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生物苏教版 (2019)第一节 基因工程及其技术教课ppt课件
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这是一份生物苏教版 (2019)第一节 基因工程及其技术教课ppt课件，共60页。PPT课件主要包含了基因工程的概念和原理，基因工程的基本工具，EcoRⅠ，SmaⅠ等内容，欢迎下载使用。
积极思维：荧光动物怎么培育的？
基因工程是在多学科基础上发展而来的
1957年，美国科学家科恩伯格等首次在大肠杆菌中发现了___________
1953年，沃森（,1928-）和克里克（F.Crick,1916-2004）建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1950年，埃德曼（,1916-1977）发明了一种测定氨基酸序列的方法。2年后，桑格（F.Sanger,1918-2013）首次完成了对胰岛素氨基酸序列的测定。
1944年，艾弗里（O. Avery, 1877-1955）等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
1958年，梅塞尔森（M. Meselsn, 1930-）和斯塔尔（F. W. Stahl,1929-）用实验证明了DNA的半保留复制。随后不久，克里克提出中心法则。
1967年，罗思和海林斯基发现转运工具—— （细菌除拟核外还有一种具有 能力的 分子）；同年，科学家又发现了___________
1970年，特明和巴尔的摩在RNA“肿瘤”病毒中发现了 ；同年，史密斯等人从流感嗜血杆菌中分离到一种特异性很强的______________
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1972年，伯格领导的研究小组在世界上首次实现了DNA分子 重组
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被成功破译。
科恩和博耶合作，将非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段与大肠杆菌的质粒进行重组，再用重组质粒转化大肠杆菌，成功转录出相应的mRNA，这说明_____________________
1973年，科恩领导的研究小组，将大肠杆菌不同的质粒重组，并转化大肠杆菌，获得了成功
真核生物的基因可以在原核生物中进行表达
1976年，科学家用质粒为载体，将生长激素释放 基因转入大肠杆菌，并于1977年首次生产出治疗肢端肥大症、巨人症的生长激素释放抑制因子
1977年，桑格测定了一种噬菌体的基因组序列，这是人类首次对____________的核苷酸排列顺序进行测定
1982年，第一个基因工程药物－重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。
2013年，华人科学家张锋（1982-）及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术－CRISPR（成簇规律间隔短回文重复）技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
1990年，人类基因组计划启动。2003年改计划的测序任务顺利完成
1985年，穆里斯（K. Mullis, 1944-2019）等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
1984年，我国科学家朱作言（1941-）领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。
1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。此后，基因工程进入了迅速发展的阶段。
基因工程在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等众多学科基础上发展而来
1.什么是基因？2.基因如何控制生物性状？
基因是有遗传效应的DNA片段。
又称为DNA重组技术，是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA，然后导入受体细胞，并使其在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。
积极思维：如图操作的理论基础？
（1）不同生物的DNA分子能拼接起来的原因分析（2）外源基因能够在受体内表达，并使受体表现出相应性状的原因分析
积极思维：基因工程操作的理论基础？
①基本组成单位相同：都是四种脱氧核苷酸。②双链DNA分子的空间结构相同：都是规则的双螺旋结构。③DNA碱基对之间的关系相同：均遵循严格的碱基互补配对原则。
①基因的功能特点：控制生物体性状的结构和功能单位，具有相对独立性。②遗传信息的传递方向都遵循中心法则。③生物界共用一套遗传密码。
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
“分子剪刀”——限制性内切核酸酶
[资料1]1970年，史密斯（）等人首次从大肠杆菌中提取出了一种限制性内切核酸酶（restrictin endnuclease）。这种内切核酸酶能够识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特异性的位点上把双链DNA分子“切割”开（如图）。DNA被切割后所产生的交错的切口，也就是在每条链的一端留下的单链末端，叫做黏性末端。
限制性内切核酸酶——“分子剪刀”
a.特点： （专一性）很强。b.作用：能识别 上特定的脱氧核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的 断开。
限制性内切核酸酶（又称限制酶）——“分子剪刀”
