
目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
最为有效的将目的基因导入动物细胞的方法
微生物细胞
Ca2＋处理法
Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体与感受态细胞混合在缓冲液中→一定温度下促使感受态细胞吸收DNA分子
简便、经济、有效
[特别提醒]
(1)将目的基因导入植物细胞培育转基因植物时，受体细胞可以是体细胞和受精卵，因为植物体细胞具有全能性。
(2)将目的基因导入动物细胞培育转基因动物时，受体细胞是受精卵，不能用体细胞，因为高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。
(3)微生物细胞作为受体细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等优点。
(4)将基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌的常用方法是Ca2＋处理法。Ca2＋(或CaCl2溶液)对微生物细胞的作用是增加细胞壁的通透性。
2．检测和鉴定目的基因
检测水平
检测内容
方法
结果显示
分子水平的检测
检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因
DNA分子杂交技术(基因探针＋转基因生物的DNA)
是否显示出杂交带
检测目的基因是否转录
分子杂交技术(基因探针＋转基因生物的mRNA)
是否显示出杂交带
检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗原—抗体杂交
是否显示出杂交带
个体水平的检测
包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度；基因工程产品需要与天然产品进行活性比较等
[特别提醒]
不同分子检测的原理、场所、探针的异同
(1)进行转录水平的检测原理与复制水平的检测原理是相似的，只是被检测的物质不再是转基因生物的基因组DNA，而是转基因生物的细胞内的mRNA；进行翻译水平的检测，则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。
(2)不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。
(3)在DNA分子，mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。
1．(2016·长春高二检测)基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，主要原因是( )
A．结构简单，操作方便 B．繁殖速度快
C．遗传物质含量少 D．性状稳定，变异少
【解析】 目的基因导入受体细胞后，随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌等微生物繁殖速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。因此，基因工程常用的受体细胞有细菌、真菌等。
【答案】 B
2．科学家通过基因工程方法，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。其过程大致如图所示。根据题意，回答下列问题。 【导学号：10210014】
(1)基因工程操作程序的一般步骤是____________、____________、____________、________。
(2)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有TDNA，把目的基因插入Ti质粒的TDNA中是利用TDNA的______________________________________的特点。
(3)将目的基因导入受体细胞的方法有很多种，该题中涉及的是______________。
(4)若目的基因能在棉株体内稳定维持和表达，主要是因为_______________________________________________，
分子水平检测目的基因是否表达的方法是______________。
【解析】 本题以抗虫棉的培育为背景，考查了运用基因工程技术培育转基因作物的步骤、方法，农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法利用它能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，以及其Ti质粒上的TDNA能转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上的特点，可以把目的基因插入其Ti质粒的TDNA中，借助其作用使目的的基因成功导入受体细胞。
【答案】 (1)获取目的基因 构建基因表达载体 导入目的基因 检测和鉴定目的基因
(2)可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上
(3)农杆菌转化法
(4)目的基因插入了受体细胞的染色体DNA中 抗原—抗体杂交
1．下列不属于获取目的基因的方法的是( )
A．利用DNA连接酶复制目的基因
B．化学方法直接合成
C．从基因文库中获取目的基因
D．利用PCR技术扩增目的基因
【解析】 本题考查目的基因的获取方法及DNA聚合酶和DNA连接酶的区别。对目的基因(DNA片段)进行复制需利用DNA聚合酶而不是DNA连接酶。
【答案】 A
2．(2016·仙桃模拟)基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的是( ) 【导学号：10210015】
A．目的基因与载体的结合
B．将目的基因导入受体细胞
C．目的基因的表达
D．目的基因的人工合成
【解析】 合成目的基因及其与载体的结合都有碱基互补配对过程，而目的基因进入受体细胞是通过载体的运输作用进入，不存在碱基互补配对过程。
【答案】 B
3．要检测目的基因是否成功地插入受体DNA中，需要用核酸探针，核酸探针是指( )
A．用于检测疾病的医疗器械
B．用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子
C．合成β球蛋白的DNA
D．合成苯丙羟化酶的DNA片段
【解析】 核酸是指已知核苷酸序列的DNA片段(实际上是单链)，为了便于对杂交结果进行检测，需要对其做放射性同位素或荧光分子标记。
【答案】 B
4．下列关于基因工程的叙述，错误的是( )
A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物
B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶
C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性
D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达
