2023版创新设计高考生物（新教材人教版）总复习一轮讲义第35讲 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题

第35讲　基因工程及生物技术的安全性与伦理问题
内容要求——明考向
近年考情——知规律
（1）概述基因工程的诞生；（2）阐明基因工程的原理及技术（含PCR技术）；（3）举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的应用；（4）概述蛋白质工程的原理及应用；（5）举例说出日常生活中的转基因产品及影响；（6）中国禁止生殖性克隆人；（7）举例说明生物武器对人类的威胁；（8）DNA的粗提取与鉴定（活动）；（9）利用PCR扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验（活动）；（10）搜集文献资料，就“转基因食品是否安全”展开辩论（活动）；（11）搜集“转基因食品是否安全”及关于设计试管婴儿的资料（活动）。
2021·湖北卷（7）、2021·辽宁卷（24）、2021·天津卷（16）、2021·全国乙卷（38）、2021·山东卷（25）、2021·全国甲卷（38）、2021·河北卷（24）、2021·广东卷，（22）、2020·全国卷Ⅲ（38）、2019·全国卷Ⅰ（38）
考点一　重组DNA技术的基本工具与基本操作程序

1.基因工程的概念


2.基因工程的基本工具 3种工具，其中有2种工具酶
（1）限制性内切核酸酶　限制酶是一类酶，而不是一种酶

提醒　①将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
（2）DNA连接酶

（3）载体

3.基因工程的基本操作程序
（1）目的基因的筛选与获取
①目的基因的获取方法：人工合成目的基因、利用PCR获取和扩增目的基因、通过构建基因文库来获取目的基因。
②利用PCR获取和扩增目的基因


提醒　①在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
②引物是一小段单链的DNA或RNA，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
（2）基因表达载体的构建——核心
①目的：
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
②组成：

③构建过程：

（3）将目的基因导入受体细胞
只有该步骤没涉及到碱基互补配对原则

提醒　①农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入（非人工操作）是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
②导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
（4）目的基因的检测与鉴定


（1）DNA连接酶能将两碱基间的氢键连接起来（×）
（2）E.coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端（×）
（3）限制酶也可以识别和切割RNA（×）
（4）质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体（√）
（5）外源DNA必在位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制（×）
（6）用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物（√）
（7）用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列（√）
（8）为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体（×）
（9）应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达（×）





1.天然的质粒是否可以直接用做基因工程载体？为什么？
提示　不可以。具有能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点的质粒才可以直接用作基因工程的载体。实际上天然的质粒一般不完全具备上述条件，往往需要进行人工改造后才能用于基因工程操作。

2.PCR可以扩增mRNA吗？
提示　不可以，因为PCR是用DNA双链做模板的，不能直接用单链RNA做PCR，必须把mRNA逆转录成单链cDNA之后再做PCR。

3.你知道新型冠状病毒核酸检测试剂盒的检测原理吗？
提示　新型冠状病毒核酸检测试剂盒是用于快速进行体外定性检测新型冠状病毒的医疗检测用品，它的工作原理是通过提取病人样本中的RNA，进行反转录聚合酶链式反应（RT－PCR），通过扩增反应将样本中微量的病毒信息进行放大，最后以荧光的方式读取信号。如果PCR之后信号为阳性，那么就可以认为样本中存在病毒（已经感染），反之表明样本中没有病毒（未感染）。

1.限制酶的选择方法
根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因等来确定限制酶的种类。

（1）应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
（2）为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶（非同尾酶）切割目的基因所在片段和质粒（双酶切），如图甲可选择用Pst Ⅰ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点）。
（3）切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和筛选，如图乙中的质粒不能使用Sma Ⅰ切割。
2.标记基因的作用
标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞：

3.启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别

位置
作用
启动子
位于DNA分子上
RNA聚合酶识别和结合位点，启动转录过程
起始
密码子
位于mRNA分子上
决定翻译的开始
终止子
位于DNA分子上
决定转录的结束
终止
密码子
位于mRNA分子上
决定翻译的结束
4.农杆菌转化法分析

（1）构建基因表达载体需要两种工具酶：限制酶和DNA连接酶。
（2）基因表达载体（重组质粒）导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于感受态，有利于重组质粒的导入。
（3）将导入目的基因的受体细胞培育成完整的植株要用到植物组织培养技术。

考向1　基因工程的基本工具，考查科学思维能力
1.(不定项)(2022·章丘阶段性测试)图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，ampr表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是(　　)

A.图甲中的质粒用BamHI切割后，含有2个游离的磷酸基团
B.在构建重组质粒时，可用PstI和BamHI切割质粒和外源DNA
C.用PstI和HindⅢ切割，可以保证重组DNA序列的唯一性
D.导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长
答案　AC
解析　图甲中的质粒用BamHI切割后，获得一个DNA片段，其只含有2个游离的磷酸基团，A正确；在构建重组质粒时，不能使用BamHI切割外源DNA，因为用BamHI切割会破坏目的基因的结构，但可以用PstI和HindⅢ切割质粒和外源DNA，B错误；用PstI和HindⅢ切割质粒会得到2个DNA片段，再加入DNA连接酶，切开的质粒由于黏性末端不同，不会自身连接，从而保证只能得到一种符合要求的重组质粒，即含有目的基因和标记基因neo的重组质粒，保证了重组DNA序列的唯一性，C正确；由于用PstI切割质粒后，其中的氨苄青霉素抗性基因会被破坏，所以导入目的基因的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。
2.（2021·全国乙卷，38）用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。

