2023版高考生物一轮总复习第14单元基因工程生物技术的安全性与伦理问题课件

自 主 学 习 · 巩 固 基 础[自主学习]知识点一　基因工程及基因工程的基本工具1．基因工程的概念重组DNA　生物体外　DNA分子　拼接　导入　生物产物　定向改造　2．基因工程的基本操作工具【答案】原核生物　磷酸二酯键　黏性末端　磷酸二酯键　黏性末端　平末端　目的基因　质粒　自我复制[自主检测]1．思考判断(1)有关工具酶的判断。①限制酶只能用于切割目的基因。 (　　)②切割质粒的限制酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。 (　　)③DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。 (　　)④E．coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(　　)⑤限制酶也可以识别和切割RNA。 (　　)【答案】(1)①×　②×　③×　④×　⑤×(2)有关载体的判断。①载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。 (　　)②每个质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点。 (　　)③质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。 (　　)④载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。 (　　)⑤外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。 (　　)【答案】(2)①×　②√　③√　④√　⑤×2．深挖教材(1)限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？_______________________________________________。(2)切取目的基因与切割载体时只能使用“同一种酶”吗？__________________________________________________。(3)DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？_________________________________________________。【答案】(1)提示：限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的碱基序列，并在特定的位点上进行切割。限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰(2)提示：①在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性(或平)末端。但如果用两种不同的限制酶切割后形成的末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。②为了避免目的基因和载体的自身环化和随意连接，在切割目的基因和载体时，均使用两种不同的限制酶，使目的基因和载体各具有两个不同的末端(3)提示：不是。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上3．热图导析【答案】提示：适合的质粒是①。由图可知，质粒②上无标记基因，不适合作为载体；质粒③和④的标记基因上都有限制酶的识别位点，使用该酶后将会导致标记基因遭破坏，故均不宜选作载体[自主学习]知识点二　基因工程的基本操作程序及应用1．基因工程的基本操作程序【答案】基因文库　PCR　启动子　标记基因　农杆菌转化　显微注射　PCR　抗原—抗体杂交2．利用PCR获取和扩增目的基因【答案】DNA半保留复制　PCR扩增仪(PCR仪)　耐高温的DNA聚合酶　4种脱氧核苷酸　【答案】受热变性　50　引物　72　耐高温的DNA聚合酶　3′　指数　琼脂糖凝胶电泳[自主检测]1．思考判断(1)设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列。 (　　)(2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。 (　　)(3)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。 (　　)(4)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。 (　　)(5)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术。 (　　)【答案】(1)×　(2)√　(3)×　(4)√　(5)√2．深挖教材(1)利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系细胞器知识，结合基因工程操作程序的基本思路，可以用大肠杆菌生产人的糖蛋白吗？_________________________________________________。(2)启动子＝起始密码子吗？终止子＝终止密码子吗？__________________________________________________。(3)目的基因的插入位点是随意的吗？__________________________________________________。【答案】(1)提示：不可以。糖蛋白上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，大肠杆菌中不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的(2)提示：①启动子是位于基因首端的一段特殊序列，它是RNA聚合酶识别、结合的部位。终止子是位于基因尾端的一段特殊序列，作用是使转录过程停止。②起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止(3)提示：不是。基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间，若目的基因插入启动子内部，启动子将失去原功能3．热图导析：抗虫棉的培育过程(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？______________________________________________。(2)该实例中，采用何种方法导入目的基因？为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？____________________________。(3)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？_____________________________________________________。【答案】(1)提示：目的基因是Bt基因，载体是Ti质粒。用同一种限制酶处理目的基因和载体，可以获得相同的黏性末端，便于构建基因表达载体　(2)提示：采用的方法是农杆菌转化法，由于Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又可插入到T－DNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上　(3)提示：抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫[自主学习]知识点三　蛋白质工程1．概念理解(1)基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。(2)操作：________或合成基因。(3)结果：改造了现有蛋白质或制造出____________。(4)目的：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对______________进行设计改造。改造　新的蛋白质　蛋白质结构　2．蛋白质工程的设计流程   【答案】功能　蛋白质结构　氨基酸序列　脱氧核苷酸序列(基因)[自主检测]1．思考判断(1)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株。 (　　)(2)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用。 (　　)(3)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。 (　　)(4)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。 (　　)【答案】(1)√　(2)×　(3)√　(4)×2．