【解析】 基因工程中目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物；常用的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶；人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性，只有经过一定的物质激活以后，才有生物活性；载体上的抗性基因主要是有利于筛选含重组DNA的细胞，不能促进目的基因的表达。所以D错误。
【答案】 D
5．以下有关基因工程的叙述，正确的是( )
A．利用PCR技术可以大量扩增目的基因
B．目的基因导入受体细胞最常用的方法是农杆菌转化法
C．用同一种限制酶分别切割载体和目的基因的目的是能够产生不同的黏性末端
D．利用载体上标记基因的相关特性就可检测出目的基因已导入受体细胞并成功表达
【解析】 将目的基因导入植物细胞最常用的是农杆菌转化法，导入动物细胞最常用的是显微注射技术，导入大肠杆菌最常用的转化方法是Ca2＋处理法；用同一种限制酶分别切割载体和目的基因的目的是能够产生相同的黏性末端；利用载体上的标记基因可以检测出目的基因是否导入受体细胞，但不能检测目的基因是否表达。
【答案】 A
课堂小结：
网络构建
核心回扣
1.基因工程的操作步骤：获取目的基因→构建基因表达载体→目的基因的导入→目的基因的检测与鉴定
2.获取目的基因的三种方法：基因文库直接获得、PCR扩增、人工合成。
3.基因表达载体的构成：目的基因、启动子、终止子、标记基因等。
4.导入目的基因的方法有：农杆菌转化法、显微注射法、Ca2＋处理法。
5.检测目的基因方法：DNA分子杂交法、DNA—RNA分子杂交、抗原—抗体杂交、个体水平检测。
学业分层测评(二)
(建议用时：45分钟)
[学业达标]
1．下列关于基因表达载体导入微生物细胞的叙述中，不正确的是( )
A．常用原核生物作为受体细胞，是因为原核生物繁殖快，且多为单细胞，遗传物质相对较少
B．受体细胞所处的一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态称为感受态
C．感受态细胞吸收DNA分子需要适宜的温度和酸碱度
D．感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子的液体只要调节为适宜的pH即可，没必要用缓冲液
【解析】 将基因表达载体导入微生物细胞时，需在一定条件(如适宜的温度、pH等)下，将基因表达载体和感受态的微生物细胞混合培养，在培养过程中，可能会影响pH的变化，因此要加入缓冲液，以保持适宜的pH。
【答案】 D
2．(2016·湖北期中联考)在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是( )
【导学号：10210016】
A．用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸
B．用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体
C．将重组DNA分子导入烟草原生质体
D．用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞
【解析】 限制酶一般只切断DNA分子双链，而烟草花叶病毒是RNA病毒，DNA连接酶是连接目的基因和运载体，将重组DNA分子导入烟草原生质体是利用农杆菌转化法，根据能在含除草剂的培养基上能生长的是转基因烟草细胞，所以选A。
【答案】 A
3．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是( )
A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因
B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA
C．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列
D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白
【解析】 基因的表达即控制蛋白质的合成，只有合成了相应的蛋白质才能证明目的基因完成了在受体细胞中的表达。
【答案】 D
4．下列有关基因工程技术的正确叙述是( )
A．重组DNA技术所用的工具酶是限制性核酸内切酶、连接酶、载体
B．为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞
C．选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快
D．只要目的基因进入了受体细胞就能成功表达
【解析】 A项中的载体不是酶；B项中的受体细胞常用受精卵，但有时也可用植物体细胞；D项中，目的基因进入受体细胞并不一定能成功表达。
【答案】 C
5．下列获取目的基因的方法中需要模板链的是( )
【导学号：10210017】
①从基因文库中获取目的基因
②利用PCR技术扩增目的基因
③逆转录法
④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成
A．①②③④ B．①②③
C．②③④ D．②③
【解析】 PCR利用的是DNA双链复制原理，即将双链DNA之间的氢键打开，变成单链DNA，作为聚合反应的模板。逆转录法则是以目的基因转录成的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，先逆转录形成互补的单链DNA，再合成双链的DNA。①④则均不需要模板。
【答案】 D
6．以下关于基因工程的叙述，正确的是( )
A．获得目的基因需用限制性核酸内切酶和DNA连接酶
B．DNA连接酶的作用是将两个黏性末端的碱基连接起来
C．可通过农杆菌的感染以实现目的基因导入受体细胞
D．载体上的标记基因有利于与外源基因连接并筛选转化细胞
【解析】 获得目的基因只需用限制性核酸内切酶，构建重组质粒需用限制性核酸内切酶和DNA连接酶，A错误；DNA连接酶的作用是将两个黏性末端的磷酸二酯键连接起来，B项错误；通过农杆菌的感染以实现重组质粒导入受体细胞，培育出转基因生物，C正确；载体上的标记基因有利于筛选含重组DNA的细胞，D错误。
【答案】 C
7．下图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。下列相关叙述中正确的是( )
A．三种方法都需酶并均在体外进行
B．①②③碱基对的排列顺序均相同
C．三种方法均属人工合成法
D．方法a不遵循中心法则
【解析】 这三种方法都是在体外进行的，且都用到酶(方法a需要逆转录酶和DNA聚合酶、方法b需要限制酶、方法c需要DNA聚合酶)，A正确；方法a得到的目的基因不含有内含子，方法c得到的目的基因的碱基序列可能有多种，因此①②③碱基对的排列顺序不都相同，B错误；图示a和c属于人工合成法，而b是从供体细胞的DNA中直接分离基因的方法，C错误；方法a遵循碱基互补配对原则，D错误。
【答案】 A
8．下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是( ) 【导学号：10210018】
A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得
B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点
C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来