回答下列问题：
（1）常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中
　　　　酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中　　　　　　　　酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是　　　　。
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能　　　　；质粒DNA分子上有　　　　　　　　，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是__________________________________________________________________。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指__________________________________。
答案　（1）EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ　EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ　（2）磷酸二酯键　（3）自我复制　限制酶切割位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞　（4）RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列
解析　（1）由题图可以看出，EcoRⅠ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E.coli DNA连接酶可用于连接黏性末端，T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。（2）DNA连接酶催化DNA链的5′端与另一DNA链的3′端生成磷酸二酯键。（3）复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中进行自我复制。质粒上有限制酶切割位点，该位点可被限制酶切开并使外源目的基因插入其中。若质粒DNA分子上有某种抗生素抗性基因，则可以用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。（4）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
考向2　结合PCR技术的应用，考查科学思维能力
3.（2021·湖北卷，16）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是（　　）
A.增加模板DNA的量
B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间
D.提高复性的温度
答案　D
解析　PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间，有利于双链DNA解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生，B错误；延长延伸的时间，有利于合成新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生，C错误；在一定温度范围内，选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合，D正确。
4.(不定项)(2022·济南质检)下图为利用PCR技术扩增特定DNA片段的部分示意图，图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列有关描述错误的是(　　)

A.利用PCR技术扩增目的基因时不需要解旋酶而需要耐高温的DNA聚合酶
B.引物是子链合成延伸的基础，子链沿着模板链的3′→5′方向延伸
C.从理论上推测，第四轮循环产物中只含有引物A的DNA片段所占的比例为15/16
D.在第三轮循环产物中才开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段且占1/2
答案　CD
解析　利用PCR技术扩增目的基因时不需要解旋酶，该过程中氢键的断裂是通过高温完成的，而子链延伸过程需要耐高温的DNA聚合酶，A正确；耐高温的DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即子链沿着模板链的3′→5′方向延伸，B正确；DNA复制为半保留复制，DNA复制4次，共形成24个DNA，其中2个DNA含有母链和子链(引物A或引物B)，(24－2)个DNA都含有子链(含有引物A和引物B)，因此，第四轮循环产物中只含有引物A的DNA片段所占的比例为1/16，C错误；第三轮循环共形成8个DNA，其中只有2个两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，含量为1/4，D错误。
考向3　结合基因工程的操作程序，考查科学实践能力
5.（2022·山东重点中学联考）某质粒上有Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题：

（1）将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是　　　　；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为　　　　。该方法中农杆菌的作用是__________________________________________________。
（2）在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用Hind Ⅲ和Sal Ⅰ两种酶的好处是________________________________________。
（3）含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？　　　　（填“是”或“否”）。为什么？________________________________________。
（4）将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B（含氨苄青霉素）和C（含四环素和氨苄青霉素）两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。

答案　（1）Ti质粒　T­DNA　感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上 （2）防止目的基因自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率；防止目的基因与质粒反向连接
（3）否　含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏
（4）

　如何筛选出含有目的基因的受体细胞
（1）原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如下图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
（2）被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。
（3）筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。

考点二　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定

1.DNA的粗提取与鉴定
（1）原理

（2）方法步骤

提醒　①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核（无DNA）。可选用鸡血细胞作为材料。
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定
（1）实验基础

（2）PCR实验操作步骤

（3）DNA的测定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
提醒　①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。

（1）在溶有DNA的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色（×）
（2）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精（√）
（3）进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃储存（×）
（4）在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关（×）



选择性必修3 P74“探究·实践”
1.DNA的粗提取实验中过滤能否用滤纸代替纱布？
提示　不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。
选择性必修3 P84“探究·实践”
2.DNA片段电泳鉴定的原理是什么？
提示　DNA分子在碱性条件下（pH 8.0的缓冲液）带负电，在电场力的驱动下，从负极向正极在琼脂糖凝胶的孔洞中蠕动；核酸染料带正电，在电场力的驱动下，从正极向负极运动，遇到DNA就嵌入其中完成染色，但这个颜色可见光下看不到，需要紫外光激发。

考向1　结合DNA的粗提取和鉴定，考查科学探究能力
1.(不定项)(2021·日照市期末)下列有关“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)
A.向放有洋葱的研钵中加入适量研磨液研磨后会释放DNA
B.将含DNA的上清液加入95%的冷酒精会出现白色丝状物
C.将丝状物加入2 mol/L的NaCl溶液的目的是为了溶解DNA
D.将丝状物直接加入二苯胺试剂中沸水浴冷却后会出现蓝色
答案　C
解析　将丝状物加入2 mol/L的NaCl溶液，DNA可以溶解在这个浓度的NaCl，而其他杂质不能溶解，从而达到去除杂质的目的，C错误。
2.（2021·山东卷，13）粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（　　）
A.加入适量的木瓜蛋白酶
B.37～40 ℃的水浴箱中保温10～15分钟
C.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精
D.加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→加入NaCl调节浓度至0.14 mol/L
答案　A
解析　粗提取DNA时，向鸡血细胞溶液中加入一定量的蒸馏水，鸡血细胞吸水涨破，释放内容物，过滤后DNA存在于滤液中，但DNA主要与蛋白质结合以染色体的形式存在，所以使用木瓜蛋白酶，可以分解蛋白质，DNA仍然存在于得到的滤液中，然后加入体积分数为95%的冷却的酒精，使其溶解度下降，DNA析出，呈白色丝状物。A正确；保温不会分解蛋白质，也不会析出DNA，B错误；C选项是最后析出DNA时使用，属于提纯步骤，C错误；加入NaCl调节浓度至2 mol/L，此浓度下DNA溶解度高，溶解在滤液中，而逐渐调节NaCl浓度至0.14 mol/L的过程中，DNA溶解度下降，会析出，与题干后面“得到的滤液中加入特定试剂……”不相符，D错误。
考向2　围绕DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查社会责任
3.(2022·东营期末)用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样(Marker)，2～10号为PCR产物；其中2号的模板为野生型植株DNA，3～9号模板为转基因植株的DNA，10号使用蒸馏水代替模板DNA。PCR时加入的模板DNA如图注所示。据此做出分析不合理的是(　　)