深挖教材蛋白质工程为什么通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造？______________________________________________。【答案】提示：①蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；②改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传[自主学习]知识点四　DNA的粗提取和鉴定溶解　析出　增大　溶解　酒精溶液　蓝　2．操作流程【答案】新鲜洋葱　酒精　二苯胺[自主检测]思考判断(1)DNA既溶于2 mol/L NaCl溶液，也溶于蒸馏水。 (　　)(2)根据高中生物学实验的基本原理，提取DNA是利用不同化合物在溶剂中溶解度的差异。 (　　)(3)二苯胺试剂能溶解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度。 (　　)(4)将丝状物溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色。 (　　)【答案】(1)√　(2)√　(3)×　(4)×[自主学习]知识点五　生物技术的安全性和伦理问题【答案】经济发展水平　安全性　生殖　不赞成　不支持　基因检测　基因歧视　致病菌　不生产[自主检测]思考判断(1)转基因作物被动物食用后，目的基因就会转入动物体细胞中。 (　　)(2)种植转基因植物有可能因基因扩散而影响野生植物的遗传多样性。 (　　)(3)转入油菜的抗除草剂基因，可能通过花粉传入环境中。 (　　)(4)转抗虫基因的植物，不会导致昆虫群体抗性基因频率增加。 (　　)(5)如果转基因植物的外源基因来源于自然界，则不会存在安全性问题。 (　　)【答案】(1)×　(2)√　(3)√　(4)×　(5)×2．深挖教材：试管婴儿和设计试管婴儿的比较 (1)不同点①所用技术手段：设计试管婴儿胚胎移植前__________(填“需要”或“不需要”)进行遗传学诊断或基因诊断，试管婴儿__________(填“需要”或“不需要”)进行遗传学诊断或基因诊断。②应用：试管婴儿主要是解决不孕夫妇的生育问题，设计试管婴儿主要用于白血病、贫血症的治疗。(2)相同点：__________________________。【答案】提示：(1)①需要　不需要　(2)都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，都要经过胚胎移植，都是有性生殖重 难 探 究 · 素 养 达 标基因工程的操作工具[深度讲解](2)切割后产生末端的种类——黏性末端和平末端。①当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。②当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的是平末端。2．限制酶与DNA连接酶的关系(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。(2)限制酶不切割自身DNA的原因：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。3．与DNA分子相关的几种酶的比较4．选择限制酶的注意事项(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，可使用两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。①切割质粒的限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。②目的基因的表达需要调控序列，质粒插入目的基因部位之前有启动子，之后需有终止子。③质粒作为载体必须具备标记基因、启动子和终止子等，选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因。④如果所选限制酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。 　基因工程操作基本工具的八个易错点(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。(4)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。(7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。(8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。考查基因工程的操作工具(素养目标：生命观念)图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ四种限制酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：[考向预测](1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由__连接。(2)若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是________末端，其产物长度为__________________。(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有__________种不同长度的DNA片段。(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是__________。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加____________的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是__________________________。【答案】(1)脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖　(2)平　537 bp、790 bp、661 bp　(3)4　(4)BamHⅠ　抗生素B　同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接【解析】(1)两条脱氧核苷酸链之间的碱基通过氢键相连，一条脱氧核苷酸链中相邻的碱基通过“脱氧核糖—磷酸—脱氧核糖”连接。(2)根据限制酶SmaⅠ识别的碱基序列可知，限制酶SmaⅠ切割产生的末端为平末端。在图1序列中共有2个SmaⅠ的切割位点，切割后形成3种不同长度的产物，分别为537 bp、790 bp、661 bp。(3)图1中有SmaⅠ的两个识别序列，完全切割后产生3个不同长度的DNA片段，若虚线方框中的碱基对被T—A碱基对替换，再经SmaⅠ识别并完全切割后会产生2个DNA片段，其中1个DNA片段与未替换前完全切割的相同，因此经完全切割后共产生4种不同长度的DNA片段。(4)切割目的基因可选用限制酶BamHⅠ和限制酶MboⅠ，但限制酶MboⅠ可将质粒中的抗生素A抗性基因和抗生素B抗性基因都破坏，而限制酶BamHⅠ只破坏抗生素A抗性基因，因此只能选用限制酶BamHⅠ；重组质粒中含有抗生素B抗性基因，因此可在含抗生素B的培养基上培养。基因工程的操作过程及蛋白质工程及其与基因工程的关系[深度讲解]2．基因表达载体的构建(1)基因表达载体的组成及作用。(2)构建过程。3．将目的基因导入受体细胞4．目的基因的检测与鉴定5．蛋白质工程与基因工程的区别和联系 　基因工程中的三个易错点(1)基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了目的基因。(2)目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位，若目的基因插入到启动子内部，启动子将失去其功能。(3)启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子：启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。(一)考查基因工程的操作过程(素养目标：科学探究)1．下图是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请据图作答。[考向预测](1)能否利用人的皮肤细胞来完成①过程？为什么？___________________________________________。(2)过程②必需的酶是____________酶，过程③在体外需要的条件是_____________，过程④在体外必需的酶是___________________酶。(3)基因工程的核心步骤是____________________ (填文字)。