D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
【解析】 A项，胰岛素基因只能在胰岛B细胞中表达，不能在肝细胞中表达，因而不能通过人体肝细胞mRNA反转录获得。B项，复制原点是表达载体复制的起点，胰岛素基因表达的起点是启动子。C项，基因表达载体中一般以抗生素抗性基因为标记基因，因此可借助抗生素抗性基因将含有胰岛素基因的受体细胞筛选出来。D项，终止密码子是翻译终止的信号，不是转录终止的信号。
【答案】 C
9．(多选)(2013·江苏高考)小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因(目的基因)后再重组表达。下列相关叙述正确的是( )
A．设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列
B．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列
C．PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶
D．一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞
【解析】 设计引物时应当考虑由此扩增的目的基因与载体两端的序列进行互补配对；PCR体系中应用耐高温的DNA聚合酶，而不是从受体细胞中提取的普通DNA聚合酶。
【答案】 BD
10．请据图回答下列问题。
(1)利用________技术可以获得大量的目的基因。该技术利用____________的原理，将基因的核苷酸序列不断加以复制，使其数量呈指数增长。
(2)图中________位于基因的首端，是________识别和结合的部位。抗生素基因的作用是作为________，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因。
【解析】 目的基因的获取方法很多，其中PCR技术能迅速获得大量目的基因，其依据的原理是DNA双链复制原理；基因表达载体必须包含目的基因、启动子、标记基因、终止子，其中启动子位于目的基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录为mRNA，抗生素抗性基因作为标记基因用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因。
【答案】 (1) PCR DNA双链复制 (2)启动子 RNA聚合酶 标记基因
[能力提升]
11．采用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵，培育出了转基因羊。但是，人凝血因子只存在于该转基因羊的乳汁中。以下有关叙述，正确的是( )
A．人体细胞中凝血因子基因编码区的碱基对数目，等于凝血因子氨基酸数目的3倍
B．可用显微注射技术将含有人凝血因子基因的重组DNA分子导入羊的受精卵中
C．在该转基因羊中，人凝血因子基因存在于乳腺细胞，而不存在于其他体细胞中
D．人凝血因子基因开始转录后，DNA连接酶以DNA分子的一条链为模板合成mRNA
【解析】 人体细胞是真核细胞，其基因中含有内含子，其碱基对数大于氨基酸数的三倍；山羊的受精卵中导入人凝血因子基因，长成的山羊每个体细胞中都含有这种基因；DNA连接酶是把两条DNA链末端之间的缝隙“缝合”起来，而不是参与转录。基因工程外源基因的导入多采用人工的方法，使体外重组的DNA分子转移到受体细胞，在本题中可采用显微注射法。
【答案】 B
12．人们试图利用基因工程的方法，用乙种生物生产甲种生物的一种蛋白质。生产流程是：甲生物的蛋白质→mRNA目的基因与质粒DNA重组导入乙细胞获得甲生物的蛋白质，下列说法正确的是( ) 【导学号：10210019】
A．①过程需要的酶是逆转录酶，原料是A、U、G、C
B．②要用限制性核酸内切酶切断质粒DNA，再用DNA连接酶将目的基因与质粒连接在—起
C．如果受体细胞是细菌，可以选用枯草杆菌、炭疽杆菌等
D．④过程中用的原料不含有A、U、G、C
【解析】 ①过程是逆转录，利用逆转录酶合成DNA片段，所需要的原料含有A、T、G、C；②是目的基因与质粒DNA重组阶段，需要用限制性核酸内切酶切断质粒DNA，再用DNA连接酶将目的基因与质粒连接在一起；③如果受体细胞是细菌，则不应该用致病菌，而炭疽杆菌是致病菌；④过程是基因的表达过程，原料中含有A、U、G、C。
【答案】 B
13．(双选)(2014·广东高考)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如下图所示，下列叙述正确的是( )
A．过程①需使用逆转录酶
B．过程②需使用解旋酶和PCR获取目的基因
C．过程③使用的感受态细胞可用NaCl溶液制备
D．过程④可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞
【解析】 ①过程是逆转录过程，需要逆转录酶催化；从cDNA文库中获取所需要的目的基因，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置或基因翻译产物蛋白质等特性来获取，不需要用解旋酶，也不需要PCR；用CaCl2溶液处理大肠杆菌，可使其成为感受态细胞；鉴别目的基因是否导入受体细胞可利用DNA分子杂交技术。
【答案】 AD
14．如图是从酵母菌获取某植物需要的某种酶基因的流程，结合所学知识及相关信息回答下列问题：
(1)图中cDNA文库________基因组文库(填“大于”“等于”或“小于”)。
(2)①过程提取的DNA需要________的切割，B过程是________。
(3)为在短时间内大量获得目的基因，可用________扩增的方法。目的基因获取之后，需要进行____________，其组成必须有________________________以及标记基因等，此步骤是基因工程的核心。
(4)将该目的基因导入某双子叶植物细胞，常采用的方法是________________，其能否在此植物体内稳定遗传可以用________技术进行检测。
【解析】 (1)cDNA文库小于基因组文库。(2)提取目的基因需要限制酶，逆转录法获得目的基因需要逆转录酶。(3)短时间内大量获得目的基因，可用PCR技术扩增的方法。基因表达载体的组成必须有目的基因、标记基因、启动子和终止子，基因表达载体的构建是基因工程的核心。(4)将目的基因导入某双子叶植物细胞常采用的方法是农杆菌转化法，目的基因只有整合到植物细胞的染色体上才能在植物体内稳定遗传，可通过DNA分子杂交的方法对目的基因是否整合到染色体上进行检测。
【答案】 (1)小于 (2)限制酶 反转录(或逆转录) (3)PCR技术 基因表达载体的构建 启动子、终止子、目的基因 (4)农杆菌转化法 DNA分子杂交
15．科研人员研究发现，一种植物激素——油菜素内酯能促进农药在植物体内的降解和代谢。研究人员发现，用油菜素内酚处理后，许多参与农药降解的基因(如P450)的表达和酶活性都得到提高，在这些基因的“指导”下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化为水溶性物质或低毒无毒物质，有的则被直接排出体外。某课题组进一步进行了如下图所示的实验操作，请据图回答：
