高考生物二轮复习专题9现代生物技术第19讲基因工程和克隆技术学案

这是一份高考生物二轮复习专题9现代生物技术第19讲基因工程和克隆技术学案，共18页。
[考纲要求] 1.工具酶的发现和基因工程的诞生(a)。2.基因工程的原理和技术(b)。3.基因工程的应用(a)。4.活动：提出生活中的疑难问题，设计用基因工程技术解决的方案(c)。5.植物的克隆(b)。6.动物的克隆(a)。
1．基因工程
(1)基因工程的工具
将同一种限制性核酸内切酶切割的质粒与目的基因片段混合，加入DNA连接酶，两两连接的产物(重组DNA分子)有以下3种：目的基因与目的基因的连接物；质粒与质粒的连接物；目的基因与质粒的连接物。其中，只有目的基因与质粒的连接物才是真正需要的。
以下是双酶切法，请思考填空：
双酶切法的优点主要在于防止质粒和目的基因自身环化以及保证目的基因单向插入质粒。
(2)基因工程的原理和技术
(3)转基因动物、植物及微生物的培育流程
(4)目的基因的表达
提醒 (1)使用限制性核酸内切酶的注意点
①通常用同种限制性核酸内切酶切割载体DNA和目的基因。
②不同的限制性核酸内切酶也能切割出相同的粘性末端。
(2)DNA连接酶≠DNA聚合酶
DNA连接酶连接两个DNA片段，而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上。
(3)限制性核酸内切酶≠DNA酶≠解旋酶
限制性核酸内切酶是切割某种特定的脱氧核苷酸序列，并使两条链在特定的位置断开；DNA酶是将DNA水解为基本组成单位；解旋酶是将DNA的两条链间的氢键打开形成两条单链。
(4)启动子、终止子
①启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA)。
②终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)。
2．植物的克隆
(1)植物组织培养关键过程总结
(2)植物细胞工程操作过程
(3)植物细胞培养、器官培养和原生质体培养的关系
3．动物的克隆
(1)动物的细胞和组织培养
①动物克隆的技术基础是动物的细胞和组织培养。
②动物细胞培养的过程：组织块的切取、组织细胞的分散及细胞培养三个阶段。分散组织细胞常用的方法有机械消化法和胰酶消化法。
③原代培养：从机体取出后立即进行的细胞、组织培养的过程。
④传代培养：将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖的过程。
⑤动物成纤维细胞的培养过程：切取组织小片→胰蛋白酶酶解→原代培养→传代培养。
(2)动物的细胞融合技术及其应用
①细胞融合
②单克隆抗体的制备
提醒 与单克隆抗体的制备有关的5个易错点
(1)动物细胞培养中两次用到胰蛋白酶，第一次的目的是处理剪碎的组织使之分散成单个细胞，第二次的目的是使贴壁细胞从瓶壁上脱落下来，分散成单个细胞。
(2)动物细胞培养过程中通入CO2的目的是调节pH。
(3)动物细胞培养的目的是获得大量的细胞群体，而动物组织培养的目的是获得动物的器官和组织。
(4)一般抗血清中的抗体是一群识别不同抗原部位的抗体混合物，而单抗专一性识别抗原分子的特殊部位，比一般抗血清优越。
(5)动物克隆的原理：动物细胞核的全能性；动物克隆的技术基础：动物的细胞和组织培养；动物细胞、组织培养的原理：细胞的增殖。
(3)细胞核移植实验和动物的克隆繁殖
①核移植：利用一个细胞的细胞核(供体核)来取代另一个细胞中的细胞核，形成一个重建的“合子”。
②动物的克隆繁殖
eq \b\lc\ \rc\}(\a\vs4\al\c1(\x(卵细胞)→\x(细胞质),\x(体细胞)→\x(细胞核)))→eq \x(重组细胞)→eq \x(早期胚胎)→eq \x(另一雌性个体代孕)→eq \x(克隆动物)
提醒 规避克隆动物与试管动物的3个误区
(1)误区一：试管动物与克隆动物的产生都是无性生殖。
纠正：试管动物的产生是有性生殖，克隆动物的产生是无性生殖。
(2)误区二：试管动物(哺乳类)的产生是在体外进行的，克隆动物(哺乳类)的产生是在体内进行的。
纠正：试管动物(哺乳类)和克隆动物(哺乳类)早期胚胎之前都是在体外进行的，早期胚胎经过胚胎移植之后都是在体内进行的。
(3)误区三：胚胎移植的优势是充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，因此胚胎移植的胚胎只能来自体内受精的胚胎。
纠正：胚胎移植的胚胎有三个来源：体内正常受精产生的胚胎、核移植产生的重组细胞培养而来的胚胎、体外受精产生的早期胚胎。
1．基因工程的正误判断
(1)限制性核酸内切酶作用于DNA分子的氢键，使DNA双链断开 ( × )
提示 限制性核酸内切酶作用于磷酸二酯键。
(2)DNA连接酶能将两碱基间形成的氢键连接起来( × )
提示 DNA连接酶是将两个核苷酸之间形成的磷酸二酯键连接起来。
(3)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体( √ )
(4)DNA连接酶能够将任意2个DNA片段连接在一起( × )
提示 DNA连接酶将具有末端碱基互补的2个DNA片段连接在一起。