A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B.3号样品植株导入的目的基因一定能成功表达
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
答案　B
解析　PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。3～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A合理；3号PCR结果包含250～500 bp片段，包含目的基因，但导入的目的基因不一定能成功表达，B不合理；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C合理；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，D合理。
4.（2022·山东济南调研）人类胰岛素基因位于第11号染色体上，长度为8 416 bp，人类胰岛素的氨基酸序列已知。回答下列相关问题。

（1）上图是利用PCR技术获取人胰岛素基因的方法，除了此方法外，还可以利用的方法是______________________________________________。
（2）利用PCR技术获取人胰岛素基因，在缓冲液中除了要添加模板和引物外，还需要添加的物质有_____________________________________________。
（3）经过　　　　轮循环可以得到所需的目的基因，一个DNA分子经过5轮循环，需要引物A　　　　个，从PCR的过程和DNA分子的特点，试着写出设计引物需要注意的问题：___________________________________________、
______________________________________________（答出2点即可）。
（4）利用SDS－凝胶电泳分离不同DNA分子，迁移速度取决于　　　　　　　　。
（5）利用图示方法获取的目的基因，直接构建基因表达载体后导人大肠杆菌，
　　（填“能”或“不能”）表达出人胰岛素，理由是_________________________________________。
答案　（1）从基因文库获取或人工合成　（2）四种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶 （3）3　31　引物自身不能有互补序列；引物之间不能有互补序列　
（4）DNA分子的大小　（5）不能　因为此方法获得的目的基因中含有内含子，大肠杆菌无法正常识别内含子，而对内含子部分转录的mRNA进行翻译，导致合成的蛋白质出现错误
解析　（3）题图中引物A和引物B在DNA片段内部，根据PCR的过程和DNA分子半保留复制的特点可知，前两轮循环产生的4个DNA分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链，即目的基因。其过程图如下：

第一轮：

第二轮：
由①得到的DNA分子如下：

由②得到的DNA分子如下：

第三轮：由①可得

由②可得

从理论上推测，一个DNA分子经n次循环合成的DNA分子为2n个，脱氧核苷酸链数为2n＋1，新合成的脱氧核苷酸链数为2n＋1－2，而每合成一条脱氧核苷酸链需要一个引物，所以共需要消耗2n＋1－2个引物，即25＋1－2＝62个，其中引物A为31个。设计引物时需要注意以下几点：引物自身及引物之间不能有互补序列，以防止自身或相互连接，引物长度适当，引物能与目的基因两侧特异性结合等。（4）在凝胶中DNA分子的迁移速度与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。（5）图示获得的目的基因含有外显子和内含子，因此直接将含有此目的基因的表达载体导入大肠杆菌并不能表达出胰岛素，原因是大肠杆菌无法正常识别内含子而对内含子部分转录的mRNA进行翻译，导致合成的蛋白质出现错误。
考点三　基因工程的应用及蛋白质工程

1.基因工程的应用




提醒　乳腺生物反应器是利用转基因动物的乳汁生产药用蛋白，而膀胱生物反应器是利用转基因动物的尿液生产药用蛋白，乳腺生物反应器需是处于生殖期的雌性动物才可生产药用蛋白，而膀胱生物反应器则是任何生长期的雌雄动物均可生产。
2.蛋白质工程　第二代基因工程，可生产自然界中不存在的蛋白质
（1）概念
以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
（2）操作手段和结果

（3）基本思路

3.蛋白质工程与基因工程的区别和联系


（1）将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株（√）
（2）利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中（×）
（3）由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用（×）
（4）蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质（√）
（5）蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构（×）


1.基因工程培育的抗虫、抗病作物有哪些优点？
提示　减少环境污染，降低生产成本。

2.蛋白质工程为什么通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造？
提示　①蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；②改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传。