切割方式a.错位切：在DNA分子两条链的 部位进行切割，切割后形成的两个DNA分子片段的末端均留下一段游离的 ，这种单链称为 。
EcRI限制酶识别 的核苷酸序列，从 之间切开。
GAATTCCTTAAG
鸟嘌呤脱氧核苷酸和腺嘌呤脱氧核苷酸
切割方式b.平切：在DNA分子两条链上 的部位进行切割，切割后形成 。
SmaI限制酶识别 的核苷酸序列，从 之间切开。
CCCGGGGGGCCC
胞嘧啶脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸
①黏性末端②平末端在识别序列的中心轴线处切开，产生平末端。在识别序列的中心轴线两侧处切开，产生黏性末端。
大多数限制酶的识别序列由___个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由___个、___个或_________的核苷酸组成不同的限制酶识别的脱氧核苷酸序列一般不同
①无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，这就是回文序列。②能被限制酶特异性识别的切割部位基本都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。
A.形成的黏性末端（从5’往3’读）为_____B.一个限制酶切割一次断两个磷酸二酯键形成___个黏性末端C.同一种限制酶切割形成的黏性末端____D.两个黏性末端有___个游离的磷酸基团
大肠杆菌（Escherichia cli R）
练习：流感嗜血杆菌的d菌株（ Haemphilus influenzae d ）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内核酸切酶（限制酶）
（1）限制酶是一类酶而不是一种酶。
（2）限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键，而不是氢键。
（3）限制酶具有特异性，任何一种限制酶都只能识别和切断特定核苷酸序列，这是由酶的专一性所决定的。
（4）限制酶主要存在于微生物中，尤其是原核生物中
（5）限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成；后者是双链序列
（6）判断粘性末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是将黏性末端旋转180°，同一种限制酶切割形成的黏性末端应该是完全相同的结构
限制性内切核酸酶核心归纳
3．限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
1．推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
2．为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA……
……GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT……
核心探讨——使用EcRI剪切目的基因
4.要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性（平）末端？
要切两个切口，产生四个黏性（平）末端。
5.如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？
会产生相同的黏性（平）末端，然后让两者的黏性（平）末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。
用同种限制酶切割（EcRⅠ）
积极思维：把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
6.把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
“分子黏合剂”——DNA连接酶
[资料2]1967年，科学家们发现了一种能够将两个DNA片段连接起来的酶，可以用它来修复DNA链的断裂口，并把这种酶叫做DNA连接酶。1970年，科学家们又提取了一种具有更高活性的T4DNA连接酶。当两个DNA片段的黏性末端彼此相临，而且它们的碱基能够互补配对时，DNA连接酶就能把它们之间的缝隙“缝合”起来（如图）。
DNA连接酶——“分子黏合剂”
两个具有相同黏性末端的DNA分子的连接a.通过 可以将黏性末端的两条链之间的碱基连接起来。b.DNA分子基本骨架之间的 通过DNA连接酶的作用连接。②DNA连接酶的分布及作用a.分布：广泛存在于各种生物体内。b.作用：在DNA复制、 以及体内外重组过程中起着重要作用。
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
E·cli DNA连接酶 或T4DNA连接酶
即恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低
TCCAAG AATTCGGAATGAGGTTCTTAA GCCTTAC
AATTCGGTTAACTA GCCAATTGAT
AATTCCGTGCGGTTACGTG GGCACGCCAATGCACTTAA
ATACGAACTTCAATTACGGTACTGCGAGTATGCTTGAAGTTAATGCCATGACGCTCTTAA
1.能被DNA连接酶连接起的黏性末端应该具备什么特点？2.用DNA连接酶连接两个相同的黏性末端要连接几个磷酸二酯键？3.基因工程中能将DNA连接酶替换为DNA聚合酶吗？为什么？
DNA连接酶——“分子黏合剂”核心探讨
不能；DNA聚合酶只能催化单个脱氧核苷酸加到DNA片段上，而DNA连接酶是将两个DNA片段连接成完整的DNA分子。
DNA连接酶与DNA聚合酶区别
连接单个脱氧核苷酸形成单链
与DNA相关的几种酶的比较
（1）真核生物的基因可以在原核生物中进行表达（ ）（2）通过基因工程产生的变异是不定向的（ ）（3）DNA连接酶能将DNA两条单链之间的碱基通过氢键连接起来（ ）（4）E.cli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端（ ）（5）限制酶和解旋酶的作用部位相同（ ）