(5)抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达( √ )
(6)限制性核酸内切酶能够特异性识别并切割烟草花叶病毒遗传物质( × )
(7)基因工程的工具酶包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶及质粒( × )
提示 质粒是基因工程的载体，不属于工具酶。
(8)土壤农杆菌转化法是将目的基因与农杆菌质粒重组，然后将重组DNA分子导入植物受体细胞( × )
(9)构建基因文库时需包含目的基因( √ )
(10)基因治疗是向目的细胞中导入正常基因以替换细胞中不正常的基因( × )
提示 基因治疗是向目标细胞中引入正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷。
2．克隆技术的正误判断
(1)棉花根尖细胞经诱导形成幼苗能体现细胞全能性( √ )
(2)植物的每个细胞在植物体内和体外都能表现出细胞的全能性( × )
提示 在生物体内，由于基因的选择性表达，细胞不能表现出全能性，而是分化成为不同的组织、器官，细胞表现全能性的必要条件是离体状态、一定的营养物质和激素等外界条件。
(3)在诱导离体菊花茎段形成幼苗的过程中，不会发生细胞的增殖和分化( × )
提示 植物组织培养包括脱分化和再分化两个过程，在这两个过程中都会发生细胞增殖(有丝分裂)，且在再分化过程中发生细胞分化，形成各种组织细胞。
(4)制备原生质体时，采用低渗甘露醇，防止原生质体失水过多失去生物活性 ( × )
提示 低渗甘露醇使原生质体吸水膨胀破裂，应采用0.5～0.6 ml/L的甘露醇溶液。
(5)用纤维素酶和果胶酶水解法获得的植物原生质体失去了全能性( × )
提示 原生质体具有全能性。
(6)连续细胞系的细胞大多具有二倍体核型( × )
提示 连续细胞系被认为是发生转化了的细胞系，大多数具有异倍体核型。
(7)制备肝细胞悬浮液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胃蛋白酶处理( × )
提示 制备肝细胞悬浮液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胰蛋白酶处理，但不能使用胃蛋白酶，因为胃蛋白酶需要在强酸环境下起作用，但这样的环境不适于细胞生存。
(8)肝细胞培养过程中通常在培养液中通入5%的CO2刺激细胞呼吸( × )
提示 肝细胞培养过程中通常在培养液中通入5%的CO2的目的是维持培养液中的pH。
(9)与“多莉”羊等克隆哺乳动物相关的技术有胚胎移植、细胞培养、早期胚胎培养和核移植等( √ )
(10)植物原生质体融合和动物细胞融合原理是相同的( √ )
(11)杂交瘤细胞进行体内培养，是为了获得单克隆抗体的胚胎( × )
提示 杂交瘤细胞进行体内培养，是为了获得单克隆抗体。
考向一 考查基因工程
1．(2019·天津，9)B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞(2n)和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。
据图回答：
(1)B基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中________(单选)。
A．含B基因的染色体缺失
B．DNA聚合酶失活
C．B基因发生基因突变
D．B基因的启动子无法启动转录
(2)从水稻体细胞或________________中提取总RNA，构建________文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因(表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光)连接成融合基因(表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能)，然后构建重组表达载体。
(3)在过程①、②转化筛选时，过程______中T－DNA整合到受体细胞染色体DNA上，过程________在培养基中应加入卡那霉素。
(4)获得转基因植株过程中，以下鉴定筛选方式正确的是________(多选)。
A．将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交
B．以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交
C．以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交
D．检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光
(5)从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明________________________________________________________________________。
答案 (1)D (2)精子 cDNA (3)② ① (4)BCD (5)B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚
解析 (1)启动子是一段有特殊结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录，推测最可能的原因是卵细胞中B基因的启动子无法启动转录，D项符合题意。(2)B基因在体细胞和精子中正常表达，说明在水稻的体细胞和精子中有B基因转录而来的mRNA。从水稻体细胞或精子中提取总RNA，逆转录产生多种互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群体就叫做水稻的cDNA文库。(3)过程①是指将含有目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌，过程②是指将含有重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上。为了检测含有目的基因的重组Ti质粒是否转入农杆菌，过程①需在培养基中加入卡那霉素。(4)DNA分子杂交是将转基因生物的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，将探针与基因组DNA杂交，看是否出现杂交带。将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交，不能用于筛选含目的基因的转基因植株，A项错误；B­Luc融合基因中含有水稻B基因编码蛋白的序列和Luc基因，因此，以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交可达到实验目的，B项正确；转基因植株卵细胞中的B基因能够转录出mRNA，因此以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交可达到实验目的，C项正确；Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，因此检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光，可以达到实验目的，D项正确。(5)一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，而在转基因植株中能发现由未受精的卵细胞发育形成的胚，说明B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚。
2．下图为获得转基因抗虫棉的流程图。请据图回答下列问题：
(1)该过程先后涉及___________技术和植物克隆技术，后者的技术基础是________________，过程中两次筛选的目的分别是筛选______________________________和抗虫植株。
(2)下列关于Ti质粒的叙述中，错误的是________。
a．含有DNA复制起点b．具有限制性核酸内切酶的识别序列
c．是大肠杆菌拟核外的环状DNAd．含有控制质粒DNA转移的基因
(3)图中A是将含愈伤组织培养物的试管放在________(仪器)上，通过________培养得到单细胞，这种单细胞依次到细胞团、球形胚、心形胚和[B]________，最后长成植株。
(4)下列关于图中单细胞特征的叙述，错误的是________。
a．细胞质丰富b．液泡大 c．细胞核大d．未分化
答案 (1)基因工程(转基因) 植物组织培养 含目的基因的受体细胞 (2)c (3)摇床 (液体)悬浮 胚状体 (4)b
解析 (1)转基因植物培育过程中涉及基因工程技术和植物克隆技术，植物克隆技术的基础是植物组织培养，进行转基因操作，将含有目的基因的重组DNA分子导入受体细胞后，需进行筛选，筛选含有目的基因的受体细胞。(2)质粒上含有DNA的复制起点，有利于质粒DNA进行复制，a正确；质粒上具有一个至多个限制性核酸内切酶的识别位点，b正确；Ti质粒是农杆菌拟核外的环状DNA，c错误；Ti质粒能将目的基因转移到受体细胞的染色体上，其上含有控制质粒DNA转移的基因，d正确。(3)分析图示可知，图中A是将含有愈伤组织培养物的试管放在摇床上，通过液体悬浮培养得到单细胞，这种单细胞经过培养基中成分的诱导，可以发生类似受精卵经过卵裂、分化、器官发生和形态建成而发育成胚的过程，即从单细胞依次到细胞团、球形胚、心形胚和胚状体，最后再长成完整植株。(4)单细胞具有细胞核大、核仁明显、细胞质丰富、液泡小、未分化等特点。
3．(2018·海南，31)甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为了改善黄瓜的品质，科学家采用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞，得到了转基因植株。回答下列问题：
(1)用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜________(填“受伤的”或“完好的”)叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，选用这种叶片的理由是_____________________________________。