考向1　结合基因工程的应用考查科学探究的能力
1.（2021·山东威海一模）下列生物技术操作对遗传物质的改造，不能遗传给子代的是（　　）
A.将含胰岛素基因的表达载体转入大肠杆菌，筛选获得的基因工程菌
B.通过植物体细胞杂交获得的番茄—马铃薯杂种植株
C.将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗
D.将生长激素基因导入奶牛受精卵，培育出能分泌含生长激素乳汁的奶牛
答案　C
解析　将含胰岛素基因的表达载体转入大肠杆菌，筛选获得的基因工程菌可以通过二分裂的方式遗传给子代，A不符合题意；通过植物体细胞杂交获得的番茄—马铃薯杂种植株，遗传物质发生改变，可以通过无性繁殖遗传给子代，B不符合题意；将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞，只是淋巴细胞含有这个基因，其生殖细胞没有该基因，因此不能遗传给子代，C符合题意；将生长激素基因导入奶牛受精卵，受精卵含有生长激素基因，受精卵培育成的奶牛含有该基因，因此可以遗传给子代，D不符合题意。
2.(不定项)（2021·山东青岛期中）采用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵，培育出了转基因羊。但是，人凝血因子只存在于该转基因羊的乳汁中。以下有关叙述，正确的是（　　）
A.人体细胞中凝血因子基因编码区的碱基对数目等于凝血因子氨基酸数目的3倍
B.该技术的利用可以定向改变生物的遗传性状，使种群的基因库发生改变
C.在转基因羊中，人凝血因子基因存在于乳腺细胞，而不存在于其他体细胞中
D.人凝血因子基因开始转录后，RNA聚合酶以DNA分子的一条链为模板合成mRNA
答案　BD
解析　因为真核生物的基因中存在非编码区，而编码蛋白质的是编码区的外显子，并且终止密码子不编码氨基酸，所以凝血因子基因编码区的碱基对数目应大于凝血因子氨基酸数目的3倍，A错误；该技术可以定向改变生物的遗传性状（使转基因山羊的乳汁中含有人凝血因子），使种群的基因库发生改变，B正确；因为目的基因导入受精卵中，而转基因羊的每一个体细胞都是由受精卵有丝分裂而来的，所以转基因羊的所有体细胞都含有人凝血因子基因，C错误；人凝血因子基因开始转录后，RNA聚合酶以DNA分子的一条链为模板，同时以核糖核苷酸为原料催化合成mRNA，D正确。
考向2　结合蛋白质工程考查科学思维能力
3.(2021·济宁期末)新冠病毒通过表面刺突蛋白(S蛋白)的活性域(RBD)与人体细胞表面的ACE2受体相互作用感染细胞。科学家设计了一种自然界中不存在的蛋白质LCB1，可与S蛋白的RBD紧密结合，以干扰新冠病毒的感染。下列说法不合理的是(　　)
A.LCB1的结构可能与S蛋白的抗体有类似之处
B.S蛋白的RBD结构可以为设计LCB1提供信息
C.生产LCB1用到了基因工程的操作技术
D.可直接从细胞中获取基因用于LCB1的生产
答案　D
解析　S蛋白的抗体能与S蛋白RBD特异性结合，而根据题干可知：LCB1可与S蛋白RBD紧密结合，说明LCB1的结构可能与S蛋白的抗体类似，A正确；由于LCB1可与S蛋白RBD紧密结合，故LCB1可依据S蛋白的RBD结构进行设计，B正确；生产LCB1用到了蛋白质工程，其中一些步骤用到了基因工程的操作技术，例如人工合成DNA，C正确；由题意可知蛋白质LCB1是一种自然界中不存在的蛋白质，故不能从细胞中获取相应的基因，D错误。
4.(2021·聊城模拟)人体内的tPA蛋白能高效降解由血纤维蛋白凝聚而成的血栓，然而为心梗患者注射大剂量的基因工程tPA会诱发颅内出血，其原因是tPA与血纤维蛋白结合的特异性不高。研究证实，通过某技术，将tPA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，可制造出性能优异的改良tPA蛋白，进而显著降低出血副作用。下列叙述正确的是(　　)
A.该技术的关键是知道tPA蛋白基因的分子结构
B.该技术生产改良tPA蛋白的过程遵循中心法则
C.该技术是在蛋白质分子水平上直接改造蛋白质
D.该技术制造出的蛋白质在自然界早已存在
答案　B
解析　将tPA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸需要采用蛋白质工程技术，该技术的关键工作是了解tPA蛋白质的分子结构，A错误；该技术生产改良tPA蛋白的过程遵循中心法则，B正确；该技术是在基因分子水平上通过改造基因来实现对蛋白质的改造，C错误；该技术制造出的蛋白质是自然界不存在的蛋白质，D错误。
考点四　生物技术的安全性与伦理问题

1.转基因产品的安全性
（1）争论焦点：在转基因食品的安全性等方面发生激烈的争论。
（2）正确态度：理性看待转基因技术要做到建立在完备的相关科学知识基础之上；看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素的影响；要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。
（3）我国方针：研究上要大胆，坚持自主创新；推广上要慎重，做到确保安全；管理上要严格，坚持依法监管。
2.关注生殖性克隆人
（1）生殖性克隆和治疗性克隆
①生殖性克隆：是指通过克隆技术产生独立生存的新个体。
②治疗性克隆是指利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到治疗疾病的目的。
（2）我国禁止生殖性克隆人的“四不”原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验。
（3）警惕用细胞研究和人类基因组编写计划等新技术研究生殖性克隆人。
3.禁止生物武器
（1）生物武器
①种类：病菌类、病毒类和生化毒剂类等。
②特点：致病能力强，攻击范围广。
③散布途径：直接或者通过食物、生活必需品和带菌昆虫等散布。
（2）禁止生物武器
我国主张全面禁止和彻底销毁生物武器等各类大规模杀伤性武器。

（1）科学家将外源生长素基因导入动物体内，以提高动物的生长速率（×）
（2）转入油菜的抗除草剂基因，可能通过花粉传入环境中（√）
（3）如果转基因植物的外源基因源于自然界，则不会存在安全性问题（×）
（4）生殖性克隆和治疗性克隆两者有着本质的区别（√）
（5）“设计试管婴儿”与“试管婴儿”相比在植入前需要对胚胎进行遗传学诊断（√）
（6）中国政府禁止生殖性克隆，但不反对治疗性克隆（√）
（7）中国反对生物武器，但中国在特殊情况下可以生产生物武器（×）

