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高中生物人教版 (2019)选择性必修3第1节 重组DNA技术的基本工具教课内容ppt课件
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这是一份高中生物人教版 (2019)选择性必修3第1节 重组DNA技术的基本工具教课内容ppt课件，共27页。PPT课件主要包含了提取DNA的方法，实验原理，实验材料，实验步骤，实验梳理，本实验中有三次过滤，获得含DNA的滤液，获取DNA粘稠物，得到含DNA的滤液等内容，欢迎下载使用。
我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝收。大量施用农药杀虫不仅会提高生产成本，还可能造成农产品和环境的污染。要是能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种，这一问题就会迎刀而解，我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉就是在这样的背景下产生的。为什么传统的杂交育种方法培育不出抗虫棉，基因工程却可以呢?基因工程是如何进行操作的?它给我们的生产和生活带来了怎样的影响?
1.1944年，艾弗里（O. Avery， 1877-1955）等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。2.1950年，埃德曼（，1916-1977）发明了一种测定氨基酸序列的方法。2年后，桑格（F.Sanger，1918-2013）首次完成了对胰岛素氨基酸序列的测定。3. 1953年，沃森（，1928一）和克里克（F.Crick，1916-2004）建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。4.1958年，梅塞尔森（M. Meselsn， 1930-）和斯塔尔（，（M.1929——）用实验证明了DNA的半保留复制。随后不久，克里克提出中心法则。5.1961年，尼伦伯格（M. W. Nirenberg，1927-2010）和马太（J. H. Matthaei，1929一）破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被成功破译。
6.1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。7.1970年，科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。8.20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。9.1972年，伯格（P.Berg，1926一）首先在体外进行了DNA改造的研究，成功地构建了第一个体外重组DNA分子。10.1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
11.1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法，为基因序列图的绘制提供了可能。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。12. 1982年，第一个基因工程药物——重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。13.1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。此后，基因工程进入了迅速发展的阶段。14.1984年，我国科学家朱作言（1941一）领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。15.1985年，穆里斯（K. Mullis， 1944—2019）等人发明PCR，为获取目的基因提供了有效手段。16.1990年，人类基因组计划启动。2003年，该计划的测序任务顺利完成。
17.21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。18.2013年，华人科学家张锋（1982一）及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术——CRISPR（成类规律间隔短回文重复）技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
第一节 DNA重组技术的基本工具
在亚洲和非洲的贫困地区，人们由于无法获取足够的肉类和蔬菜，导致维生素A严重缺乏，据世界卫生组织估计，全世界有1.2亿~2.5亿人缺乏维生素A，每年约有100多万儿童因缺乏维生素A失去生命。胡萝卜素可在人体内转变成维生素A，因此，科学家利用基因工程技术，将有关酶的基因转入水稻中，并诱导它们在水稻细胞中表达，使水稻体内能够合成β-胡萝卜素。如果人每天食用的大米含β-胡萝卜素，就能满足人体对维生素A的需求。人们是怎样将胡萝卜体内的基因转移到水稻体内的呢？这个过程中需要哪些技术和操作工具呢？
基因工程也叫DNA重组技术（DNA recmbinant technique），即按照人们预先设计的蓝图，通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体结合，然后转入受体细胞，通过复制、转录、翻译，使转基因生物获得新的遗传性状。基因工程可以打破物种之间的生殖隔离，使基因在不同生物之间进行交流，从而赋予生物新的遗传特性。
（1）目的：按照人们的意愿定向改变生物的的遗传性状（2）优点：克服远缘杂交不亲和障碍
重组DNA技术需要三种“分子工具”，即准确切割DNA分子的“分子手术刀”、将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”和将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”
[资料1]1970年，史密斯（）等人首次从大肠杆菌中提取出了一种限制性内切核酸酶（restrictin endnuclease）。这种内切核酸酶能够识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特异性的位点上把双链DNA分子“切割”开（如图）。DNA被切割后所产生的交错的切口，也就是在每条链的一端留下的单链末端，叫做黏性末端。
1.从微生物体内分离出来2.每种限制酶只能识别DNA分子中的特定脱氧核苷酸序列，并在特定位置将DNA分子“切割”开。3.“切割”的是磷酸二酯键4.切口有两种：黏性末端和平末端
（大部分限制酶切割结果为黏性末端）
3.“切割”的是磷酸二酯键
[资料2]1967年，科学家们发现了一种能够将两个DNA片段连接起来的酶，可以用它来修复DNA链的断裂口，并把这种酶叫做DNA连接酶。1970年，科学家们又提取了一种具有更高活性的T4 DNA连接酶。当两个DNA片段的黏性末端彼此相临，而且它们的碱基能够互补配对时，DNA连接酶就能把它们之间的缝隙“缝合”起来（如图）。
[资料3]1972年，美国的伯格（P.Berg）等人用一种限制性内切酶在体外分别将猿猴体内的一种病毒的DNA和λ噬菌体的DNA进行酶切，然后分离出各自的酶切片段，又用T4DNA连接酶将它们连接起来，构建了世界上首例体外重组的杂合DNA分子。