(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中______________已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1∶1，则说明甜蛋白基因已经整合到____________(填“核基因组”“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”)中。
(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用__________作为外植体进行组织培养。
(4)通常，基因工程操作主要有4个步骤，即获得目的基因、形成重组DNA分子、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为_____________
_____________________________________________________________________________。
答案 (1)受伤的 叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞
(2)甜蛋白基因 核基因组 (3)茎尖 (4)按照人们的愿望进行设计，并通过体外重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型
解析 (1)用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜受伤的叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，理由是叶片伤口处的细胞会释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞。
(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中甜蛋白基因已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1∶1，则说明甜蛋白基因已经整合到核基因组中。
(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用茎尖作为外植体进行组织培养。
(4)通常，基因工程操作主要有4个步骤，即获得目的基因、形成重组DNA分子、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为按照人们的愿望进行设计，并通过体外重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型。
考向二 考查克隆技术
4．(2019·金华期末)如图中①②③代表通过植物组织培养技术培育新植株的三条途径，请回答下列问题：
(1)外植体a、b、c来自同种植株，植株A、B、C中的细胞，全能性表达程度________(填“相同”或“可能不同”)。
(2)途径②和③需要用到________________和________________(填培养基的物理性质)两种培养基。将含B1的试管放在摇床上，通过____________培养可以分散成单细胞。
(3)外植体c脱去细胞壁过程中需要加入适宜浓度的________(A.甘露醇 B．盐酸 C．蒸馏水 D．氯化钠)以保持一定的渗透压。原生质体培养成功标志着________________技术又向前迈进了一步。
(4)通过大量培养特定细胞系，可以实现能产生重要________________(如某些中药)的细胞的大量克隆和产物的工业化生产。
答案 (1)可能不同 (2)液体培养基 固体(或半固体)培养基 液体悬浮 (3)A 植物细胞工程 (4)次生代谢产物
解析 (1)外植体a、b、c来自同种植株，由于不同细胞的分化程度不同，因此植株A、B、C中的细胞全能性表达程度可能不同。(2)途径②③中均用到摇床，因此需要用液体培养基，而获得愈伤组织的过程需要用到固体(或半固体)培养基。将含B1的试管放在摇床上，通过液体悬浮培养可以分散成单细胞。(3)外植体c脱去细胞壁过程中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压。原生质体培养成功标志着植物细胞工程技术又向前迈进了一步。(4)通过大量培养特定细胞系，可以实现能产生重要次生代谢产物(如某些中药)的细胞的大量克隆和产物的工业化生产。
易混易错 植物克隆的相关技术
5.下图是制备分泌抗X抗体的过程，根据图示回答下列问题：
(1)给小鼠注射抗原的目的是____________。
(2)由图中可看出，单克隆抗体制备过程运用了________________和________________技术，前者常用的诱导剂与植物原生质体融合不同的是____________。
(3)动物细胞培养液的配方通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素等，与植物细胞培养基有所不同的是，还含有________________。