4.下图是4种限制酶的识别序列及其酶切位点，请思考回答下列问题：
（1）图中限制酶切割后产生黏性末端的是哪些酶？产生平末端的是哪些酶？如果是黏性末端，请画出切割后的末端。
酶1、酶2切割后为黏性末端，酶3、酶4切割后为平末端；酶1切割后的末端为：
（2）酶1与酶2切割后产生的片段能用DNA连接酶连接起来吗？如能连接，说明什么？
能；由此说明只要限制酶切割后产生的黏性末端互补（或相同）就可以用DNA连接酶连接起来。
5.不同生物的DNA分子能拼接起来的理论基础是什么？
（1）基本组成单位相同：都是四种脱氧核苷酸。（2）双链DNA分子的空间结构相同：都是规则的双螺旋结构。（3）DNA碱基对之间的关系相同：均遵循严格的碱基互补配对原则。
1.限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示，下列有关说法正确的是A.一个DNA分子中，酶a与酶b的识别序列 可能有多个B.酶a与酶b切出的黏性末端不能相互连接C.酶a与酶b切断的化学键不完全相同D.用酶a切割有3个切割位点的环状DNA分子，得到4种切割产物
2.在基因工程操作过程中，DNA连接酶的作用是A.将任意两个DNA片段连接起来B.将具有相同黏性末端的DNA片段连接起来，包括DNA片段和碱基对之 间的氢键C.连接具有互补黏性末端或平末端的DNA片段，即形成磷酸二酯键D.只连接具有相同黏性末端的DNA片段碱基对之间的氢键
“分子搬运工”——载体
[资料3]1973年，美国科学家科恩（S.Chen）等人从大肠杆菌中提取出了两种质粒，一种含有卡那霉素抗性基因，另一种含有四环素抗性基因。他们将这两种基因分别“切割”下来，并拼接在同一个质粒上，然后导入大肠杆菌，产生了既抗卡那霉素又抗四环素的大肠杆菌。
载体——“分子搬运工”
1.概念：将外源基因导入 ，并使其在受体细胞中稳定______ ，还需要一定的“分子搬运工”，基因工程上将它们称为载体。2.种类：质粒（最常用）、λ噬菌体的衍生物、动物病毒等。
①质粒的结构：质粒是一种 、 、 真核细胞细胞核或原核细胞拟核 ，并具有 的 。
质粒存在于细菌和酵母菌等生物细胞中，最常用的是大肠杆菌质粒。
小型环状 DNA 分子，其基因属于细胞质基因。
有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。
能复制并带着插入的目的基因一起复制
质粒DNA分子有一个至多个限制酶切割位点，供外源 DNA 片段插人其中；携带外源 DNA 片段的质粒进人受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体 DNA 上，随受体 DNA 同步复制；质粒上常有特殊的标记基因，便于重组 DNA 分子的筛选；质粒不影响受体细胞正常的生命活动。
④质粒作为载体的原因：
3.质粒载体应该具有的DNA序列
（1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存（2）有一个至多个限制酶切点（3）有某些标记基因（4）对受体细胞无害、易分离
能进入受体细胞并在受体细胞内复制并表达；
便于与不同目的基因结合
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
4、载体必须具备的条件：
（1）作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因（ ）（2）质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体（ ）（3）载体的作用是携带外源基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达（ ）（4）载体（如质粒）和细胞质膜中的载体蛋白的成分相同（ ）（5）基因工程上用作载体的质粒一般都经过人工改造（ ）
如图所示为大肠杆菌及质粒的结构模式图，据图探究以下问题：
1.a代表的物质和质粒都能进行自我复制，它们的化学本质都是 。
2.某外源基因切割末端为 ，若质粒也可用同种限制酶处理，质粒应有的一段核苷酸序列及被该限制酶切割后的末端分别是什么？
—ACGCGT— CGCGT——TGCGCA—； A—
3.氨苄青霉素抗性基因能控制某物质的合成，该物质能抵抗氨苄青霉素，使含有该基因的生物能在含氨苄青霉素的环境中存活。因此，氨苄青霉素抗性基因在基因工程载体上起什么作用？
用作标记基因，便于重组DNA分子的鉴定和筛选。
4.由以上分析总结作为载体必须具备哪些条件？
①必须有多种限制酶切割位点；②必须具备自我复制的能力；③必须具有适合的标记基因。
标记基因的筛选原理载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
3.作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是A.能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因B.具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达C.具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合D.对宿主细胞无伤害，以便于重组DNA分子的鉴定和选择
4.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因（目的基因）是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置（插入点有a、b、c）示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是
A.①是c；②是b；③是a B.①是a和b；②是a；③是bC.①是a和b；②是b；③是a D.①是c；②是a；③是b
积极思维：荧光动物怎么培育的？