1.基因针线—— DNA连接酶 （T4连接酶和E·cli 连接酶） 将切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，要靠DNA连接酶（DNA ligase）来实现。当两个DNA片段的黏性末端彼此靠拢，相互识别，它们的碱基完成互补配对后，DNA连接酶就把它们之间的缝隙“缝合”起来。
2.T4连接酶既可以接连黏性末端也可以连接平末端，但连接平末端的效率相对较低；E·cli 连接酶只能连接黏性末端。
[资料4]1973年，美国科学家科恩（S.Chen）等人从大肠杆菌中提取出了两种质粒，一种含有卡那霉素抗性基因，另一种含有四环素抗性基因。他们将这两种基因分别“切割”下来，并拼接在同一个质粒上，然后导入大肠杆菌，产生了既抗卡那霉素又抗四环素的大肠杆菌。
（1）常用的工具：质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒。（2）质粒：一种较为理想的载体，它是独立于细菌拟核之外的很小的双链环状DNA分子，具有自我复制能力。有一个至多个限制酶切割位点，并含有一些抗生素抗性基因（如图），如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，这些基因可以作为鉴定和筛选重组DNA的标记基因。 （3）作为运载体应具有的特征：能自我复制；有一个或多个酶切位点；有启动子、终止子和标记基因。
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
（1）提取生物大分子的基本思路
选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子
（2）提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）
（1）DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精（2）在0.14ml/L的NaCl溶液中溶解度最低（3）DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色
新鲜洋葱或香蕉、菠菜、菜花、猪肝等；95%的酒精、2ml/L的NaCl溶液、二苯胺试剂
（1）称取约30g洋葱，切碎，然后放入研中，倒入10mL研磨液，充分研磨。（2）在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
（3）在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。
注意：（1）应沿一个方向快速搅拌，但也不能过快过猛，防止打碎DNA （2）冷却的酒精溶液（体积分数95％）作用：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。
（3）在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。（4）取两支20mL的试管，各加入2ml/L的NaC1溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaC1溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
注意：应沿一个方向快速搅拌，但也不能过快过猛，防止打碎DNA
冷却的酒精溶液（体积分数95％）作用：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。
第一次过滤获得DNA的滤液第二次过获得DNA粘稠物第三次过滤获得DNA的滤液
本实验两次析出DNA：
第一次：用0.14 ml/L的NaCI溶液析出DNA，目的是除去溶液中的杂质。第二次：用冷却的95％的酒精，获得含杂质较少的DNA丝状物
我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝收。大量施用农药杀虫不仅会提高生产成本，还可能造成农产品和环境的污染。要是能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种，这一问题就会迎刀而解，我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉就是在这样的背景下产生的。为什么传统的杂交育种方法培育不出抗虫棉，基因工程却可以呢?基因工程是如何进行操作的?它给我们的生产和生活带来了怎样的影响?
1.1944年，艾弗里（O. Avery， 1877-1955）等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。2.1950年，埃德曼（，1916-1977）发明了一种测定氨基酸序列的方法。2年后，桑格（F.Sanger，1918-2013）首次完成了对胰岛素氨基酸序列的测定。3. 1953年，沃森（，1928一）和克里克（F.Crick，1916-2004）建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。4.1958年，梅塞尔森（M. Meselsn， 1930-）和斯塔尔（，（M.1929——）用实验证明了DNA的半保留复制。随后不久，克里克提出中心法则。5.1961年，尼伦伯格（M. W. Nirenberg，1927-2010）和马太（J. H. Matthaei，1929一）破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被成功破译。
6.1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。7.1970年，科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。8.20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。9.1972年，伯格（P.Berg，1926一）首先在体外进行了DNA改造的研究，成功地构建了第一个体外重组DNA分子。10.1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
11.1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法，为基因序列图的绘制提供了可能。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。12. 1982年，第一个基因工程药物——重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。13.1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。此后，基因工程进入了迅速发展的阶段。14.1984年，我国科学家朱作言（1941一）领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。15.1985年，穆里斯（K. Mullis， 1944—2019）等人发明PCR，为获取目的基因提供了有效手段。16.1990年，人类基因组计划启动。2003年，该计划的测序任务顺利完成。