(4)在动物细胞融合过程中，需要将所选取的组织细胞分散开，以利于细胞融合，可用____________处理离体组织细胞使之分散开。
(5)图中有两次筛选过程，其中步骤④的目的是筛选出____________，步骤⑤⑥的目的是筛选出___________________________________________________________________________。
答案 (1)产生相应的B淋巴细胞(或效应B细胞) (2)动物细胞融合 动物细胞培养 灭活的病毒 (3)动物血清 (4)胰蛋白酶 (5)杂交瘤细胞 能产生特定抗体的杂交瘤细胞
解析 (1)单克隆抗体制备过程中给小鼠注射抗原的目的是产生相应的B淋巴细胞(或效应B细胞)。(2)分析题图可知，单克隆抗体制备过程运用了动物细胞融合和动物细胞培养技术，动物细胞融合常用的诱导剂与植物原生质体融合不同的是灭活的病毒。(3)动物细胞培养液的配方与植物细胞培养基不同的是，还含有动物血清。(4)用胰蛋白酶处理离体组织可使细胞分散开。(5)步骤④的目的是筛选出杂交瘤细胞，步骤⑤⑥的目的是筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
6．(2019·浙江4月选考)回答与利用生物技术培育抗病品种有关的问题：
(1)通过抗病性强的植株获取抗病目的基因有多种方法。现已获得纯度高的抗病蛋白(可作为抗原)，可通过________技术获得特异性探针，并将________中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的基因。
(2)将上述抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达，应检测________。
A．质粒载体B．转录产物
C．抗性基因D．病原微生物
(3)植物细胞在培养过程中往往会发生________，可利用这一特性筛选抗致病真菌能力强的细胞。筛选时在培养基中加入________________，并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若利用______________培养建立的细胞系用于筛选，则可快速获得稳定遗传的抗病植株。
(4)用抗病品种与高产品种进行杂交育种过程中，有时会遇到因胚发育中止而得不到可育种子的情况。若要使该胚继续发育获得植株，可采用的方法是____________________________。
答案 (1)单克隆抗体 基因文库 (2)B (3)变异 高浓度致病真菌 花粉离体 (4)胚的离体培养
解析 (1)该特异性探针作用的对象是蛋白质类抗原，所以该探针是抗体，可通过单克隆抗体技术获得特异性探针。用基因文库筛选某种目的基因的操作过程可以是先将基因文库中所有基因进行表达，然后利用该探针，找出能与探针特异性结合的表达产物，进而获得与之对应的目的基因。(2)用分子水平方法判断抗病基因是否表达，应检测转录产物。(3)植物细胞在培养过程中往往会发生变异，筛选抗致病真菌能力强的细胞时可在培养基中加入高浓度致病真菌，并将存活的细胞进一步培养至再生植株。若要快速获得稳定遗传的抗病植株，可用花粉离体培养建立的细胞系用于筛选。(4)若要使该胚继续发育获得植株，可采用的方法是胚的离体培养。
1．(2019·浙江绍兴9月联考)回答与动物克隆有关的问题：
(1)广义的动物组织培养包括________________和器官培养，器官培养是指______________、器官的一部分或整个器官在体外和人工控制的条件下得以保存、生长，在此过程中保持器官的结构、功能及分化能力。
(2)细胞融合是细胞工程的主要技术手段之一，其中电融合技术的原理是在低压交流电场中______________________________________；而细胞杂交是______________的细胞间的融合。
(3)单克隆抗体的制备中，往往在经过免疫的动物的______(器官)中获取能产生抗体的效应B细胞，经融合和筛选再培养，筛选的目标是_____________________________________。
(4)若想通过基因工程制备大量的单一抗体，下列方法可行的是( )
A．将抗体基因直接导入小鼠骨髓瘤细胞
B．将含有抗体基因的重组DNA分子导入小鼠骨髓瘤细胞
C．将含有抗体基因的重组DNA分子导入人的效应B细胞
D．将含有调控抗体产生基因的重组DNA分子导入人的效应B细胞
答案 (1)细胞培养、组织培养 器官的原基 (2)击穿质膜脂双层，导致胞质融通 不同基因型 (3)脾脏 获得既能产生特异抗体又能无限增殖的杂交瘤细胞 (4)B
解析 (1)广义的动物组织培养包括细胞培养、组织培养和器官培养，器官培养是指器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外和人工控制的条件下得以保存、生长，在此过程中保持器官的结构、功能及分化能力。(2)电融合技术依据的原理是在低压交流电场中击穿质膜脂双层，导致胞质融通；细胞杂交是不同基因型的细胞间的融合。(3)单克隆抗体的制备中，往往在经过免疫的动物的脾脏中获取能产生抗体的效应B细胞，经融合和筛选再培养，筛选的目标是获得既能产生特异抗体又能无限增殖的杂交瘤细胞。(4)若通过基因工程制备大量单一抗体，可将含有抗体基因的重组DNA分子导入小鼠骨髓瘤细胞，在该细胞内表达产生相应的抗体。