基因工程是在多学科基础上发展而来的
1957年，美国科学家科恩伯格等首次在大肠杆菌中发现了___________
1953年，沃森（,1928-）和克里克（F.Crick,1916-2004）建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1950年，埃德曼（,1916-1977）发明了一种测定氨基酸序列的方法。2年后，桑格（F.Sanger,1918-2013）首次完成了对胰岛素氨基酸序列的测定。
1944年，艾弗里（O. Avery, 1877-1955）等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
1958年，梅塞尔森（M. Meselsn, 1930-）和斯塔尔（F. W. Stahl,1929-）用实验证明了DNA的半保留复制。随后不久，克里克提出中心法则。
1967年，罗思和海林斯基发现转运工具—— （细菌除拟核外还有一种具有 能力的 分子）；同年，科学家又发现了___________
1970年，特明和巴尔的摩在RNA“肿瘤”病毒中发现了 ；同年，史密斯等人从流感嗜血杆菌中分离到一种特异性很强的______________
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1972年，伯格领导的研究小组在世界上首次实现了DNA分子 重组
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被成功破译。
科恩和博耶合作，将非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段与大肠杆菌的质粒进行重组，再用重组质粒转化大肠杆菌，成功转录出相应的mRNA，这说明_____________________
1973年，科恩领导的研究小组，将大肠杆菌不同的质粒重组，并转化大肠杆菌，获得了成功
真核生物的基因可以在原核生物中进行表达
1976年，科学家用质粒为载体，将生长激素释放 基因转入大肠杆菌，并于1977年首次生产出治疗肢端肥大症、巨人症的生长激素释放抑制因子
1977年，桑格测定了一种噬菌体的基因组序列，这是人类首次对____________的核苷酸排列顺序进行测定
1982年，第一个基因工程药物－重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。
2013年，华人科学家张锋（1982-）及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术－CRISPR（成簇规律间隔短回文重复）技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
1990年，人类基因组计划启动。2003年改计划的测序任务顺利完成
1985年，穆里斯（K. Mullis, 1944-2019）等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
1984年，我国科学家朱作言（1941-）领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。
1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。此后，基因工程进入了迅速发展的阶段。
基因工程在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等众多学科基础上发展而来
1.什么是基因？2.基因如何控制生物性状？
基因是有遗传效应的DNA片段。
又称为DNA重组技术，是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA，然后导入受体细胞，并使其在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。
积极思维：如图操作的理论基础？
（1）不同生物的DNA分子能拼接起来的原因分析（2）外源基因能够在受体内表达，并使受体表现出相应性状的原因分析
积极思维：基因工程操作的理论基础？
①基本组成单位相同：都是四种脱氧核苷酸。②双链DNA分子的空间结构相同：都是规则的双螺旋结构。③DNA碱基对之间的关系相同：均遵循严格的碱基互补配对原则。
①基因的功能特点：控制生物体性状的结构和功能单位，具有相对独立性。②遗传信息的传递方向都遵循中心法则。③生物界共用一套遗传密码。
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
“分子剪刀”——限制性内切核酸酶
[资料1]1970年，史密斯（）等人首次从大肠杆菌中提取出了一种限制性内切核酸酶（restrictin endnuclease）。这种内切核酸酶能够识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特异性的位点上把双链DNA分子“切割”开（如图）。DNA被切割后所产生的交错的切口，也就是在每条链的一端留下的单链末端，叫做黏性末端。
限制性内切核酸酶——“分子剪刀”
a.特点： （专一性）很强。b.作用：能识别 上特定的脱氧核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的 断开。
限制性内切核酸酶（又称限制酶）——“分子剪刀”
切割方式a.错位切：在DNA分子两条链的 部位进行切割，切割后形成的两个DNA分子片段的末端均留下一段游离的 ，这种单链称为 。
EcRI限制酶识别 的核苷酸序列，从 之间切开。
GAATTCCTTAAG
鸟嘌呤脱氧核苷酸和腺嘌呤脱氧核苷酸
切割方式b.平切：在DNA分子两条链上 的部位进行切割，切割后形成 。
SmaI限制酶识别 的核苷酸序列，从 之间切开。
CCCGGGGGGCCC
胞嘧啶脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸
①黏性末端②平末端在识别序列的中心轴线处切开，产生平末端。在识别序列的中心轴线两侧处切开，产生黏性末端。
大多数限制酶的识别序列由___个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由___个、___个或_________的核苷酸组成不同的限制酶识别的脱氧核苷酸序列一般不同
①无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，这就是回文序列。②能被限制酶特异性识别的切割部位基本都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。
A.形成的黏性末端（从5’往3’读）为_____B.一个限制酶切割一次断两个磷酸二酯键形成___个黏性末端C.同一种限制酶切割形成的黏性末端____D.两个黏性末端有___个游离的磷酸基团
大肠杆菌（Escherichia cli R）
练习：流感嗜血杆菌的d菌株（ Haemphilus influenzae d ）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内核酸切酶（限制酶）
（1）限制酶是一类酶而不是一种酶。
（2）限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键，而不是氢键。
（3）限制酶具有特异性，任何一种限制酶都只能识别和切断特定核苷酸序列，这是由酶的专一性所决定的。
（4）限制酶主要存在于微生物中，尤其是原核生物中
（5）限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核苷酸组成，少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成；后者是双链序列
（6）判断粘性末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是将黏性末端旋转180°，同一种限制酶切割形成的黏性末端应该是完全相同的结构
限制性内切核酸酶核心归纳
3．限制酶能切开RNA分子的磷酸二酯键吗？
1．推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？
限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
2．为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
含某种限制酶的细菌的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。
……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA……
……GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT……
核心探讨——使用EcRI剪切目的基因
4.要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性（平）末端？
要切两个切口，产生四个黏性（平）末端。
5.如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？
会产生相同的黏性（平）末端，然后让两者的黏性（平）末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。
用同种限制酶切割（EcRⅠ）
积极思维：把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
6.把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
“分子黏合剂”——DNA连接酶
[资料2]1967年，科学家们发现了一种能够将两个DNA片段连接起来的酶，可以用它来修复DNA链的断裂口，并把这种酶叫做DNA连接酶。1970年，科学家们又提取了一种具有更高活性的T4DNA连接酶。当两个DNA片段的黏性末端彼此相临，而且它们的碱基能够互补配对时，DNA连接酶就能把它们之间的缝隙“缝合”起来（如图）。
DNA连接酶——“分子黏合剂”
两个具有相同黏性末端的DNA分子的连接a.通过 可以将黏性末端的两条链之间的碱基连接起来。b.DNA分子基本骨架之间的 通过DNA连接酶的作用连接。②DNA连接酶的分布及作用a.分布：广泛存在于各种生物体内。b.作用：在DNA复制、 以及体内外重组过程中起着重要作用。
可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，
E·cli DNA连接酶 或T4DNA连接酶
即恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低
TCCAAG AATTCGGAATGAGGTTCTTAA GCCTTAC
AATTCGGTTAACTA GCCAATTGAT
AATTCCGTGCGGTTACGTG GGCACGCCAATGCACTTAA
ATACGAACTTCAATTACGGTACTGCGAGTATGCTTGAAGTTAATGCCATGACGCTCTTAA
1.能被DNA连接酶连接起的黏性末端应该具备什么特点？2.用DNA连接酶连接两个相同的黏性末端要连接几个磷酸二酯键？3.基因工程中能将DNA连接酶替换为DNA聚合酶吗？为什么？
DNA连接酶——“分子黏合剂”核心探讨
不能；DNA聚合酶只能催化单个脱氧核苷酸加到DNA片段上，而DNA连接酶是将两个DNA片段连接成完整的DNA分子。
DNA连接酶与DNA聚合酶区别
连接单个脱氧核苷酸形成单链
与DNA相关的几种酶的比较
（1）真核生物的基因可以在原核生物中进行表达（ ）（2）通过基因工程产生的变异是不定向的（ ）（3）DNA连接酶能将DNA两条单链之间的碱基通过氢键连接起来（ ）（4）E.cli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端（ ）（5）限制酶和解旋酶的作用部位相同（ ）