考向　结合生物技术的安全性和伦理问题，考查社会责任
1.(2022·济南期末)20世纪70年代以后，一大批生物技术成果进入人类的生产和生活，特别是在医药和农业生产上发挥了极大的作用；甚至利用分子遗传学等知识和技术把改造生命的幻想变成现实；生物技术的发展在造福人类的同时也可能带来潜在的危害。下列有关生物技术的安全性与伦理问题描述正确的是(　　)
A.将目的基因导入叶绿体基因组可以有效地防止基因污染
B.经济、文化和伦理道德观念的不同不会影响人们对转基因技术的看法
C.生殖性克隆和治疗性克隆的结果本质是相同的，都会面临伦理问题
D.人体不会对转基因技术制造的具有超强的传染性和致病性的新型病原体产生免疫反应
答案　A
解析　因为叶绿体在细胞质里，受精卵中的叶绿体来自卵细胞，精子里没有，植物传粉只传精子，卵子不离开母本，所以将目的基因导入叶绿体基因组可以有效地防止基因污染，A正确；经济、文化和伦理道德观念的不同会影响人们对转基因技术的看法，B错误；生殖性克隆和治疗性克隆的结果本质是不相同的，生殖性克隆会面临伦理问题，C错误；转基因技术制造的具有超强的传染性和致病性的新型病原体也会引起人体产生免疫反应，D错误。
2.(不定项)（2021·山东百师联盟联考）2018年11月，世界首例免疫艾滋病的基因编辑婴儿诞生。这项研究用到了能够精确定位并修饰基因的基因编辑技术，即基因编辑时用约为头发二十分之一细的针把Cas9蛋白和特定的RNA引导序列注入受精卵中，对CCR5基因进行修改，预期婴儿出生后能天然抵抗人类免疫缺陷病毒，关于该技术的安全性问题，下列说法正确的是（　　）
A.基因编辑时，引导序列可能发生变异，导致剪切错误，造成不可预知的后果
B.经过基因编辑的个体，有可能影响基因选择性表达，而导致其他疾病的产生
C.将基因编辑技术应用于治疗性克隆，符合人类伦理道德
D.只要加强监管、完善法律法规、完善技术手段，不需担心基因编辑技术的安全性
答案　ABC
解析　基因编辑时的引导序列是RNA，RNA的碱基序列改变可能导致识别错误，导致剪切错误，造成不可预知的后果，A正确；基因编辑后，基因的序列发生改变，基因的表达具有选择性，可能会受到影响，基因选择性表达受干扰后，容易导致某些疾病的产生，B正确；生殖性克隆不符合人类伦理道德，治疗性克隆符合人类伦理道德，将基因编辑技术应用于治疗性克隆，符合人类伦理道德，C正确；可以加强监管、完善法律法规、完善技术手段，但基因编辑技术仍存在一定的安全性问题，D错误。
3.(2021·山东师范大学附中模拟)Leigh氏综合征是一种攻击神经系统的严重神经障碍，其致病基因位于线粒体DNA中。一位母亲约有1/4的线粒体携带有这种致病基因，她的前两个孩子因为患有Leigh氏综合征夭亡，她的第三个孩子因为接受另一名女性捐赠的健康基因而成为全球首个拥有“三个父母”的男婴。该“三亲”男婴的孕育过程如下图所示。下列说法错误的是(　　)

A.该技术可以有效降低生下血友病等严重遗传病婴儿的概率
B.Leigh氏综合征的遗传不遵循孟德尔的遗传规律
C.该健康男婴孕育的过程中依次使用了核移植、体外受精、动物细胞培养和胚胎移植等技术
D.该技术对DNA的修改能够遗传，涉及伦理争论
答案　A
解析　血友病是伴性遗传病，由细胞核基因控制，该技术主要降低细胞质遗传的概率，A错误；Leigh氏综合征的致病基因位于细胞质内，不遵循孟德尔的遗传规律，B正确；由图可知，该男婴的形成过程中，经过了核移植，体外受精、动物细胞培养、胚胎移植等过程，其遗传物质来自三个个体，C正确；该技术获得的男婴含有来自三个个体的遗传物质，对DNA的修改能够遗传，涉及伦理争论，D正确。
重温真题　经典再现
1.(2020·山东等级考，4)人体内一些正常或异常细胞脱落破碎后，其DNA会以游离的形式存在于血液中，称为cfDNA；胚胎在发育过程中也会有细胞脱落破碎，其DNA进入孕妇血液中，称为cffDNA。近几年，结合DNA测序技术，cfDNA和cffDNA在临床上得到了广泛应用。下列说法错误的是(　　)
A.可通过检测cfDNA中的相关基因进行癌症的筛查
B.提取cfDNA进行基因修改后直接输回血液可用于治疗遗传病
C.孕妇血液中的cffDNA可能来自脱落后破碎的胎盘细胞
D.孕妇血液中的cffDNA可以用于某些遗传病的产前诊断
答案　B
解析　癌症的发生是原癌基因和抑癌基因发生突变的结果，可通过检测cfDNA中的相关基因进行癌症筛查，A正确；cfDNA以游离的形式存在于血液中，进行基因修改后直接输回血液无法正常发挥功能，B错误；胎盘细胞来自胚胎，其DNA可进入孕妇血液中形成cffDNA，可用于某些遗传病的产前诊断，C、D正确。
2.（2020·北京卷，12）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。

为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（　　）
A.①＋③ B.①＋②
C.③＋② D.③＋④
答案　B
解析　图示中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，可利用导入的HMA3基因与外源高效启动子连接的特点进行检测，即需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，在引物①和③中应选择引物①，引物②和④中可选择任意一种，综合可得应选择的引物组合是①＋②，即B正确，A、C、D错误。
3.（2021·辽宁卷，24节选）PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0.9 kb（1kb＝1 000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
（1）为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经　　　　过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
（2）图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入　　　　和　　　　两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用　　　　（填“E.coliDNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”）。