(1)获得油菜素内酯基因的方法有______________、________________(举两种即可)。第①步用PCR技术扩增基因时用到的耐高温的酶通常是指______________。步骤②用到的酶有________________。
(2)图中导入重组质粒的方法是________。在导入之前应用________处理。
(3)导入重组质粒以后，往往还需要进行检测和筛选，可用________________制成探针，检测是否导入了重组基因；在培养基中加入________可将含有目的基因的细胞筛选出来。
(4)请你为该课题命名：_______________________________________________。
【解析】 进行基因工程操作时，首先要获取目的基因，其方法有多种：从基因文库中获取、人工合成或PCR合成等。在构建基因表达载体的过程中，用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。图中的受体细胞是细菌，故可用转化法导入表达载体，导入后，需检测和筛选。从图中可以看出，最终是通过对照实验来检测转基因细菌对土壤中残留农药的分解能力。
【答案】 (1)从基因文库中获取 人工合成或PCR合成 耐热的DNA聚合酶(或TaqDNA聚合酶) 限制酶和DNA连接酶
(2)转化法 氯化钙溶液
(3)红霉素抗性基因 红霉素
(4)油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解
第2课时 基因工程的实施过程
1．简述基因工程的一般过程。
2．理解获取目的基因的方法。(重、难点)
3．掌握将目的基因导入受体细胞的方法。(重点)
4．掌握目的基因的检测和鉴定方法。(重点)
获取目的基因和构建基因表达载体
1．获取目的基因
(1)通过基因文库获取目的基因：
①基因文库的含义：将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片段，分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。这个受体菌群体就被称为基因文库。
②种类：
a．基因组文库：含有一种生物所有的基因。
b．部分基因文库：含有一种生物的一部分基因。
(2)利用PCR技术扩增目的基因：
①原理：DNA分子半保留复制。
②场所：生物体外(PCR仪)。
③优点：操作简单、容易掌握、结果可靠、较短时间内大量扩增。
④发明家：美国科学家穆里斯。
(3)通过化学方法直接人工合成目的基因：
①仪器：DNA合成仪。
②基因特点：比较小、脱氧核苷酸序列已知。
2．构建基因表达载体
(1)目的：使目的基因进入受体细胞并有效表达，能稳定存在且遗传给后代。
(2)组成：一个基因表达载体除了目的基因外，还应包括启动子、终止子和标记基因等。
基因表达载体的构建是基因工程的核心，下面图1为基因表达载体的构建过程图，图2为基因表达载体模式图。请据图分析：
图2
探讨：图1中的①是什么物质？切割目的基因和载体要选用同一种①吗？为什么？
提示：限制性核酸内切酶。选用同一种①，因为：选用同一种限制性核酸内切酶切割会产生相同的黏性末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。
探讨：图1中②是什么物质？试探讨用②连接目的基因和载体DNA时产生几种可能的连接方式？哪一种是符合要求的连接方式。
提示：DNA连接酶。可能有3种连接方式，即目的基因和目的基因相连、载体DNA和载体DNA相连、目的基因和载体DNA相连。其中符合要求的是目的基因和载体DNA相连形成的重组DNA分子。
探讨：图2中的抗生素抗性基因属于什么基因？能否将目的基因插入该基因中？为什么？
提示：标记基因。不能。标记基因用于鉴定受体细胞是否成功导入目的基因，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进一步筛选。
1．获取目的基因
(1)来源。
目的基因可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工方法合成。
(2)具体方法。
①从已有的物种中分离：从基因文库中提取目的基因。
②化学合成法：对于比较小，核苷酸序列已知的目的基因一般用人工合成的方法。如已知氨基酸序列，合成DNA。
③反转录法：它是以目的基因的mRNA为模板，合成碱基互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA。
④利用PCR技术扩增目的基因。
a．PCR的含义：一项在生物体外通过酶促反应有选择地大量扩增目的基因或DNA序列的技术。
b．目的：短时间内大量扩增目的基因或DNA序列。
c．原理：DNA分子半保留复制。
d．特点：操作简单、易掌握、结果可靠，能在短时间内大量复制目的基因或DNA序列。
e．步骤：第一步，向离心管加入模板、原料、引物及Taq DNA聚合酶。
第二步，加热至94 ℃，双链DNA解旋为单链DNA。
第三步，冷却至55 ℃，引物与两条单链DNA上的特定部位相互配对。
第四步，加热至72 ℃，热稳定DNA聚合酶(Taq聚合酶)从引物起始进行互补链的合成。
如此重复循环多次。
f．特点：指数形式扩增。
2．PCR技术扩增目的基因与DNA复制的比较
PCR技术
DNA复制
相同点
原则
碱基互补配对
原料
四种脱氧核苷酸
条件
模板、ATP、酶
不同点
解旋方式
DNA在高温下
变性解旋
解旋酶催化
场所
体外复制
细胞核内
酶
热稳定的DNA
聚合酶(Taq聚
合酶)
细胞内含有的
DNA聚合酶
结果
在短时间内形成
大量的DNA片段
形成整个DNA
分子
[特别提醒]
提取目的基因的三种方法的应用情况
(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过用受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中去获取目的基因。
(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可以通过DNA合成仪利用化学方法人工合成。
(3)如果知道扩增目的基因及两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，则可以通过PCR技术扩增目的基因。
3．构建基因表达载体
(1)基因表达载体结构。
(2)分析。
①启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于目的基因上游的一段核苷酸序列，是RNA聚合酶识别和结合的部位。
②目的基因：编码相关蛋白质，并形成基因工程产品或产生新的生物性状。
③终止子：一段有特殊结构的DNA片段，位于目的基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。
④标记基因：一般为抗生素抗性基因或荧光蛋白基因等，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因(或目的基因是否导入成功)。
(2)基因表达载体的功能。
将目的基因导入受体细胞并使之有效表达。
(3)基因表达载体的构建步骤。
①用同一种限制酶切割目的基因和质粒，使其产生相同末端。
②将切下的目的基因片段与切开的质粒混合，再加入适量DNA连接酶，使目的基因插入质粒的切口处，形成一个重组DNA分子(重组质粒)。
[特别提醒]
启动子和终止子、起始密码子与终止密码子的区别