在利用A、B获得C的过程中，必须用________________切割A和B，使它们产生__________________，再加入DNA连接酶，才可形成C。(4)C的组成除必须含有目的基因、标记基因、复制原点外，还必须有__________________。(5)图中的D是基因工程中的受体细胞，为了使过程⑧更易进行，可用________________处理D使其成为________________。(6)在分子水平检测目的基因是否翻译形成蛋白质，通常采用____________________方法。【答案】(1)不能。由于基因的选择性表达，人的皮肤细胞中胰岛素基因不能表达得到胰岛素　(2)逆转录　加热　耐高温的DNA聚合(Taq)　(3)基因表达载体的构建　同一种限制酶　相同的黏性末端　(4)启动子、终止子　(5)Ca2＋　感受态细胞　(6)抗原－抗体杂交【解析】(1)不能从皮肤细胞中获得胰岛素基因的mRNA，是因为基因选择性表达，人的皮肤细胞中胰岛素基因不表达。(2)过程②是逆转录，必需的酶是逆转录酶；过程③是解旋，在体外需要的条件是加热；过程④是以DNA一条链为模板合成子代DNA，在体外必需的酶是耐高温的DNA聚合(Taq)酶。(3)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。A、B分别是含目的基因的DNA片段和质粒， C是重组质粒，在利用A、B获得C的过程中，必须用同种限制酶切割A和B，使它们产生相同的黏性末端，再加入DNA连接酶，才可形成重组质粒。(4)重组质粒必须含有目的基因、标记基因、复制原点外，还必须有启动子和终止子。(5)为了使受体细胞更容易吸收重组质粒，可用处理 Ca2＋处理，使其处于感受态。(6)在分子水平检测目的基因是否翻译形成蛋白质，通常采用抗原－抗体杂交的方法。(二)考查蛋白质工程的应用(素养目标：社会责任)2．(2021年陕西西安模拟)请据图回答下列问题。甲 乙 (1)图甲中①～④所示为__________________________工程。如图乙，一个构建好的基因表达载体，在目的基因尾端还必须有[2]__________；图中[3]__________的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，便于将含有目的基因的细胞筛选出来。若欲通过乳腺生物反应器生产预期蛋白质，图乙中序号[1]代表的是________________________________；且在图甲中⑨过程之前，要对精子进行筛选，保留含性染色体__________的精子。(2)为获得较多的受精卵进行研究，图甲中⑥过程一般用激素对供体做________________处理；为提高培育成功率，进行⑩过程之前，要对供、受体动物做__________处理。如果该目的基因为胰岛素基因，将该基因导入受体细胞后，仅整合到一条染色体上，且该基因得以成功表达，那么由胚胎分割过程得到的两个胚胎发育而成的两头牛__________(填“是”或“不是”)都能产生牛的胰岛素。【答案】(1)蛋白质工程　终止子　标记基因　乳腺蛋白基因的启动子　X　(2)超数排卵　同期发情　是　【解析】(1)蛋白质工程的过程为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。由此可见，图甲中①～④所示的生物工程为蛋白质工程。如图乙，一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，在基因尾端还必须有[2]终止子；图中[3]为标记基因，作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。若预期蛋白质欲通过乳腺生物反应器生产，则构建基因表达载体时，要将目的基因与[1]乳腺蛋白基因的启动子重组在一起，以便目的基因在乳腺细胞中表达；在图甲中⑨过程之前，要对精子进行筛选，保留含性X染色体的精子。(2)为获得较多的受精卵运行研究，图甲中⑥过程一般用促性腺激素对供体做超数排卵处理。为提髙培育成功率，进行⑩过程之前，要对供、受体动物做同期发情处理。由胚胎分割过程得到的两个胚胎发育而成的两头牛，其基因相同，都能够产生牛的胰岛素。DNA的粗提取和鉴定DNA粗提取与鉴定中不同试剂的用途及原理比较[深度讲解]考查DNA的粗提取和鉴定(素养目标：科学探究)如图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。[考向预测](1)图中实验材料A可以是__________等，研磨前加入的B应该是__________________________。(2)通过上述所示步骤得到滤液C后，再向滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液的目的是__________________。(3)在该实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2 mL的4种溶液中，经搅拌后过滤，获得如下表所示的4种滤液，其中含DNA最少的是滤液__________。(4)DNA鉴定的原理是__________________。【答案】(1)洋葱(或菜花)　研磨液　(2)使DNA溶解　(3)H　(4)在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂会被染成蓝色【解析】(1)选用洋葱、菜花等植物材料提取DNA时，要在切碎的材料中加入研磨液，进行充分的搅拌和研磨。(2)DNA在2 mol/L的NaCl溶液中的溶解度较高，而在0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最小。向滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液可以使DNA溶解，过滤除去不溶的杂质。(3)DNA不溶于冷酒精，可利用这一原理进一步提纯DNA。典 题 演 练 · 破 解 高 考1．(2021年全国乙卷)用重组DNA技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制酶的切割位点如图所示。回答下列问题：(1)常用的DNA连接酶有E．coli DNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中____________________酶切割后的DNA片段可以用E．coli DNA连接酶连接。上图中________________________________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________________。(3)重组DNA技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能__________；质粒DNA分子上有__________________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是__________________________。(4)表达载体含有启动子，启动子是指__________________________。【答案】(1)EcoRⅠ、PstⅠ　EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ(2)磷酸二酯键　(3)自我复制　一至多个限制酶切位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞　(4)位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程【解析】(1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E．coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E．coli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。(3)质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(4)启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。命题探源本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的概念、原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能结合所学的知识准确答题。2．(2021年广东卷)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线(如图)，可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料)，以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。