图1
相关限制酶的识别序列及切割位点
名称
识别序列
及切割位点
名称
识别序列
及切割位点
Hind Ⅲ
A↓AGCTT
TTCGA↑A
EcoR Ⅰ
G↓AATTC
CTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTG
GTC↑GAC
Pst Ⅰ
CTGC↓AG
GA↑CGTC
Kpn Ⅰ
G↓GTACC
CCATG↑G
BamH Ⅰ
G↓GATCC
CCTAG↑G
注：箭头表示切割位点
（3）转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于　　　　的生理状态，以提高转化效率。
（4）将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2，　　　　号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。

图2
注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2 kb的DNA分子条带未出现在图中
答案　（1）逆转录　（2）EcoR Ⅰ　Pvit Ⅱ　T4DNA连接酶　（3）感受态　
（4）3
解析　（1）利用RNA获得cDNA的过程称为逆转录。（2）根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间。图1中可看出，两者之间存在于三种限制酶切点，但是由于KpnⅠ在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcoR Ⅰ和Pvit Ⅱ两种不同限制酶的识别序列；根据Pvit Ⅱ的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4 DNA连接酶连接质粒和目的基因。（3）转化时用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。（4）由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和质粒，如果用EcoR Ⅰ和Pvit Ⅱ两种酶切割重组质粒电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带，由于phb2基因大小为0.9 kb，所以对应菌落3的电泳图。
4.(2020·山东卷，25)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是________________________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________。
(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了_______________，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是_________________________________________________________
___________________________________________________________________。
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA(Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经________过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA，原因是_______________________________________________
___________________________________________________________________。
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为________，原因是____________________________________________________
____________________________________________________________________。

答案　(1)限制性内切核酸酶和DNA连接酶　转化　(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合　不发生　编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子　(3)逆转录(或：反转录)　引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或：引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)　(4)品系3　品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
解析　(1)限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开；DNA连接酶能将DNA片段拼接起来。将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶的参与。转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(2)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。Wx基因启动子序列的改变影响了RNA聚合酶与启动子的识别和结合，从而改变了Wx基因的转录水平，使直链淀粉合成酶基因的表达量改变。根据题干信息可知，基因编辑系统是对启动子序列进行定点编辑，由于编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子，所以与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列没有发生变化。(3)用提取的各品系胚乳中的总RNA合成总cDNA的过程为逆转录，需要逆转录酶的参与。由于引物能与Wx基因的cDNA特异性结合，故通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA。(4)mRNA是蛋白质合成的直接模板，根据题图分析可知，4个品系中品系3的Wx mRNA量最低，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强。
5.（2021·河北卷，24）采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白（YCFl）基因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
（1）为获取YCFl基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为　　　　。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是　　　　　　。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是　　　　　　　　　。
（3）进行前期研究时，将含有YCFl基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是　　　　　　　　。研究者进一步获得了转YCFl基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是　　　　　　　　　　。
（4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同器官中Cd含量（图2）。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的　　　　（填“耐性”或“富集能力”）；据图2可知，对转基因植株的　　　　进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。

（5）已知YCFl特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于　　　　　　　　　　　　　　　　（写出两点即可）。
答案　（1）基因文库　（2）限制酶和DNA连接酶　供重组DNA的鉴定与选择　（3）农杆菌转化法　避免目的基因在自然界中传播　（4）耐性　叶　（5）转基因杨树可利用Cd转运蛋白将Cd搬运至液泡内，防止Cd破坏细胞核以及各种细胞器，减少Cd对细胞的损伤　杨树是多年生植物，更有利于持续储存Cd，且杨树更高大，吸收的Cd更多（写出两点即可）
解析　（1）将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。（2）构建基因表达载体时，需用限制酶分别切割含目的基因的DNA和质粒，用DNA连接酶将目的基因片段与切割后的质粒连接。基因表达载体上的标记基因可用来鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。（3）将目的基因导入植物细胞的常用方法是农杆菌转化法。用不育杨树株系作为实验材料可避免花粉传播造成的基因污染问题。（4）从题图1可知，转基因植株的干重比野生型大，说明其对Cd的耐性更强。由题图2可知，与野生型相比，转基因植株叶中Cd含量比根和茎中Cd含量增加的幅度大，因此对转基因植株的叶进行后续处理，更有助于缓解土壤Cd污染。（5）由于YCFl特异定位于植物细胞的液泡膜上，可将Cd转运至液泡中，防止Cd破坏细胞核以及各种细胞器，减少Cd对细胞的损伤，从而使转基因杨树能更好地适应高Cd环境。相对于草本植物，杨树是多年生植物，更有利于持续储存Cd，且杨树更高大，对Cd污染土壤的修复更具优势。

课后·分层训练
（时间：35分钟）

考点一　重组DNA技术的基本工具与基本操作程序
1.(2021·青岛期末)下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是(　　)
限制酶名称
识别序列和
切割位点
限制酶
名称
识别序列和
切割位点
BamHⅠ
G↓GATCC
KpnⅠ
GGTAC↓C
EcoRⅠ
C↓AATTC
Sau3AⅠ
↓GATC
HindⅡ
GTY↓RAC
SmaⅠ
CCC↓GGG
(注：Y＝C或T，R＝A或G)
A.HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B.Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C.BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
答案　D
解析　HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶沿着中轴线切口切开，切割后形成平末端，A正确；Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B正确；BamHⅠ限制酶识别GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C正确；一种限制酶也可以识别两种核苷酸序列，如Sau3AⅠ能识别GATC，也能识别GGATCC，D错误。
2.(不定项)(2021·山东滨州期末)如图表示培育转基因抗冻番茄的流程图，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。图示各种限制酶的识别序列均不相同。下列说法错误的是(　　)