(1)启动子和终止子都在DNA上，在遗传信息转录时起作用。启动子是启动转录的开始，终止子是DNA分子上决定转录停止的一段DNA序列，其组成单位都是脱氧核苷酸。
(2)起始密码子和终止密码子都是mRNA上三个相邻碱基。起始密码子决定翻译的开始，终止密码子决定翻译的停止。
1．下列属于获取目的基因的方法的是( )
【导学号：10210013】
①利用mRNA反转录形成 ②从基因文库中提取 ③从受体细胞中提取 ④利用PCR技术 ⑤利用DNA转录 ⑥人工合成
A．①②③⑤ B．①②⑤⑥
C．①②③④ D．①②④⑥
【解析】 获取目的基因的方法包括从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术扩增目的基因和利用DNA合成仪用化学方法直接人工合成。目的基因属于外源基因，不能从受体细胞中提取，利用DNA转录合成的是RNA，不是目的基因。
【答案】 D
2.
右图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ的酶切位点， ampr为青霉素抗性基因，tetr为四环素抗性基因，P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoR Ⅰ，BamH Ⅰ在内的多种酶的酶切位点。据图回答：
(1)将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoR Ⅰ酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有_______________________________________________、
____________、____________三种。
(2)用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有____________；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有____________。
(3)目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是____________，其合成的产物是____________。
(4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是__________________。
【解析】 (1)将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoR Ⅰ酶切，所产生的黏性末端相同，用DNA连接酶处理后，不同的片段随机结合，可形成3种不同的连接物：目的基因——目的基因、目的基因——载体、载体——载体。(2)在上述三种产物中，插入目的基因的都不能在四环素培养基上生长，只有载体——载体连接产物才能在含四环素的培养基上生长。(3)启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，可启动转录过程，合成mRNA。(4)由图示和题目中提供的信息可知，同时运用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行酶切可有效防止酶切后产生的末端发生任意连接。
【答案】 (1)目的基因——载体连接物 载体——载体连接物 目的基因——目的基因连接物
(2)载体——载体连接物 目的基因——载体连接物、载体——载体连接物
(3)启动子 mRNA (4)EcoR Ⅰ和BamHⅠ
目 的 基 因 的导 入、 检 测 和 鉴 定
1．导入目的基因
(1)将目的基因导入植物细胞最常用的是农杆菌转化法。
(2)将目的基因导入动物细胞常用的是显微注射法。
(3)将目的基因导入微生物细胞常用的方法是Ca2＋处理法。
2．检测和鉴定目的基因
(1)从DNA水平检测：DNA分子杂交法。
(2)从RNA水平检测重组体：分子杂交技术。
(3)从蛋白质水平检测：抗原—抗体杂交。
(4)从个体水平对其生物学特定性状进行检测。
将苏云金芽孢杆菌(图一)的毒蛋白基因提取出来导入普通棉花(图二)细胞可培育成转基因抗虫棉(图三)，依据以上内容探究以下问题。
探讨：为什么植物的体细胞可以作为受体细胞，而动物的体细胞不能作为受体细胞？
提示：植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物体细胞全能性受到限制，不能发育为一个新个体，因此动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。
探讨：从细胞器的功能上分析，若通过基因工程生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌作受体细胞吗？
提示：不可以。糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。
探讨：检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？
提示：用叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。
探讨：DNA分子杂交的原理是什么？有哪些应用？
提示：碱基互补配对原则。可用于亲子鉴定、刑事侦查、生物亲缘关系鉴定等。
1．导入目的基因
目的基因导入受体细胞的方法。
细胞类型
方法
转化过程
特点
植物细胞
农杆菌转化法
目的基因插入到Ti质粒的TDNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达
经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物
动物细胞
显微注射法
目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
最为有效的将目的基因导入动物细胞的方法
微生物细胞
Ca2＋处理法
Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体与感受态细胞混合在缓冲液中→一定温度下促使感受态细胞吸收DNA分子
简便、经济、有效
[特别提醒]
(1)将目的基因导入植物细胞培育转基因植物时，受体细胞可以是体细胞和受精卵，因为植物体细胞具有全能性。
(2)将目的基因导入动物细胞培育转基因动物时，受体细胞是受精卵，不能用体细胞，因为高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。
(3)微生物细胞作为受体细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等优点。
(4)将基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌的常用方法是Ca2＋处理法。Ca2＋(或CaCl2溶液)对微生物细胞的作用是增加细胞壁的通透性。
2．检测和鉴定目的基因
检测水平
检测内容
方法
结果显示
分子水平的检测
检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因
DNA分子杂交技术(基因探针＋转基因生物的DNA)
是否显示出杂交带
检测目的基因是否转录
分子杂交技术(基因探针＋转基因生物的mRNA)
