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高中生物浙科版 (2019)选择性必修3 生物技术与工程第四章 基因工程第一节 基因工程赋予生物新的遗传特性图片课件ppt
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这是一份高中生物浙科版 (2019)选择性必修3 生物技术与工程第四章 基因工程第一节 基因工程赋予生物新的遗传特性图片课件ppt，共20页。PPT课件主要包含了第4课时，方法步骤，凝胶电泳技术等内容，欢迎下载使用。
活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
1．活动原理：扩增原理：聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增特定基因或DNA片段的技术，经过多次循环变性、退火、延伸三个步骤，可获得大量的目的基因或DNA片段。本活动使用PCR技术扩增酵母细胞中编码核糖体RNA的DNA部分片段，再通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。鉴定原理：使用亚甲基蓝对凝胶进行染色，再用75%酒精以及蒸馏水脱色，观察并分析琼脂糖凝胶中DNA条带。
该技术是分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的常用方法。电泳是指带电粒子在电场作用下，向与其携带电荷相反的电极迁移的过程。不同带电粒子因分子大小、形状、所带电荷等因素不同，迁移速率也会有所差异。核酸是带负电荷的生物大分子，其迁移速率主要受核酸片段长度影响。在电场强度一定时，核酸分子越大，向正极迁移速率越慢。电泳时常使用凝胶作为介质，凝胶的孔隙可起到分子筛的作用；凝胶浸没于电泳缓冲液中。电泳缓冲液的作用是在电泳过程中维持合适的PH，并使溶液具有一定的导电性，利于核酸迁移。 DNA片段根据长度大小在凝胶上分开，形成不连续的条带，每个条带包含的DNA片段长度是相同的。DNA本身是无色的，可以用荧光或放射性染料对DNA进行标记，或使用亚甲基蓝将DNA染成蓝色。 含有DNA条带的凝胶可以用刀片切割下来，回收凝胶中的DNA，从而达到提纯的目的。核酸分子大小采用碱基对数进行描述。DNA相对分子质量标准物（DNA Marker）是一组已知长度的和含量的标准DNA片段混合物，在电泳中能作为参照物。不同的DNA Marker所含的DNA片段的长度和含量是不同的。
利用电泳技术鉴定PCR扩增产物
2.材料用具 PCR仪，微量移液器及枪头，微量离心管，培养皿，三角瓶，封口膜，橡皮筋，冰盒，记号笔，三脚架，玻璃板，微波炉或水浴锅，离心机等；琼脂糖凝胶电泳设备，包括梳子、胶盒、水平电泳槽和电泳仪。（注意：枪头、微量离心管使用前需进行高压蒸汽灭菌。 ） 材料：食用高活性干酵母，即酿酒酵母。酵母细胞悬液：称取0.1g干酵母粉，置于盛有100mL无菌蒸馏水的三角瓶中，盖上封口膜并用皮筋绑好，摇匀后在温暖的环境下活化2h。 PCR相关试剂：以下溶液在-20℃条件下冷冻保存，使用前置于冰盒内或冰块上。 (1)市售10×扩增缓冲液（含 Mg2+)。(2)市售10mml/L4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)。(3)市售2U/uL TaqDNA聚合酶(U为酶活力单位，定义为30℃、最适pH、底物浓度饱和的条件下，1min转化1uml底物所需要的酶量)。(4)无菌水：将双蒸水在高压灭菌锅中灭菌，制成无菌水。(5) 10μml/L引物A溶液：序列为5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3'。用无菌水将市售引物稀释成10μml/L溶液。