A.①过程中应选择限制酶AluⅠ和PstⅠ对Ti质粒进行切割
B.②过程需用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于能吸收DNA分子的状态
C.④过程中农杆菌侵染根细胞后将Ti质粒整合到染色体上
D.⑤过程的不同阶段应适当调整培养基中植物激素的比例
答案　AC
解析　目的基因两侧是限制酶PstⅠ和SmaⅠ的识别序列，且质粒上也含有这两种限制酶的切割位点，所以可同时选用限制酶PstⅠ、SmaⅠ对含目的基因的DNA进行切割，A错误；②表示将目的基因导入受体细胞的过程，常用农杆菌转化法，用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于感受态，更容易吸收DNA分子，B正确；图中过程④侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的TDNA整合到染色体DNA分子上，而不是重组Ti质粒整合到染色体上，C错误；⑤过程不同阶段的培养基中细胞分裂素和生长素的比例不同，应在不同阶段适当调整培养基中植物激素的比例，D正确。
3.（2021·山东济宁联考）图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述错误的是（　　）

A.若通过PCR获取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙
B.图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ剪切
C.若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用Ca2＋处理法
D.在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达
答案　D
解析　通过PCR获取目的基因时，两种引物分别和目的基因的两条单链结合，并沿相反的方向合成子链，故选用引物甲和引物丙，A正确；由甲图可知，选用BamHⅠ会破坏两种抗性基因，结合乙图可确定应选择BclⅠ和HindⅢ剪切，B正确；将目的基因导入大肠杆菌常采用Ca2＋处理法，C正确；构建重组质粒时目的基因插入氨苄青霉素抗性基因中，故氨苄青霉素抗性基因被破坏不能表达，D错误。
考点二　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
4.(2022·山东重点中学联考)下列关于DNA粗提取与鉴定及DNA片段的扩增与电泳鉴定的叙述，正确的是(　　)
A.用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量相近
B.使用二苯胺试剂能有效测定不同提取液中DNA的纯度差别
C.PCR扩增的DNA片段在琼脂糖凝胶中迁移的速率与凝胶浓度、DNA分子大小等有关
D.PCR扩增4次循环后，得到的含有两种引物的DNA片段所占比例为1/8
答案　C
解析　猪是哺乳动物，哺乳动物的成熟红细胞中没有细胞核，不含DNA，因此用同样方法从等体积猪血和鸡血中提取的DNA量不是相近的，A错误；DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂只能鉴定DNA的有或无，不能测定DNA的纯度，B错误；PCR扩增的DNA片段在琼脂糖凝胶中迁移的速率与凝胶浓度、DNA分子大小等有关，C正确；PCR扩增4次即DNA复制4次，共形成16个DNA，根据半保留复制，有2个子代DNA含有其中一种引物，14个子代DNA同时含有两种引物，因此同时含有两种引物的DNA占14/16＝7/8，D错误。
考点三　基因工程的应用及蛋白质工程
5.（2022·山东泰安期末）中华鲟是地球上最古老的脊椎动物之一，被誉为“水中大熊猫”。研究者试图利用蛋白质工程技术改造中华鲟体内的某些蛋白质，使其更加适应现在的水域环境。以下说法错误的是（　　）
A.该工程可以定向改变蛋白质分子的结构
B.改造蛋白质是通过改造基因而实现的
C.中华鲟的相关蛋白质被改造的过程同样遵循中心法则
D.改造后的中华鲟产生的后代不具有改造后的蛋白质
答案　D
解析　可以通过改造基因来定向改变蛋白质分子的结构，A、B正确；蛋白质工程的设计思路实际上是中心法则的逆推，因此中华鲟的相关蛋白质被改造的过程同样遵循中心法则，C正确；蛋白质工程改造的是基因，可以遗传给子代，因此改造后的中华鲟产生的后代也具有改造后的蛋白质，D错误。
6.(不定项)（2022·长沙市质检）红细胞生成素（EPO）是体内促进红细胞生成的一种激素物质，是当今最成功的基因工程药物，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，目前临床使用的红细胞生成素主要来自基因工程技术生产的重组人红细胞生成素（rhEPO）。其简要生产流程如图，下列相关叙述正确的是（　　）

A.过程①用到的工具酶有DNA聚合酶、限制酶和DNA连接酶
B.构建的重组表达载体中终止子的作用是终止转录过程
C.检测重组细胞是否表达出rhEPO常用抗原—抗体杂交技术
D.用乳腺生物反应器生产EPO可将人EPO基因导入哺乳动物体细胞获得
答案　BC
解析　过程①构建基因表达载体，需用限制酶切割目的基因和载体，并用DNA连接酶连接，该过程无需DNA聚合酶参与，A错误；终止子的作用是终止转录过程，B正确；检测重组细胞是否表达出rhEPO，可利用抗原—抗体特异性结合的原理，采用抗原—抗体杂交技术检测，C正确；采用细胞培养生产EPO成本比较高，可以采用乳腺生物反应器，将基因表达载体转入雌性哺乳动物受精卵中，使EPO基因在转基因动物的乳腺细胞中表达，通过分泌的乳汁来生产EPO，目前还不能直接用高度分化的体细胞克隆哺乳动物，D错误。

7.（2021·山东滨州一模）构建基因表达载体时，可利用碱性磷酸单酯酶催化载体的5′－P变成5′－OH，如图所示。将经过该酶处理的载体与外源DNA连接时，由于5′－OH与3′－OH不能连接而形成切口（nick）。下列说法错误的是（　　）