是否显示出杂交带
检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗原—抗体杂交
是否显示出杂交带
个体水平的检测
包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度；基因工程产品需要与天然产品进行活性比较等
[特别提醒]
不同分子检测的原理、场所、探针的异同
(1)进行转录水平的检测原理与复制水平的检测原理是相似的，只是被检测的物质不再是转基因生物的基因组DNA，而是转基因生物的细胞内的mRNA；进行翻译水平的检测，则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。
(2)不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。
(3)在DNA分子，mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。
1．(2016·长春高二检测)基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，主要原因是( )
A．结构简单，操作方便 B．繁殖速度快
C．遗传物质含量少 D．性状稳定，变异少
【解析】 目的基因导入受体细胞后，随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌等微生物繁殖速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。因此，基因工程常用的受体细胞有细菌、真菌等。
【答案】 B
2．科学家通过基因工程方法，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。其过程大致如图所示。根据题意，回答下列问题。 【导学号：10210014】
(1)基因工程操作程序的一般步骤是____________、____________、____________、________。
(2)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有TDNA，把目的基因插入Ti质粒的TDNA中是利用TDNA的______________________________________的特点。
(3)将目的基因导入受体细胞的方法有很多种，该题中涉及的是______________。
(4)若目的基因能在棉株体内稳定维持和表达，主要是因为_______________________________________________，
分子水平检测目的基因是否表达的方法是______________。
【解析】 本题以抗虫棉的培育为背景，考查了运用基因工程技术培育转基因作物的步骤、方法，农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法利用它能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，以及其Ti质粒上的TDNA能转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上的特点，可以把目的基因插入其Ti质粒的TDNA中，借助其作用使目的的基因成功导入受体细胞。
【答案】 (1)获取目的基因 构建基因表达载体 导入目的基因 检测和鉴定目的基因
(2)可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上
(3)农杆菌转化法
(4)目的基因插入了受体细胞的染色体DNA中 抗原—抗体杂交
1．下列不属于获取目的基因的方法的是( )
A．利用DNA连接酶复制目的基因
B．化学方法直接合成
C．从基因文库中获取目的基因
D．利用PCR技术扩增目的基因
【解析】 本题考查目的基因的获取方法及DNA聚合酶和DNA连接酶的区别。对目的基因(DNA片段)进行复制需利用DNA聚合酶而不是DNA连接酶。
【答案】 A
2．(2016·仙桃模拟)基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的是( ) 【导学号：10210015】
A．目的基因与载体的结合
B．将目的基因导入受体细胞
C．目的基因的表达
D．目的基因的人工合成
【解析】 合成目的基因及其与载体的结合都有碱基互补配对过程，而目的基因进入受体细胞是通过载体的运输作用进入，不存在碱基互补配对过程。
【答案】 B
3．要检测目的基因是否成功地插入受体DNA中，需要用核酸探针，核酸探针是指( )
A．用于检测疾病的医疗器械
B．用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子
C．合成β球蛋白的DNA
D．合成苯丙羟化酶的DNA片段
【解析】 核酸是指已知核苷酸序列的DNA片段(实际上是单链)，为了便于对杂交结果进行检测，需要对其做放射性同位素或荧光分子标记。
【答案】 B
4．下列关于基因工程的叙述，错误的是( )
A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物
B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶
C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性
D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达
【解析】 基因工程中目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物；常用的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶；人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性，只有经过一定的物质激活以后，才有生物活性；载体上的抗性基因主要是有利于筛选含重组DNA的细胞，不能促进目的基因的表达。所以D错误。
【答案】 D
5．以下有关基因工程的叙述，正确的是( )
A．利用PCR技术可以大量扩增目的基因
B．目的基因导入受体细胞最常用的方法是农杆菌转化法
C．用同一种限制酶分别切割载体和目的基因的目的是能够产生不同的黏性末端
D．利用载体上标记基因的相关特性就可检测出目的基因已导入受体细胞并成功表达
【解析】 将目的基因导入植物细胞最常用的是农杆菌转化法，导入动物细胞最常用的是显微注射技术，导入大肠杆菌最常用的转化方法是Ca2＋处理法；用同一种限制酶分别切割载体和目的基因的目的是能够产生相同的黏性末端；利用载体上的标记基因可以检测出目的基因是否导入受体细胞，但不能检测目的基因是否表达。
【答案】 A
课堂小结：
网络构建
核心回扣
1.基因工程的操作步骤：获取目的基因→构建基因表达载体→目的基因的导入→目的基因的检测与鉴定
2.获取目的基因的三种方法：基因文库直接获得、PCR扩增、人工合成。
3.基因表达载体的构成：目的基因、启动子、终止子、标记基因等。
4.导入目的基因的方法有：农杆菌转化法、显微注射法、Ca2＋处理法。
5.检测目的基因方法：DNA分子杂交法、DNA—RNA分子杂交、抗原—抗体杂交、个体水平检测。
学业分层测评(二)
(建议用时：45分钟)