2．下图是某研究小组利用基因工程技术将抗农药马拉硫磷小菜蛾的羧酸酯酶(CarE)基因导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图。
据图回答下列问题：
(1)过程①是以mRNA为模板，在______________的催化下，合成互补的单链DNA，然后在____________的作用下合成双链DNA，从而获得所需基因。
(2)过程②需要使用______________扩增目的基因，需要在反应体系中添加的有机物质有引物、模板DNA、4种脱氧核糖核苷酸和____________________。
(3)CarE基因和质粒用_______________切割后，通过DNA连接酶连接，形成重组DNA分子。
(4)过程③是将目的基因导入大肠杆菌细胞，在基因工程中通常用的方法为________。
A．Ca2＋处理大肠杆菌B．显微注射法
C．农杆菌转化法D．基因枪法
(5)过程④可利用________________(分子检测技术)鉴定目的基因是否已导入受体细胞。
(6)以上过程中，________是基因工程的核心步骤。
A．过程①和②B．形成重组DNA分子
C．过程③D．过程④
答案 (1)逆转录酶 DNA聚合酶 (2)PCR技术 TaqDNA聚合酶 (3)相同的限制性核酸内切酶 (4)A (5)DNA分子杂交技术 (6)B
解析 (1)以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，合成互补的DNA单链，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA。(2)扩增目的基因需要用到PCR技术，反应体系需要引物、模板、原料以及TaqDNA聚合酶。(3)目的基因和表达载体用限制性核酸内切酶切割后，再通过DNA连接酶连接，以形成重组DNA分子。(4)用CaCl2处理大肠杆菌，增加其细胞壁的通透性，利于目的基因导入大肠杆菌。(5)目的基因是否导入受体细胞可以用DNA分子杂交技术检测。(6)基因工程的核心步骤是形成重组DNA分子。
3．(2019·浙江七彩阳光联考)回答与植物克隆和动物克隆有关的问题：
(1)植物组织培养：将经过________的植物组织块，放在半固体培养基上培养，获得一团由________________的薄壁细胞组成的愈伤组织，再以适当配比的营养物质和生长调节剂诱导再生出新植株。培养过程中不同植物细胞全能性表达程度有很大的不同，是因为不同植物之间存在________________。
(2)动物细胞培养：首先用胰蛋白酶消化动物组织中的____________和细胞外的其他成分，获得________的细胞悬浮液；然后在人工控制的条件下培养，由于细胞之间的相互依存，培养的细胞也会像在体内一样呈现一定的____________。
(3)下列关于植物克隆和动物克隆的叙述，正确的是____。
A．离体的植物组织或器官都必须通过脱分化才能形成愈伤组织
B．植物组织培养过程中都会形成细胞质丰富、液泡小而细胞核大的胚性细胞
C．在动物细胞培养时，培养保持接触抑制的细胞在卡氏瓶上可形成多层细胞
D．同属于一个细胞系的细胞群，由于来自一个共同的祖细胞，所以称为纯系
答案 (1)消毒 相对没有发生分化 遗传性的差异 (2)胶原纤维 单个 组织特性 (3)A
解析 (1)植物组织培养过程：将经过消毒的植物组织块放在半固体培养基上进行培养，获得一团由没有发生分化的薄壁细胞组成的愈伤组织，再以适当配比的营养物质和生长调节剂诱导再生出新植株。培养过程中不同植物细胞全能性表达程度有很大的不同，是因为不同植物之间存在遗传性的差异。(2)动物细胞培养过程：首先用胰蛋白酶消化动物组织中的胶原纤维和细胞外的其他成分，获得单个的细胞悬浮液；然后在人工控制的条件下培养，由于细胞之间的相互依存，培养的细胞也会像在体内一样呈现一定的组织特性。(3)离体的植物组织或器官都必须通过脱分化才能形成愈伤组织，A正确；植物组织培养过程中形成的愈伤组织经液体悬浮培养可以获得细胞质丰富、液泡小而细胞核大的胚性细胞，B错误；在动物细胞培养时，培养保持接触抑制的细胞在卡氏瓶上形成单层细胞，C错误；经过克隆以后的细胞的后裔细胞群，由于来源于一个共同的祖细胞，所以称为纯系，D错误。
4．(2019·浙江超级全能生联考)重瓣紫堇具有较高观赏和药用价值，但自然状态下几乎高度不育。为解决重瓣紫堇的繁殖难题，科学家利用另一种植物的可育基因M，完成了对重瓣紫堇的改造，流程如图所示[图中箭头指的是不同限制性核酸内切酶(简称限制酶)识别的位点]：
请回答下列问题：
(1)操作中应选用的限制性核酸内切酶是__________________，以避免质粒自身环化、错向连接等问题。连接目的基因和质粒时，关键需要催化____________键的形成。
(2)导入受体细胞时，应选用CaCl2处理____________，使其__________________，从而有利于重组质粒的导入。
(3)利用紫堇根尖细胞培养成完整植株，依据的原理是________________。理论上，________(填“能”或“不能”)用紫堇的叶肉细胞代替根尖细胞完成上述改造工作。