回答下列问题：(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有______________________。(答出两种即可)(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有__________________。(答出两种即可)(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备__________细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有__________________。(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是________________________________。在分子水平上，可以通过改变__________________________，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。【答案】(1)基因文库中获取、人工合成法　(2)盐析法、酶解法或高温变性　(3)感受态　抗原－抗体杂交技术　(4)有的酶失活而使反应中断　基因的碱基序列【解析】(1)分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。(2)高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞，即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因(目的基因)成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原－抗体杂交技术进行检测。(4)依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。命题探源本题考查基因工程、DNA的粗提取和鉴定的相关知识，意在考查考生把握知识间的联系、理论与实际相结合解决实际问题的能力，难度中等。3．(2021年河北卷)采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉(Cd)在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理(例如，收集植物组织器官异地妥善储存)，可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白(YCF1)基因导入受试植物，并检测了相关指标。回答下列问题：(1)为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为____________。(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是____________________________。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是____________________________________________。(3)进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是____________________。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是__________________________________。(4)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重(图1)及不同器官中Cd含量(图2)。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的____________(填“耐性”或“富集能力”)；据图2可知，对转基因植株的____________进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。(5)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是_____________ ____________________________________________________________。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于________________________________________(写出两点即可)。【答案】(1)基因组文库　(2)限制酶和DNA连接酶　便于目的基因的筛选和鉴定　(3)农杆菌转化法　避免目的基因在自然界中的扩散　(4)耐性　茎叶　(5)YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水　杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用【解析】(1)为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用限制酶切割供体DNA和质粒，以产生相同的黏性末端，然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。(3)农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T－DNA可转移并插入到受体细胞DNA中，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。(4)根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2分析，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用，对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。(5)YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境。相较于草本植物，杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用，作为Cd污染土壤修复植物更具有优势。命题探源本题结合图示考查基因工程的相关知识，要求学生掌握基因工程的工具、步骤，难度适中，意在考查考生理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系，要求能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象。4．(2021年山东卷)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是________________，在R末端添加的序列所对应的限制酶是__________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要__________种酶。(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是__________________。(3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于__________，理由是________________________________________________________ _________________________________________________________。【答案】(1)SalⅠ　EcoRⅠ　6(2)F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达　(3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上　根据有无荧光情况判断，F1～F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上【解析】(1)根据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶MunⅠ识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有MunⅠ和XhoⅠ的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶Mun Ⅰ和Xho Ⅰ所识别，故应该选用添加限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶MunⅠ识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoRⅠ识别并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoRⅠ的识别位点，故对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割。