[学业达标]
1．下列关于基因表达载体导入微生物细胞的叙述中，不正确的是( )
A．常用原核生物作为受体细胞，是因为原核生物繁殖快，且多为单细胞，遗传物质相对较少
B．受体细胞所处的一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态称为感受态
C．感受态细胞吸收DNA分子需要适宜的温度和酸碱度
D．感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子的液体只要调节为适宜的pH即可，没必要用缓冲液
【解析】 将基因表达载体导入微生物细胞时，需在一定条件(如适宜的温度、pH等)下，将基因表达载体和感受态的微生物细胞混合培养，在培养过程中，可能会影响pH的变化，因此要加入缓冲液，以保持适宜的pH。
【答案】 D
2．(2016·湖北期中联考)在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是( )
【导学号：10210016】
A．用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸
B．用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体
C．将重组DNA分子导入烟草原生质体
D．用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞
【解析】 限制酶一般只切断DNA分子双链，而烟草花叶病毒是RNA病毒，DNA连接酶是连接目的基因和运载体，将重组DNA分子导入烟草原生质体是利用农杆菌转化法，根据能在含除草剂的培养基上能生长的是转基因烟草细胞，所以选A。
【答案】 A
3．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是( )
A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因
B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA
C．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列
D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白
【解析】 基因的表达即控制蛋白质的合成，只有合成了相应的蛋白质才能证明目的基因完成了在受体细胞中的表达。
【答案】 D
4．下列有关基因工程技术的正确叙述是( )
A．重组DNA技术所用的工具酶是限制性核酸内切酶、连接酶、载体
B．为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞
C．选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快
D．只要目的基因进入了受体细胞就能成功表达
【解析】 A项中的载体不是酶；B项中的受体细胞常用受精卵，但有时也可用植物体细胞；D项中，目的基因进入受体细胞并不一定能成功表达。
【答案】 C
5．下列获取目的基因的方法中需要模板链的是( )
【导学号：10210017】
①从基因文库中获取目的基因
②利用PCR技术扩增目的基因
③逆转录法
④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成
A．①②③④ B．①②③
C．②③④ D．②③
【解析】 PCR利用的是DNA双链复制原理，即将双链DNA之间的氢键打开，变成单链DNA，作为聚合反应的模板。逆转录法则是以目的基因转录成的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，先逆转录形成互补的单链DNA，再合成双链的DNA。①④则均不需要模板。
【答案】 D
6．以下关于基因工程的叙述，正确的是( )
A．获得目的基因需用限制性核酸内切酶和DNA连接酶
B．DNA连接酶的作用是将两个黏性末端的碱基连接起来
C．可通过农杆菌的感染以实现目的基因导入受体细胞
D．载体上的标记基因有利于与外源基因连接并筛选转化细胞
【解析】 获得目的基因只需用限制性核酸内切酶，构建重组质粒需用限制性核酸内切酶和DNA连接酶，A错误；DNA连接酶的作用是将两个黏性末端的磷酸二酯键连接起来，B项错误；通过农杆菌的感染以实现重组质粒导入受体细胞，培育出转基因生物，C正确；载体上的标记基因有利于筛选含重组DNA的细胞，D错误。
【答案】 C
7．下图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。下列相关叙述中正确的是( )
A．三种方法都需酶并均在体外进行
B．①②③碱基对的排列顺序均相同
C．三种方法均属人工合成法
D．方法a不遵循中心法则
【解析】 这三种方法都是在体外进行的，且都用到酶(方法a需要逆转录酶和DNA聚合酶、方法b需要限制酶、方法c需要DNA聚合酶)，A正确；方法a得到的目的基因不含有内含子，方法c得到的目的基因的碱基序列可能有多种，因此①②③碱基对的排列顺序不都相同，B错误；图示a和c属于人工合成法，而b是从供体细胞的DNA中直接分离基因的方法，C错误；方法a遵循碱基互补配对原则，D错误。
【答案】 A
8．下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是( ) 【导学号：10210018】
A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得
B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点
C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来
D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
【解析】 A项，胰岛素基因只能在胰岛B细胞中表达，不能在肝细胞中表达，因而不能通过人体肝细胞mRNA反转录获得。B项，复制原点是表达载体复制的起点，胰岛素基因表达的起点是启动子。C项，基因表达载体中一般以抗生素抗性基因为标记基因，因此可借助抗生素抗性基因将含有胰岛素基因的受体细胞筛选出来。D项，终止密码子是翻译终止的信号，不是转录终止的信号。
【答案】 C
9．(多选)(2013·江苏高考)小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因(目的基因)后再重组表达。下列相关叙述正确的是( )
A．设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列
B．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列
C．PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶
D．一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞
【解析】 设计引物时应当考虑由此扩增的目的基因与载体两端的序列进行互补配对；PCR体系中应用耐高温的DNA聚合酶，而不是从受体细胞中提取的普通DNA聚合酶。
【答案】 BD
10．请据图回答下列问题。