17.21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。18.2013年，华人科学家张锋（1982一）及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术——CRISPR（成类规律间隔短回文重复）技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
第一节 DNA重组技术的基本工具
在亚洲和非洲的贫困地区，人们由于无法获取足够的肉类和蔬菜，导致维生素A严重缺乏，据世界卫生组织估计，全世界有1.2亿~2.5亿人缺乏维生素A，每年约有100多万儿童因缺乏维生素A失去生命。胡萝卜素可在人体内转变成维生素A，因此，科学家利用基因工程技术，将有关酶的基因转入水稻中，并诱导它们在水稻细胞中表达，使水稻体内能够合成β-胡萝卜素。如果人每天食用的大米含β-胡萝卜素，就能满足人体对维生素A的需求。人们是怎样将胡萝卜体内的基因转移到水稻体内的呢？这个过程中需要哪些技术和操作工具呢？
基因工程也叫DNA重组技术（DNA recmbinant technique），即按照人们预先设计的蓝图，通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体结合，然后转入受体细胞，通过复制、转录、翻译，使转基因生物获得新的遗传性状。基因工程可以打破物种之间的生殖隔离，使基因在不同生物之间进行交流，从而赋予生物新的遗传特性。
（1）目的：按照人们的意愿定向改变生物的的遗传性状（2）优点：克服远缘杂交不亲和障碍
重组DNA技术需要三种“分子工具”，即准确切割DNA分子的“分子手术刀”、将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”和将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”
[资料1]1970年，史密斯（）等人首次从大肠杆菌中提取出了一种限制性内切核酸酶（restrictin endnuclease）。这种内切核酸酶能够识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特异性的位点上把双链DNA分子“切割”开（如图）。DNA被切割后所产生的交错的切口，也就是在每条链的一端留下的单链末端，叫做黏性末端。
1.从微生物体内分离出来2.每种限制酶只能识别DNA分子中的特定脱氧核苷酸序列，并在特定位置将DNA分子“切割”开。3.“切割”的是磷酸二酯键4.切口有两种：黏性末端和平末端
（大部分限制酶切割结果为黏性末端）
3.“切割”的是磷酸二酯键
[资料2]1967年，科学家们发现了一种能够将两个DNA片段连接起来的酶，可以用它来修复DNA链的断裂口，并把这种酶叫做DNA连接酶。1970年，科学家们又提取了一种具有更高活性的T4 DNA连接酶。当两个DNA片段的黏性末端彼此相临，而且它们的碱基能够互补配对时，DNA连接酶就能把它们之间的缝隙“缝合”起来（如图）。
[资料3]1972年，美国的伯格（P.Berg）等人用一种限制性内切酶在体外分别将猿猴体内的一种病毒的DNA和λ噬菌体的DNA进行酶切，然后分离出各自的酶切片段，又用T4DNA连接酶将它们连接起来，构建了世界上首例体外重组的杂合DNA分子。
1.基因针线—— DNA连接酶 （T4连接酶和E·cli 连接酶） 将切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，要靠DNA连接酶（DNA ligase）来实现。当两个DNA片段的黏性末端彼此靠拢，相互识别，它们的碱基完成互补配对后，DNA连接酶就把它们之间的缝隙“缝合”起来。
2.T4连接酶既可以接连黏性末端也可以连接平末端，但连接平末端的效率相对较低；E·cli 连接酶只能连接黏性末端。
[资料4]1973年，美国科学家科恩（S.Chen）等人从大肠杆菌中提取出了两种质粒，一种含有卡那霉素抗性基因，另一种含有四环素抗性基因。他们将这两种基因分别“切割”下来，并拼接在同一个质粒上，然后导入大肠杆菌，产生了既抗卡那霉素又抗四环素的大肠杆菌。
（1）常用的工具：质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒。（2）质粒：一种较为理想的载体，它是独立于细菌拟核之外的很小的双链环状DNA分子，具有自我复制能力。有一个至多个限制酶切割位点，并含有一些抗生素抗性基因（如图），如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，这些基因可以作为鉴定和筛选重组DNA的标记基因。 （3）作为运载体应具有的特征：能自我复制；有一个或多个酶切位点；有启动子、终止子和标记基因。
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
（1）提取生物大分子的基本思路
选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子
（2）提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）
（1）DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精（2）在0.14ml/L的NaCl溶液中溶解度最低（3）DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色
新鲜洋葱或香蕉、菠菜、菜花、猪肝等；95%的酒精、2ml/L的NaCl溶液、二苯胺试剂
（1）称取约30g洋葱，切碎，然后放入研中，倒入10mL研磨液，充分研磨。（2）在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
（3）在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。
注意：（1）应沿一个方向快速搅拌，但也不能过快过猛，防止打碎DNA （2）冷却的酒精溶液（体积分数95％）作用：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。
（3）在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2~3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。（4）取两支20mL的试管，各加入2ml/L的NaC1溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaC1溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
注意：应沿一个方向快速搅拌，但也不能过快过猛，防止打碎DNA
冷却的酒精溶液（体积分数95％）作用：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。
第一次过滤获得DNA的滤液第二次过获得DNA粘稠物第三次过滤获得DNA的滤液
本实验两次析出DNA：
第一次：用0.14 ml/L的NaCI溶液析出DNA，目的是除去溶液中的杂质。第二次：用冷却的95％的酒精，获得含杂质较少的DNA丝状物
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