A.经碱性磷酸单酯酶处理的载体不会发生自身环化
B.外源DNA也必须用碱性磷酸单酯酶处理
C.T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端
D.重组DNA经过2次复制可得到不含nick的子代DNA
答案　B
解析　将经过碱性磷酸单酯酶处理的载体与外源DNA连接时，由于5′－OH与3′－OH不能连接而形成切口（nick），因此经碱性磷酸单酯酶处理的载体不会发生自身环化，A正确；外源DNA不能用碱性磷酸单酯酶处理，如用碱性磷酸单酯酶处理，载体与外源DNA不能连接形成重组DNA，B错误；T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，C正确；DNA进行半保留复制，1个重组DNA经过2次复制，可得到2个不含nick的子代DNA，D正确。
8.（2022·华师一附中调研）图1为生产转基因抗虫棉时使用的质粒，图2为生产转基因抗虫棉时所用目的基因侧翼涉及的限制酶的酶切位点。

（1）为了高效地构建基因表达载体，最好选用　　　　　（填限制酶名称）同时酶切质粒和目的基因。
（2）为了筛选出基因表达载体，需要将DNA连接酶处理后的溶液与大肠杆菌混合在一起进行培养，为了促使大肠杆菌吸收外源DNA，需要用　　　　处理大肠杆菌使其处于感受态。随后再将大肠杆菌涂布在含　　　　的培养基中培养，一般情况下这样培养出来的大肠杆菌有两种类型：一种是结合了目的基因的质粒，一种是未结合目的基因的质粒。可以加入　　　　分别去切割两种质粒，其中结合了目的基因的质粒在酶切后能产生目的基因。
（3）图示质粒在设计时插入了T－DNA序列，并且将启动子、多克隆位点和终止子序列插入到T－DNA中（注：插入不会破坏T－DNA的作用），T－DNA的作用是　　　　。
（4）有人担心基因工程中使用的抗性基因可转移至近缘生物中，本例中的质粒能否有助于降低氨苄青霉素抗性基因转移到近缘生物的风险？______________________________________________________
为什么？__________________________________________________
答案　（1）HindⅢ和BamHⅠ
（2）CaCl2（或Ca2＋）　氨苄青霉素　HindⅢ和BamHⅠ
（3）将插入T－DNA中的DNA序列转移并整合到受体细胞染色体DNA上
（4）能　只有T－DNA之间的DNA序列可以转移至染色体DNA上，本例中氨苄青霉素抗性基因不能转移到染色体DNA上，个体发育过程中会随着细胞分裂而逐渐丢失，因而不会转移至近缘生物中
解析　（1）高效构建基因表达载体宜采用双酶切，即选用HindⅢ和BamHⅠ同时切割质粒和目的基因。（2）使用Ca2＋或CaCl2处理可以使大肠杆菌处于易于吸收外源DNA的感受态。筛选时需要用到抗性基因，在本质粒中抗性基因是氨苄青霉素抗性基因，因此在重组体筛选时需要用到含氨苄青霉素的培养基。使用DNA连接酶连接后的重组质粒中，原来切割质粒和目的基因的限制酶酶切位点在重组质粒中再次出现，可以使用同样的限制酶（HindⅢ和BamHⅠ）将重组质粒再次切开。（3）T－DNA的作用是将相应的DNA序列转移并整合到受体细胞染色体DNA上。（4）因为T－DNA中插入启动子、多克隆位点和终止子之后并不影响T－DNA的作用，所以T－DNA会把T－DNA中插入的DNA片段转移到染色体DNA上，这样氨苄青霉素抗性基因将无法转移到染色体DNA上而保留在细胞质中，细胞质中的DNA无法稳定的保存和复制，将会随着个体发育过程中细胞分裂次数的增加而丢失，从而降低了抗性基因转移的风险。
9.（2021·天津卷，16）乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。


（1）乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为　　　　。
（2）获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：
①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑　　　　和　　　　。
②将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有　　　　，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列　　　　（填“能”或“不能”）在大肠杆菌中高效表达。
③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在　　　　的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。
（3）以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是　　　　（单选）。
A.进一步优化发酵条件
B.使用乳酸菌LDH基因自身的启动子
C.敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因
D.对转基因酿酒酵母进行诱变育种
答案　（1）细胞质基质　（2）①包含BamHⅠ的识别序列　将GTG改为ATG　②原核生物复制原点　不能　③缺失尿嘧啶　（3）B
解析　（1）酵母细胞厌氧发酵即无氧呼吸的场所为细胞质基质。（2）①设计引物1的5′端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好的表达；由图2乳酸脱氢酶基因（LDH）左侧含GTG序列可知，该基因左侧应与质粒上的启动子相连接，则引物1的5′端需要引入BamHⅠ的识别序列。②将重组质粒导入大肠杆菌，重组质粒上有原核生物复制原点，所以能在大肠杆菌中扩增。由于启动子存在物种特异性，而重组质粒上带有酿酒酵母基因的启动子，故重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列在大肠杆菌中不能高效表达。③在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因而可以正常生存，从而起到筛选作用。（3）进一步优化发酵条件，使其更有利于转基因酿酒酵母的繁殖，可以提高其乳酸产量，A正确；由于启动子存在物种特异性，使用乳酸菌LDH基因自身的启动子，在酵母细胞中不能高效表达，B错误；敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因，使酿酒酵母不能产生乙醇，从而提高乳酸产量，C正确；对转基因酿酒酵母进行诱变育种，可能会出现乳酸的高产菌株，D正确。