(6) 10μml/L引物B溶液：序列为5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'。用无菌水将市售引物稀释成10μml/L溶液。电泳相关试剂：Tris-硼酸(TBE)电泳缓冲液：将市售50×电泳缓冲液稀释50倍。或配制5×TBE电泳缓冲液：称取54gTris，27.5g硼酸溶于800mL蒸馏水中，加入20mL的0.5ml/L EDTA，调节pH到8.0，加水定容至1L，室温保存备用，使用时稀释5倍。(2)市售6×上样缓冲液(lading buffer)；内含甘油可以增加样品密度，确保DNA能够沉入加样孔内；含有少许溴酚蓝作为电泳指示剂，电泳时溴酚蓝迁移速率较快，在其迁移出凝胶前关闭电泳仪电源。(3)市售DNA相对分子质量标准物(Marker)染色相关试剂：(1)0.1%亚甲基蓝溶液：称取0.1g亚甲基蓝溶于100mL蒸馏水中。避免接触皮肤和眼睛，避光保存。(2) 75%酒精。(3)保存于4℃条件下的蒸馏水。或使用0.002%亚甲基蓝溶液：将2mL的0.1%亚甲基蓝溶液加入10mL电泳缓冲液中，再加88mL蒸馏水，避光保存。
2．方法步骤：(1)PCR扩增：加液：使用微量移液器将PCR体系各成分加入0.2 mL已灭菌的微量离心管中，注意酵母细胞悬液需摇匀后再吸取，用微量移液器反复吹吸使反应液混合均匀。离心：以3 000 r/min的转速离心30 s，使反应液集中于微量离心管的底部。反应：将微量离心管放入PCR仪中，设置反应条件。 注意：微量移液器的灭菌和用法 P111
注意：使用微量移液器前，必须先装好相应的已灭菌一次性吸液枪头，避免液体进入微量移液器内部。推动按钮共有2挡停顿，一直按到底是第2挡。吸取液体时，先转动调节轮至目标体积（不要超出微量移液器量程），按压推动按钮至第1挡并缓慢抬起吸取相应体积的液体。放出液体时，再次按压推动按钮至第2挡，液体全部流出后抬起按钮，推动卸枪头按钮卸掉用过的枪头。枪头在每吸取一种溶液后更换一次，避免用手接触枪头。
(2)琼脂糖凝胶电泳 制备琼脂糖凝胶：溶化：称取琼脂糖0.25g，加到盛有25ml电泳缓冲液的三角瓶中。将三角瓶盖上封口膜并用橡皮筋绑住后，用微波炉或沸水浴加热，使琼脂糖溶化呈透明状。倒模：将琼溶化的脂糖倒入胶盒，若琼脂糖中有气泡，可用枪头除去气泡。凝固：待凝胶完全凝结，小心拔出梳子，凝胶上梳齿的位置成为加样孔。加液：将装有凝胶的胶托从胶盒中取出，放入电泳槽内，加样孔一端朝向负极，向电泳槽中加入电泳缓冲液，使其没过凝胶。
加样：用微量移液器向50μ LPCR产物中加入10μ L 6×上样缓冲液，并反复吹吸混合均匀。将20μ L样品混合液缓慢加到加样孔内（留第一个加样孔加 DNA Marker与上样缓冲液）。将20μ L DNA Marker与4μ L 6×上样缓冲液混合均匀，全部加到加样孔内。每加样一次需更换一次枪头.电泳：盖上电泳槽盖，连接好电极插头后再接通电源。将直流电泳仪的电压设置成80V，开始电泳。25min后关闭电源，停止电泳。注意观察溴酚蓝不要迁移出凝胶。
将凝胶放入培养皿，倒入0.1%亚甲基蓝溶液，没过凝胶约5mm，染色8min。轻轻晃动培养皿，让染液进入凝胶下表面与培养皿之间，不要留有气泡。染液使用后可回收利用。 倒入75%酒精没过凝胶约5mm，不断晃动培养皿1~1.5min。再倒去酒精。 加入冷的蒸馏水进行脱色。当出现清晰的蓝色区带时，倒去蒸馏水终止脱色。此过程中可更换被染蓝的蒸馏水。如果浸泡过久，颜色变淡直至无色
(3)染色 方案一
向盛有凝胶的培养皿中倒入0.002%亚甲基蓝溶液，没过凝胶约5mm。轻轻晃动培养皿，让染液进入凝胶下表面与培养皿之间。盖上培养皿盖，4℃冷藏过夜第二天观察到清晰的蓝色区带时，倒去染液，终止染色。染液可回收利用。
(4)观察①在桌上铺一张白纸，在光下手持盛有凝胶的培养皿距白纸5 cm以上，找到较为清晰的条带。蓝色条带即为DNA所在位置，注意观察条带的数目和位置。再将凝胶置于平的透明玻璃板上，放在三脚架上面进行观察并拍照。②用直尺紧贴凝胶表面测量DNA条带迁移距离，即每个DNA条带中央到加样孔的距离，记录于表中。根据已知Marker每个条带的位置和相应DNA片段长度，推测PCR产物长度。
PCR的产物一般通过凝胶电泳技术来鉴定。在电场作用下,凝胶中的DNA分子会向着一定的方向迁移,不同的DNA分子迁移速率不同。凝胶中的DNA分子经过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。下图是此过程的示意图,分析回答下列问题。
1.在电泳过程中,分子移动的方向是由什么决定的?提示 由分子所带电荷决定。在电场的作用下,带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。2.DNA分子的迁移速率与哪些因素有关?提示 在凝胶中,DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