(4)若图中所得的转基因紫堇植株自交一代，子代中能稳定遗传的个体所占的比例为________。
答案 (1)Hind Ⅲ和XhⅠ 磷酸二酯 (2)农杆菌 细胞壁通透性增大(或处于感受态) (3)细胞的全能性 能 (4)1/4
解析 (1)质粒和目的基因所在DNA均存在三个限制性核酸内切酶的酶切位点，且BalⅠ酶切位点处于目的基因M的中间，不适宜选用，因此应该选择Hind Ⅲ和XhⅠ进行酶切，且可避免质粒自身环化、错向连接等问题；目的基因与质粒的连接需要DNA连接酶，具体催化形成的化学键是磷酸二酯键。(2)本题采用的是农杆菌转化法，重组质粒首先导入农杆菌，再借助农杆菌侵染植物细胞，将农杆菌细胞内的目的基因转移至植物细胞中，因此CaCl2处理的对象是农杆菌，其具体机理是使细菌细胞壁通透性增大或使细菌细胞处于感受态。(3)植物组织培养的理论基础是细胞的全能性，由于叶肉细胞同样具有本物种生长、发育、繁殖的全部遗传信息，所以也可作为受体细胞进行培养。(4)该转基因植物的基因型可写作MO型，在自交时，相当于杂合子，会导致后代性状分离，具体为MM∶MO∶OO＝1/4∶1/2∶1/4，可稳定遗传的植株基因型为MM，占1/4。
5．(2019·浙江稽阳联考)研究人员利用基因敲除技术将猪的肌生成抑制蛋白基因敲除，从而得到了高骨骼肌含量的克隆猪。请回答下列有关问题：
(1)常用的基因敲除技术是通过同源重组将外源基因定点整合到靶细胞基因组上某一确定的位点，以定点修饰改造染色体上某一基因。相对传统的转基因技术，该基因敲除技术的最大优点是_______________________________________________________________________。要实现敲除肌生成抑制蛋白基因的目的，首先要构建替换型打靶载体，该过程中需要的工具酶有________________________________________________________________________。
(2)将替换型打靶载体通过显微注射法导入猪胚胎干细胞，胚胎干细胞是从着床前早期胚胎中分离出的________的细胞，它具有向各种组织细胞分化的潜能。培养猪胚胎干细胞时，首先要在培养皿底部制备一层细胞，这层细胞一般是____________________。
(3)筛选出靶细胞，导入猪的________中，再将其植入代孕猪体内，使其发育成嵌合体猪，再经过回交、筛选就可以得到肌生成抑制蛋白基因敲除纯合子。为了快速扩大基因敲除猪的种群，除进行有性生殖外，还可以采取胚胎分割和______________技术。
(4)为证明肌生成抑制蛋白基因敲除猪的表现型改变确实是由于敲除了该基因的缘故，可以通过导入肌生成抑制蛋白基因或者直接注射________________，如果猪表现型转为正常，则说明确实是由于敲除了肌生成抑制蛋白基因的缘故。
答案 (1)克服了传统转基因技术中目的基因整合的盲目性和随机性(能够定点整合) 限制性核酸内切酶和DNA连接酶
(2)内细胞团 胚胎成纤维细胞
(3)囊胚 细胞核移植(克隆繁殖)
(4)肌生成抑制蛋白
解析 (1)基因敲除避免了传统基因工程中目的基因的随机整合；构建替换型打靶载体需要的工具酶有限制性核酸内切酶和DNA连接酶。(2)胚胎干细胞是早期囊胚的内细胞团的细胞；培养猪胚胎干细胞时首先要在培养皿底部制备一层饲养层细胞，其一般是胚胎成纤维细胞。(3)基因敲除胚胎干细胞应该导入囊胚；为了快速扩大基因敲除猪的数量，除进行有性生殖外，还可以采取胚胎分割技术和细胞核移植(克隆繁殖)技术。(4)改变表现型可以通过重新导入该基因或者注射相应蛋白质实现。
6．科研人员拟将已知的花色基因(目的基因)转入矮牵牛的核基因组中，培育新花色的矮牵牛。请回答下列问题：
(1)为了获得大量的目的基因，将目的基因与含有抗生素抗性基因的质粒DNA连接形成重组DNA，再与经________(A.氯化钙 B．氯化钠 C．蔗糖 D．葡萄糖)处理的大肠杆菌液混合，使重组DNA进入大肠杆菌。用_________的玻璃刮刀将稀释后的大肠杆菌液______接种到含有抗生素的固体培养基上，经培养形成________，再进行鉴定和扩大培养。
(2)从扩大培养的大肠杆菌中提取含有目的基因的DNA，用________________________分别切割含目的基因的DNA和农杆菌的Ti质粒，然后用______________连接，形成重组DNA并导入农杆菌。
(3)提取叶片组织的DNA，采用PCR技术________，再鉴定目的基因是否成功导入。
(4)为判断本研究是否达到预期目的，可比较转基因植株和非转基因植株的________性状。
答案 (1)A 灭菌 涂布 单菌落 (2)同一种限制性核酸内切酶 DNA连接酶 (3)扩增 (4)花色
解析 (1)重组DNA分子导入大肠杆菌前，需要用氯化钙处理大肠杆菌，以增加其细胞壁的通透性。若要鉴定大肠杆菌中是否导入重组DNA，需要用涂布分离的方法将大肠杆菌用经过灭菌的玻璃刮刀涂布到含有抗生素的固体培养基上进行培养，待培养成单菌落再进行鉴定和扩大培养。(2)用同一种限制性核酸内切酶切割含目的基因的DNA和质粒。(3)提取叶片组织的DNA，采用PCR技术扩增，再鉴定目的基因是否成功导入。(4)该研究的目的基因是已知的花色基因，若要判断是否达到预期目的，只要比较转基因植株和非转基因植株的花色性状即可。