(1)利用________技术可以获得大量的目的基因。该技术利用____________的原理，将基因的核苷酸序列不断加以复制，使其数量呈指数增长。
(2)图中________位于基因的首端，是________识别和结合的部位。抗生素基因的作用是作为________，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因。
【解析】 目的基因的获取方法很多，其中PCR技术能迅速获得大量目的基因，其依据的原理是DNA双链复制原理；基因表达载体必须包含目的基因、启动子、标记基因、终止子，其中启动子位于目的基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录为mRNA，抗生素抗性基因作为标记基因用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因。
【答案】 (1) PCR DNA双链复制 (2)启动子 RNA聚合酶 标记基因
[能力提升]
11．采用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵，培育出了转基因羊。但是，人凝血因子只存在于该转基因羊的乳汁中。以下有关叙述，正确的是( )
A．人体细胞中凝血因子基因编码区的碱基对数目，等于凝血因子氨基酸数目的3倍
B．可用显微注射技术将含有人凝血因子基因的重组DNA分子导入羊的受精卵中
C．在该转基因羊中，人凝血因子基因存在于乳腺细胞，而不存在于其他体细胞中
D．人凝血因子基因开始转录后，DNA连接酶以DNA分子的一条链为模板合成mRNA
【解析】 人体细胞是真核细胞，其基因中含有内含子，其碱基对数大于氨基酸数的三倍；山羊的受精卵中导入人凝血因子基因，长成的山羊每个体细胞中都含有这种基因；DNA连接酶是把两条DNA链末端之间的缝隙“缝合”起来，而不是参与转录。基因工程外源基因的导入多采用人工的方法，使体外重组的DNA分子转移到受体细胞，在本题中可采用显微注射法。
【答案】 B
12．人们试图利用基因工程的方法，用乙种生物生产甲种生物的一种蛋白质。生产流程是：甲生物的蛋白质→mRNA目的基因与质粒DNA重组导入乙细胞获得甲生物的蛋白质，下列说法正确的是( ) 【导学号：10210019】
A．①过程需要的酶是逆转录酶，原料是A、U、G、C
B．②要用限制性核酸内切酶切断质粒DNA，再用DNA连接酶将目的基因与质粒连接在—起
C．如果受体细胞是细菌，可以选用枯草杆菌、炭疽杆菌等
D．④过程中用的原料不含有A、U、G、C
【解析】 ①过程是逆转录，利用逆转录酶合成DNA片段，所需要的原料含有A、T、G、C；②是目的基因与质粒DNA重组阶段，需要用限制性核酸内切酶切断质粒DNA，再用DNA连接酶将目的基因与质粒连接在一起；③如果受体细胞是细菌，则不应该用致病菌，而炭疽杆菌是致病菌；④过程是基因的表达过程，原料中含有A、U、G、C。
【答案】 B
13．(双选)(2014·广东高考)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如下图所示，下列叙述正确的是( )
A．过程①需使用逆转录酶
B．过程②需使用解旋酶和PCR获取目的基因
C．过程③使用的感受态细胞可用NaCl溶液制备
D．过程④可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞
【解析】 ①过程是逆转录过程，需要逆转录酶催化；从cDNA文库中获取所需要的目的基因，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置或基因翻译产物蛋白质等特性来获取，不需要用解旋酶，也不需要PCR；用CaCl2溶液处理大肠杆菌，可使其成为感受态细胞；鉴别目的基因是否导入受体细胞可利用DNA分子杂交技术。
【答案】 AD
14．如图是从酵母菌获取某植物需要的某种酶基因的流程，结合所学知识及相关信息回答下列问题：
(1)图中cDNA文库________基因组文库(填“大于”“等于”或“小于”)。
(2)①过程提取的DNA需要________的切割，B过程是________。
(3)为在短时间内大量获得目的基因，可用________扩增的方法。目的基因获取之后，需要进行____________，其组成必须有________________________以及标记基因等，此步骤是基因工程的核心。
(4)将该目的基因导入某双子叶植物细胞，常采用的方法是________________，其能否在此植物体内稳定遗传可以用________技术进行检测。
【解析】 (1)cDNA文库小于基因组文库。(2)提取目的基因需要限制酶，逆转录法获得目的基因需要逆转录酶。(3)短时间内大量获得目的基因，可用PCR技术扩增的方法。基因表达载体的组成必须有目的基因、标记基因、启动子和终止子，基因表达载体的构建是基因工程的核心。(4)将目的基因导入某双子叶植物细胞常采用的方法是农杆菌转化法，目的基因只有整合到植物细胞的染色体上才能在植物体内稳定遗传，可通过DNA分子杂交的方法对目的基因是否整合到染色体上进行检测。
【答案】 (1)小于 (2)限制酶 反转录(或逆转录) (3)PCR技术 基因表达载体的构建 启动子、终止子、目的基因 (4)农杆菌转化法 DNA分子杂交
15．科研人员研究发现，一种植物激素——油菜素内酯能促进农药在植物体内的降解和代谢。研究人员发现，用油菜素内酚处理后，许多参与农药降解的基因(如P450)的表达和酶活性都得到提高，在这些基因的“指导”下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化为水溶性物质或低毒无毒物质，有的则被直接排出体外。某课题组进一步进行了如下图所示的实验操作，请据图回答：
(1)获得油菜素内酯基因的方法有______________、________________(举两种即可)。第①步用PCR技术扩增基因时用到的耐高温的酶通常是指______________。步骤②用到的酶有________________。
(2)图中导入重组质粒的方法是________。在导入之前应用________处理。
(3)导入重组质粒以后，往往还需要进行检测和筛选，可用________________制成探针，检测是否导入了重组基因；在培养基中加入________可将含有目的基因的细胞筛选出来。
(4)请你为该课题命名：_______________________________________________。
【解析】 进行基因工程操作时，首先要获取目的基因，其方法有多种：从基因文库中获取、人工合成或PCR合成等。在构建基因表达载体的过程中，用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。图中的受体细胞是细菌，故可用转化法导入表达载体，导入后，需检测和筛选。从图中可以看出，最终是通过对照实验来检测转基因细菌对土壤中残留农药的分解能力。
【答案】 (1)从基因文库中获取 人工合成或PCR合成 耐热的DNA聚合酶(或TaqDNA聚合酶) 限制酶和DNA连接酶
(2)转化法 氯化钙溶液
(3)红霉素抗性基因 红霉素
(4)油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解
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