3.如何区分DNA分子的具体大小(含有的碱基对数)?提示 需要在第一个加样孔中滴加DNA相对分子质量标准物(DNA Marker)作为参照物。4.观察DNA的电泳结果之前需要染色,常用的染色剂是什么?提示 亚甲基蓝,可将DNA染成蓝色。特别提醒(1)为避免外源DNA等因素的干扰,PCR实验中使用的微量移液管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌。(2)在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,微量移液器上的枪头都必须更换。
1.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时,得到以下电泳图谱。其中1号为DNA相对分子质量标准物(DNA Marker),10号为上样缓冲液。进行PCR时
加入的模板DNA如下图所示。下列据此做出的分析,不合理的是( )A.PCR产物的分子大小在250 bp至500 bp之间B.3号样品为不含目的基因的DNA片段C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
2.下图是利用PCR技术和电泳技术进行的某一次亲子鉴定结果图谱,请根据图谱和所学知识回答下列问题。
(1)PCR技术能把某一DNA分子片段进行扩增,它是利用了DNA的 原理,通过控制 来控制DNA的 。 (2)利用PCR技术扩增DNA的过程中还需要 酶的作用,但它必须在相应的 的作用下才能完成对DNA的复制。假设有一段DNA序列为: 5'-GTTAACCTTAG-3'3'-CAATTGGAATC-5'所用引物Ⅰ为5'-GTTA—OH,则引物Ⅱ为 。
(1)热变性 温度 解旋 (2)耐高温的Taq DNA聚合 引物 5'-CTAA—OH
(3)图①是含有21个氨基酸的多肽水解得到的氨基酸混合物电泳的结果,故可推知,该多肽由 种氨基酸构成。 (4)图②为某人和其母亲,以及待测定的四位男性的DNA,分别由酶处理后,生成若干DNA片段,并进行扩增,然后进行电泳所得到的一组DNA指纹图谱,请分析F1~F4中, 是该人真正生物学意义上的父亲。为什么? 。
(3)6 (4)F2 因为C和F2两者之间的DNA指纹图谱有相同的区段
活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
1．活动原理：扩增原理：聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增特定基因或DNA片段的技术，经过多次循环变性、退火、延伸三个步骤，可获得大量的目的基因或DNA片段。本活动使用PCR技术扩增酵母细胞中编码核糖体RNA的DNA部分片段，再通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。鉴定原理：使用亚甲基蓝对凝胶进行染色，再用75%酒精以及蒸馏水脱色，观察并分析琼脂糖凝胶中DNA条带。
该技术是分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的常用方法。电泳是指带电粒子在电场作用下，向与其携带电荷相反的电极迁移的过程。不同带电粒子因分子大小、形状、所带电荷等因素不同，迁移速率也会有所差异。核酸是带负电荷的生物大分子，其迁移速率主要受核酸片段长度影响。在电场强度一定时，核酸分子越大，向正极迁移速率越慢。电泳时常使用凝胶作为介质，凝胶的孔隙可起到分子筛的作用；凝胶浸没于电泳缓冲液中。电泳缓冲液的作用是在电泳过程中维持合适的PH，并使溶液具有一定的导电性，利于核酸迁移。 DNA片段根据长度大小在凝胶上分开，形成不连续的条带，每个条带包含的DNA片段长度是相同的。DNA本身是无色的，可以用荧光或放射性染料对DNA进行标记，或使用亚甲基蓝将DNA染成蓝色。 含有DNA条带的凝胶可以用刀片切割下来，回收凝胶中的DNA，从而达到提纯的目的。核酸分子大小采用碱基对数进行描述。DNA相对分子质量标准物（DNA Marker）是一组已知长度的和含量的标准DNA片段混合物，在电泳中能作为参照物。不同的DNA Marker所含的DNA片段的长度和含量是不同的。