综上所述，对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割，对扩增后的产物用限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcoRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhoⅠ、DNA连接酶。(2)受体细胞中已经除去BCL11A基因，故扩增产物中的BCL11A蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。(3)向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生 BCL11A蛋白， BCL11A 蛋白与BCL11A蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A蛋白结合位点结合后在引物F4与引物R之间的序列上；含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A蛋白结合位点结合后在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。名师点睛对基因工程中PCR技术的掌握，对基因工程的第二步——基因表达载体的构建的过程的分析，双酶切法的应用，限制酶的作用和切割特点，是解决本题的关键。5．(2020年全国Ⅲ卷)W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路，制备一种膀胱生物反应器来获得W，基本过程如图所示。(1)步骤①中需要使用的工具酶有____________________________。步骤②和③所代表的操作分别是______________和________________。步骤④称为________________。(2)与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物的________________(答出2点即可)的限制。(3)一般来说，在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的细胞核中染色体DNA所含的遗传信息________________(填“相同”或“不同”)，原因是__________________________。(4)从上述流程可知，制备生物反应器涉及胚胎工程，胚胎工程中所用到的主要技术有________________(答出2点即可)。【答案】(1)限制酶、DNA连接酶　显微注射　体外培养　胚胎移植　(2)性别、年龄　(3)相同　两种上皮细胞都是体细胞，且来源于同一个受精卵　(4)体外受精、胚胎移植【解析】(1)由分析可知，步骤①为构建基因表达载体，需使用同种限制酶切割目的基因和运载体，再由DNA连接酶连接黏性末端，形成重组表达载体；步骤②为显微注射；步骤③为体外培养；步骤④为胚胎移植。(2)与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W，可从动物一出生就收集产物，不受动物的性别和年龄的限制。(3)在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞是由同一个受精卵有丝分裂产生的体细胞，其细胞核中染色体DNA所含的遗传信息相同。(4)由分析可知，步骤③为体外培养，步骤④为胚胎移植，均属于胚胎工程。6．(2020年山东卷)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是____________________________，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为________________。(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了____________________________，从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列________________(填“发生”或“不发生”)改变，原因是__________________________________。(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA (Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经_____________过程获得总 cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出 Wx基因的cDNA，原因是______________。(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为________________，原因是__________________________。【答案】(1)限制酶和DNA连接酶　转化　(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合　不发生　编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子　(3)逆转录(或反转录)　引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)　(4)品系3　品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强【解析】(1)将目的基因与Ti质粒构建基因表达载体时，需要限制酶的切割，将目的基因插入载体时需要DNA连接酶的连接，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程叫作转化。(2)根据以上分析可知，启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，如果启动子序列改变将会影响RNA聚合酶与之结合和识别，进而影响基因的转录水平，在真核生物中，编码蛋白质的序列是基因中编码区，编码区中不包括启动子序列，因此直链淀粉合成酶的基因碱基序列中不含有启动子，因此3个突变品系中Wx基因中控制合成直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。(3)以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录，利用PCR技术扩增Wx基因的cDNA，需要以Wx基因合成的引物，这样引物能够在总cDNA中与Wx基因的cDNA特异性结合，从而利用PCR扩增技术转移性扩增出Wx基因的cDNA。(4)分析题图可知，图中品系3的Wx基因的mRNA的含量最少，那么合成的直链淀粉酶最少，直链淀粉合成量最少，因此该水稻胚乳中含的直链淀粉比例最小，糯性最强。7．(2020年海南卷)某课题组用生物技术制备转基因小鼠的过程，如图所示。回答下列问题。(1)通常把目的基因转入雄原核而不是雌原核，从两者形态差异上分析，原因是__________________________。(2)把桑葚胚植入假孕母鼠子宫前，需要对胚胎进行性别鉴定，目前最有效的方法是SRY－PCR法。操作的基本程序是先从被测胚胎中取出几个细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体的性别决定基因，即SRY基因的一段碱基设计________________，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，最后用SRY特异性探针检测扩增产物。出现阳性反应者，胚胎为________；出现阴性反应者，胚胎为__________。(3)若目的基因的表达产物是某种特定的蛋白质，检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常用的分子检测方法是____________ ______，检测的基本思路是__________________________。【答案】(1)雄原核较大，更容易容纳外源DNA　(2)引物　雄性小鼠　雌性小鼠　(3)抗原—抗体杂交技术　从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体(对抗体进行同位素标记)进行抗原—抗体杂交，如果出现杂交带，表明目的基因已经表达成功