2022届高三生物一轮复习课件：重组DNA技术的基本工具

这是一份2022届高三生物一轮复习课件：重组DNA技术的基本工具，共25页。PPT课件主要包含了Contents，限制性内切核酸酶，DNA连接酶，基因工程的概念及发展，基因工程概念及发展，载体的作用，DNA提取的总原则，DNA的理化性质，原理及过程，常见问题及对策等内容，欢迎下载使用。

5.1 基因工程是一种重组DNA技术5.1.1 概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的5.1.2 阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具教学活动：DNA的提取和鉴定；
内容要求——重组DNA技术的基本工具
基因进入受体细胞的载体
教学活动：DNA的提取和鉴定
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。基本原理：基因重组。
胰岛素氨基酸序列的测定
破译编码氨基酸的密码子
DNA连接酶和逆转录酶
成功构建体外重组DNA分子
农杆菌转化法培育转基因烟草
基因编辑技术定点插入、敲除或替换
限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶（restrictin endnuclease），又称限制酶（restrictin enzyme）。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。迄今分离的限制酶有数千种，许多已经被商业化生产。它们能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
限制酶的限制作用实际就是一种通过限制性降解外源DNA来维护宿主遗传稳定的保护机制。限制酶一般不会剪切自身DNA的原因，可能是不包含被自身限制酶识别的序列，也可能是通过甲基化修饰作用使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化来避免被识别，达到保护自身遗传物质的目的。例如，能产生防御病毒侵染的限制酶的细菌，其自身的基因组中虽然有该限制酶识别的序列，但是该识别序列或酶切位点被甲基化酶甲基化了。当然也并不是说只要甲基化，所有限制酶就都不能切割。大多数限制酶对DNA甲基化敏感，因此当限制酶目标序列与甲基化位点重叠时，对酶切的影响实际上有3种可能，即不影响、部分影响、完全阻止。对甲基化DNA的切割能力是限制酶内在的和不可预测的特性。因此，在基因工程中为了有效地切割DNA，必须同时考虑DNA甲基化和限制酶对该类型甲基化的敏感性。
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。例如，EcR I、Sma I限制酶的识别序列均为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
例.下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，判断：
注：Y为C或T，R为A或G。
一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中心轴线（图中虚线）两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。
限制酶是一类酶，而不是一种酶。将一个基因从ＤＮＡ分子上切割下来，需要切两处，同时产生４个黏性末端或平末端。限制酶不切割自身ＤＮＡ的原因是原核生物ＤＮ不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰。获取目的基因和切割载体时应使用同种限制酶，是产生相同的黏性末端。限制酶在识别序列中心轴线两侧切开形成的是黏性末端在识别序列中心轴线处切开形成的是平末端。
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶。
DNA连接酶——“分子缝合针”
将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA连接酶来完成的。1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够将两个DNA片段连接起来的酶，称之为DNA连接酶（DNA ligase）。
根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为E.cli DNA连接酶；另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为T4 DNA连接酶。这两类酶都能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，但这两种酶的作用有所差别。E.cli DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段。而T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对比较低。
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
载体的种类及常用载体？
能否将目的基因直接送入受体细胞？
目的基因是一个DNA片段，不含有复制原点、不含有启动子和终止子。
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
便于重组DNA分子的筛选
高中生物学教材中涉及的主要酶及其作用
保证DNA结构的完整性DNA的纯度可以满足下游操作的要求 （1）其他生物分子如蛋白质、多糖和脂质分子的污染应降至最低 （2）其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除3. DNA分子应该有足够的量
DNA分子是极性化合物，溶于水，不溶于乙醇在酸性溶液中DNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定DNA分子在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同
DNA酶抑制剂，减少提取过程DNA的降解
表面活性剂，使DNA和蛋白质分离
材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源DNA酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源DNA酶污染
尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融。
冰冻生物材料，应在解冻前进行剪切和研磨；适当增加研磨液中EDTA的含量。
细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。
实验材料不佳或量少研磨或裂解不充分析出不完全
尽量选用新鲜、幼嫩的材料，并适当增加材料用量
研磨时用力均匀快速，时间适当延长，对于植物组织可加入纤维素酶
低温析出，延长沉淀时间
蛋白质、多糖、RNA…