利用电泳技术鉴定PCR扩增产物
2.材料用具 PCR仪，微量移液器及枪头，微量离心管，培养皿，三角瓶，封口膜，橡皮筋，冰盒，记号笔，三脚架，玻璃板，微波炉或水浴锅，离心机等；琼脂糖凝胶电泳设备，包括梳子、胶盒、水平电泳槽和电泳仪。（注意：枪头、微量离心管使用前需进行高压蒸汽灭菌。 ） 材料：食用高活性干酵母，即酿酒酵母。酵母细胞悬液：称取0.1g干酵母粉，置于盛有100mL无菌蒸馏水的三角瓶中，盖上封口膜并用皮筋绑好，摇匀后在温暖的环境下活化2h。 PCR相关试剂：以下溶液在-20℃条件下冷冻保存，使用前置于冰盒内或冰块上。 (1)市售10×扩增缓冲液（含 Mg2+)。(2)市售10mml/L4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)。(3)市售2U/uL TaqDNA聚合酶(U为酶活力单位，定义为30℃、最适pH、底物浓度饱和的条件下，1min转化1uml底物所需要的酶量)。(4)无菌水：将双蒸水在高压灭菌锅中灭菌，制成无菌水。(5) 10μml/L引物A溶液：序列为5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3'。用无菌水将市售引物稀释成10μml/L溶液。
(6) 10μml/L引物B溶液：序列为5'- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'。用无菌水将市售引物稀释成10μml/L溶液。电泳相关试剂：Tris-硼酸(TBE)电泳缓冲液：将市售50×电泳缓冲液稀释50倍。或配制5×TBE电泳缓冲液：称取54gTris，27.5g硼酸溶于800mL蒸馏水中，加入20mL的0.5ml/L EDTA，调节pH到8.0，加水定容至1L，室温保存备用，使用时稀释5倍。(2)市售6×上样缓冲液(lading buffer)；内含甘油可以增加样品密度，确保DNA能够沉入加样孔内；含有少许溴酚蓝作为电泳指示剂，电泳时溴酚蓝迁移速率较快，在其迁移出凝胶前关闭电泳仪电源。(3)市售DNA相对分子质量标准物(Marker)染色相关试剂：(1)0.1%亚甲基蓝溶液：称取0.1g亚甲基蓝溶于100mL蒸馏水中。避免接触皮肤和眼睛，避光保存。(2) 75%酒精。(3)保存于4℃条件下的蒸馏水。或使用0.002%亚甲基蓝溶液：将2mL的0.1%亚甲基蓝溶液加入10mL电泳缓冲液中，再加88mL蒸馏水，避光保存。
2．方法步骤：(1)PCR扩增：加液：使用微量移液器将PCR体系各成分加入0.2 mL已灭菌的微量离心管中，注意酵母细胞悬液需摇匀后再吸取，用微量移液器反复吹吸使反应液混合均匀。离心：以3 000 r/min的转速离心30 s，使反应液集中于微量离心管的底部。反应：将微量离心管放入PCR仪中，设置反应条件。 注意：微量移液器的灭菌和用法 P111
注意：使用微量移液器前，必须先装好相应的已灭菌一次性吸液枪头，避免液体进入微量移液器内部。推动按钮共有2挡停顿，一直按到底是第2挡。吸取液体时，先转动调节轮至目标体积（不要超出微量移液器量程），按压推动按钮至第1挡并缓慢抬起吸取相应体积的液体。放出液体时，再次按压推动按钮至第2挡，液体全部流出后抬起按钮，推动卸枪头按钮卸掉用过的枪头。枪头在每吸取一种溶液后更换一次，避免用手接触枪头。
(2)琼脂糖凝胶电泳 制备琼脂糖凝胶：溶化：称取琼脂糖0.25g，加到盛有25ml电泳缓冲液的三角瓶中。将三角瓶盖上封口膜并用橡皮筋绑住后，用微波炉或沸水浴加热，使琼脂糖溶化呈透明状。倒模：将琼溶化的脂糖倒入胶盒，若琼脂糖中有气泡，可用枪头除去气泡。凝固：待凝胶完全凝结，小心拔出梳子，凝胶上梳齿的位置成为加样孔。加液：将装有凝胶的胶托从胶盒中取出，放入电泳槽内，加样孔一端朝向负极，向电泳槽中加入电泳缓冲液，使其没过凝胶。
加样：用微量移液器向50μ LPCR产物中加入10μ L 6×上样缓冲液，并反复吹吸混合均匀。将20μ L样品混合液缓慢加到加样孔内（留第一个加样孔加 DNA Marker与上样缓冲液）。将20μ L DNA Marker与4μ L 6×上样缓冲液混合均匀，全部加到加样孔内。每加样一次需更换一次枪头.电泳：盖上电泳槽盖，连接好电极插头后再接通电源。将直流电泳仪的电压设置成80V，开始电泳。25min后关闭电源，停止电泳。注意观察溴酚蓝不要迁移出凝胶。