7．(2019·浙江新高考研究联盟联考)回答与基因工程和动物克隆有关的问题：
(1)以人基因组DNA为模板，采用__________扩增人胰岛素原基因，然后将其与含有标记基因的载体用相同的________________切割之后，用DNA连接酶将目的基因和载体连接在一起形成重组DNA分子。
(2)若要利用转基因动物的乳腺来生产人胰岛素，则可将重组DNA分子用________的方法导入动物的受精卵中，受精卵在体外培养到________阶段，再移植到代孕母体的____________，之后着床、并继续生长发育。也可以将重组DNA分子先导入动物的体细胞中，再通过标记基因的表现来筛选出含有人胰岛素原基因的体细胞，然后在一定物质的介导下使其与去核卵细胞进行________形成一个重建的“合子”，经过胚激活、胚胎培养和胚胎移植后得到转基因动物。
(3)相比细菌基因工程，以转基因动物的乳腺作为反应器来生产人胰岛素的优点是
________________________________________________________________________。
答案 (1)PCR技术 限制性核酸内切酶
(2)显微注射 早期囊胚 子宫角或输卵管 细胞融合(或融合)
(3)乳腺细胞可以将无生物活性的胰岛素原蛋白加工成有生物活性的胰岛素
解析 (1)目的基因可采用PCR技术进行扩增；对目的基因和载体用相同的限制性核酸内切酶进行切割，产生相同的末端，再用DNA连接酶进行连接形成重组DNA分子。(2)将目的基因导入动物细胞常采用显微注射法，当受精卵在体外培养到早期囊胚时，再移植到代孕母体的子宫角或输卵管，之后胚胎在子宫着床，并继续生长发育。利用动物细胞来生产人的胰岛素，也可将重组DNA先导入动物的体细胞，再筛选出含有人胰岛素原基因的体细胞，然后在一定物质的介导下使其与去核卵母细胞进行融合，经胚激活、胚胎移植后得到转基因动物。(3)细菌中无内质网、高尔基体等细胞器，因此通过细菌基因工程生产的人的胰岛素没有生物学活性，而转基因动物的乳腺细胞可以将无生物活性的胰岛素原蛋白加工成有生物活性的胰岛素。
8．下图是制备抗埃博拉病毒VP40蛋白的单克隆抗体的过程，请回答下列问题：
(1)过程①中选用EcRⅠ和XhⅠ两种限制性核酸内切酶切割的优点是_____________，
此外还要用到________________酶。
(2)过程②中首先需要用________处理大肠杆菌，增加大肠杆菌细胞壁的通透性，使重组DNA分子更易进入大肠杆菌。
(3)除用聚乙二醇和电融合技术外，过程④还可使用的方法是用________________处理。通常在选择培养基中需加入抗生素，目的是_________________________________________。
选择培养基上存活的杂交瘤细胞产生的抗体________(填“是”或“不是”)单克隆抗体。
(4)图示过程应用的生物技术有__________________________________________________
(至少答出三种)。
答案 (1)防止目的基因自身环化(其他合理答案亦可) DNA连接 (2)CaCl2 (3)灭活的仙台病毒 防止培养过程中的污染 不是 (4)基因工程、动物细胞培养、动物细胞融合
解析 (1)过程①中选用EcRⅠ和XhⅠ两种限制性核酸内切酶切割可以使目的基因的两端获得不同的粘性末端，所以这样处理的优点是防止目的基因自身环化、错向连接等问题，此外目的基因与载体结合还需要DNA连接酶。
(2)过程②是将目的基因导入受体细胞，此过程首先需要用CaCl2处理大肠杆菌，增加大肠杆菌细胞壁的通透性，使重组DNA分子更易进入大肠杆菌。
(3)动物细胞融合常用的诱导方法有聚乙二醇和灭活的仙台病毒及电融合技术。通常在选择培养基中需加入抗生素，目的是防止培养过程中的污染。选择培养基上存活的杂交瘤细胞，还需要进行克隆化培养和抗体检测，经过多次筛选才可以获得单克隆抗体。所以选择培养基上存活的杂交瘤细胞产生的抗体不是单克隆抗体。
(4)图示过程应用的生物技术有基因工程、动物细胞培养、动物细胞融合。
名称
过程
形成体特点
培养基
光
脱分化
由外植体脱分化为愈伤组织
排列疏松、高度液泡化的薄壁细胞团
适当配比的营养物质和生长调节剂
避光
再分化
由愈伤组织分化为幼苗或胚状结构
有根、芽或有生根发芽的能力
适量的生长素和细胞分裂素配比可以诱导芽的分化；适量的吲哚乙酸及适当减除其他某些激素，可以诱导生根
需光
营养生长和生殖生长
发育成完整的植物体
由根、茎、叶、花、果实、种子组成
自身产生各种激素
需光
植物组织培养
外植体脱分化形成愈伤组织(薄壁细胞)，再分化发育成幼胚，进而形成植株
液体悬浮培养
愈伤组织在摇床上分散成单个细胞，再发育成胚状体，进而形成植株
原生质体培养
利用纤维素酶和果胶酶分解细胞壁，获得原生质体，用适当方法进行原生质体培养，获得新植株
转基因技术
利用植物细胞全能性将植物细胞培养成完整植株，克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造植物的性状
植物体细胞杂交
利用植物细胞全能性将杂种细胞培养成完整植株，克服远缘杂交不亲和的障碍
花药离体培养
进行单倍体克隆，获得单倍体植株