4.下图是4种限制酶的识别序列及其酶切位点，请思考回答下列问题：
（1）图中限制酶切割后产生黏性末端的是哪些酶？产生平末端的是哪些酶？如果是黏性末端，请画出切割后的末端。
酶1、酶2切割后为黏性末端，酶3、酶4切割后为平末端；酶1切割后的末端为：
（2）酶1与酶2切割后产生的片段能用DNA连接酶连接起来吗？如能连接，说明什么？
能；由此说明只要限制酶切割后产生的黏性末端互补（或相同）就可以用DNA连接酶连接起来。
5.不同生物的DNA分子能拼接起来的理论基础是什么？
（1）基本组成单位相同：都是四种脱氧核苷酸。（2）双链DNA分子的空间结构相同：都是规则的双螺旋结构。（3）DNA碱基对之间的关系相同：均遵循严格的碱基互补配对原则。
1.限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示，下列有关说法正确的是A.一个DNA分子中，酶a与酶b的识别序列 可能有多个B.酶a与酶b切出的黏性末端不能相互连接C.酶a与酶b切断的化学键不完全相同D.用酶a切割有3个切割位点的环状DNA分子，得到4种切割产物
2.在基因工程操作过程中，DNA连接酶的作用是A.将任意两个DNA片段连接起来B.将具有相同黏性末端的DNA片段连接起来，包括DNA片段和碱基对之 间的氢键C.连接具有互补黏性末端或平末端的DNA片段，即形成磷酸二酯键D.只连接具有相同黏性末端的DNA片段碱基对之间的氢键
“分子搬运工”——载体
[资料3]1973年，美国科学家科恩（S.Chen）等人从大肠杆菌中提取出了两种质粒，一种含有卡那霉素抗性基因，另一种含有四环素抗性基因。他们将这两种基因分别“切割”下来，并拼接在同一个质粒上，然后导入大肠杆菌，产生了既抗卡那霉素又抗四环素的大肠杆菌。
载体——“分子搬运工”
1.概念：将外源基因导入 ，并使其在受体细胞中稳定______ ，还需要一定的“分子搬运工”，基因工程上将它们称为载体。2.种类：质粒（最常用）、λ噬菌体的衍生物、动物病毒等。
①质粒的结构：质粒是一种 、 、 真核细胞细胞核或原核细胞拟核 ，并具有 的 。
质粒存在于细菌和酵母菌等生物细胞中，最常用的是大肠杆菌质粒。
小型环状 DNA 分子，其基因属于细胞质基因。
有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。
能复制并带着插入的目的基因一起复制
质粒DNA分子有一个至多个限制酶切割位点，供外源 DNA 片段插人其中；携带外源 DNA 片段的质粒进人受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体 DNA 上，随受体 DNA 同步复制；质粒上常有特殊的标记基因，便于重组 DNA 分子的筛选；质粒不影响受体细胞正常的生命活动。
④质粒作为载体的原因：
3.质粒载体应该具有的DNA序列
（1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存（2）有一个至多个限制酶切点（3）有某些标记基因（4）对受体细胞无害、易分离
能进入受体细胞并在受体细胞内复制并表达；
便于与不同目的基因结合
实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
4、载体必须具备的条件：
（1）作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因（ ）（2）质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体（ ）（3）载体的作用是携带外源基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达（ ）（4）载体（如质粒）和细胞质膜中的载体蛋白的成分相同（ ）（5）基因工程上用作载体的质粒一般都经过人工改造（ ）
如图所示为大肠杆菌及质粒的结构模式图，据图探究以下问题：
1.a代表的物质和质粒都能进行自我复制，它们的化学本质都是 。
2.某外源基因切割末端为 ，若质粒也可用同种限制酶处理，质粒应有的一段核苷酸序列及被该限制酶切割后的末端分别是什么？
—ACGCGT— CGCGT——TGCGCA—； A—
3.氨苄青霉素抗性基因能控制某物质的合成，该物质能抵抗氨苄青霉素，使含有该基因的生物能在含氨苄青霉素的环境中存活。因此，氨苄青霉素抗性基因在基因工程载体上起什么作用？
用作标记基因，便于重组DNA分子的鉴定和筛选。
4.由以上分析总结作为载体必须具备哪些条件？
①必须有多种限制酶切割位点；②必须具备自我复制的能力；③必须具有适合的标记基因。
标记基因的筛选原理载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：
3.作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是A.能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因B.具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达C.具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合D.对宿主细胞无伤害，以便于重组DNA分子的鉴定和选择
4.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因（目的基因）是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置（插入点有a、b、c）示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是
A.①是c；②是b；③是a B.①是a和b；②是a；③是bC.①是a和b；②是b；③是a D.①是c；②是a；③是b
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