将凝胶放入培养皿，倒入0.1%亚甲基蓝溶液，没过凝胶约5mm，染色8min。轻轻晃动培养皿，让染液进入凝胶下表面与培养皿之间，不要留有气泡。染液使用后可回收利用。 倒入75%酒精没过凝胶约5mm，不断晃动培养皿1~1.5min。再倒去酒精。 加入冷的蒸馏水进行脱色。当出现清晰的蓝色区带时，倒去蒸馏水终止脱色。此过程中可更换被染蓝的蒸馏水。如果浸泡过久，颜色变淡直至无色
(3)染色 方案一
向盛有凝胶的培养皿中倒入0.002%亚甲基蓝溶液，没过凝胶约5mm。轻轻晃动培养皿，让染液进入凝胶下表面与培养皿之间。盖上培养皿盖，4℃冷藏过夜第二天观察到清晰的蓝色区带时，倒去染液，终止染色。染液可回收利用。
(4)观察①在桌上铺一张白纸，在光下手持盛有凝胶的培养皿距白纸5 cm以上，找到较为清晰的条带。蓝色条带即为DNA所在位置，注意观察条带的数目和位置。再将凝胶置于平的透明玻璃板上，放在三脚架上面进行观察并拍照。②用直尺紧贴凝胶表面测量DNA条带迁移距离，即每个DNA条带中央到加样孔的距离，记录于表中。根据已知Marker每个条带的位置和相应DNA片段长度，推测PCR产物长度。
PCR的产物一般通过凝胶电泳技术来鉴定。在电场作用下,凝胶中的DNA分子会向着一定的方向迁移,不同的DNA分子迁移速率不同。凝胶中的DNA分子经过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。下图是此过程的示意图,分析回答下列问题。
1.在电泳过程中,分子移动的方向是由什么决定的?提示 由分子所带电荷决定。在电场的作用下,带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动。2.DNA分子的迁移速率与哪些因素有关?提示 在凝胶中,DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
3.如何区分DNA分子的具体大小(含有的碱基对数)?提示 需要在第一个加样孔中滴加DNA相对分子质量标准物(DNA Marker)作为参照物。4.观察DNA的电泳结果之前需要染色,常用的染色剂是什么?提示 亚甲基蓝,可将DNA染成蓝色。特别提醒(1)为避免外源DNA等因素的干扰,PCR实验中使用的微量移液管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌。(2)在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,微量移液器上的枪头都必须更换。
1.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时,得到以下电泳图谱。其中1号为DNA相对分子质量标准物(DNA Marker),10号为上样缓冲液。进行PCR时
加入的模板DNA如下图所示。下列据此做出的分析,不合理的是( )A.PCR产物的分子大小在250 bp至500 bp之间B.3号样品为不含目的基因的DNA片段C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
2.下图是利用PCR技术和电泳技术进行的某一次亲子鉴定结果图谱,请根据图谱和所学知识回答下列问题。
(1)PCR技术能把某一DNA分子片段进行扩增,它是利用了DNA的 原理,通过控制 来控制DNA的 。 (2)利用PCR技术扩增DNA的过程中还需要 酶的作用,但它必须在相应的 的作用下才能完成对DNA的复制。假设有一段DNA序列为: 5'-GTTAACCTTAG-3'3'-CAATTGGAATC-5'所用引物Ⅰ为5'-GTTA—OH,则引物Ⅱ为 。
(1)热变性 温度 解旋 (2)耐高温的Taq DNA聚合 引物 5'-CTAA—OH
(3)图①是含有21个氨基酸的多肽水解得到的氨基酸混合物电泳的结果,故可推知,该多肽由 种氨基酸构成。 (4)图②为某人和其母亲,以及待测定的四位男性的DNA,分别由酶处理后,生成若干DNA片段,并进行扩增,然后进行电泳所得到的一组DNA指纹图谱,请分析F1~F4中, 是该人真正生物学意义上的父亲。为什么? 。
(3)6 (4)F2 因为C和F2两者之间的DNA指纹图谱有相同的区段
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