高中生物人教版 (2019)选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序导学案

第2节　基因工程的基本操作程序

一、目的基因的筛选与获取

1．目的基因

(1)概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。

(2)实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因。

2．筛选合适的目的基因

(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。

(2)实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。

(3)认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库、序列比对工具。

3．利用PCR获取和扩增目的基因

(1)原理：DNA半保留复制。

(2)DNA复制所需的基本条件：

(3)过程：

基于PCR的过程，完成下列问题：

过程Ⅰ为变性，该阶段的温度为90_℃以上，目的是使双链DNA解聚为单链。

过程Ⅱ为复性，该阶段的温度为50__℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。

过程Ⅲ为延伸，该阶段的温度为72_℃左右，该过程需要在耐高温的DNA聚合酶的催化下，利用4种脱氧核苷酸为原料，根据碱基互补配对原则从子链的3′端延伸合成新的子链DNA。

(4)仪器：PCR扩增仪。

(5)鉴定方法：琼脂糖凝胶电泳。

二、基因表达载体的构建(第二步)

1．基因表达载体作用

(1)使基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代。

(2)使目的基因能够表达和发挥作用。

2．基因表达载体组成

基于基因表达载体的结构模式图，完成下列问题：

基因表达载体的模式图

(1)[A]启动子，RNA聚合酶识别和结合的部位，可以驱动基因转录出mRNA，[B]目的基因。

(2)[C]终止子，转录停止的部位。

(3)[D]复制原点，[E]标记基因。

3．构建过程

(1)用适宜的限制酶切割载体。

(2)用同一种限制酶或能产生相同黏性末端的限制酶切割目的基因。

(3)用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体上。

三、将目的基因导入受体细胞

1．转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2．目的基因导入受体细胞的方法

(1)目的基因导入植物细胞

①花粉管通道法

a．用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。

b．在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。

②农杆菌转化法

a．农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物；农杆菌的Ti质粒上的T­DNA能够整合到所侵染细胞的染色体DNA上。

b．转化方法：将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T­DNA中，让农杆菌侵染植物细胞。

(2)目的基因导入动物细胞

①常用方法：显微注射法。

②常用受体细胞：受精卵。

(3)目的基因导入微生物细胞

①方法：用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组表达载体导入其中。

②常用受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。

四、目的基因的检测与鉴定(第四步)

1．分子水平的检测

(1)通过PCR等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA。

(2)从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。

2．个体生物学水平的检测：如饲喂法等。

判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)

1．从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。                            (√)

2．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。                            (×)

提示：Taq酶是耐高温的DNA聚合酶。

3．基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。

  (×)

提示：启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。

4．将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。 (√)

5．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。                            (×)

提示：抗虫效果的鉴定要在个体生物学水平上做抗虫接种实验来鉴定。

6．可通过PCR等技术检测棉花的染色体上是否插入了Bt基因。  (√)

　PCR技术

1．PCR扩增的过程(如图)

2．PCR扩增的计算：理论上DNA数目呈指数扩增。

(1)若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为2n个。

(2)若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为N0·2n个。

3．比较PCR扩增和体内DNA复制的异同

1．PCR过程中为什么需要引物？

提示：引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始序列，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。存在于自然界中生物的DNA复制和人工合成中的多聚酶链式反应(PCR)之所以需要引物，是因为在DNA合成时DNA聚合酶只能从5′端到3′端合成子链。

2．某同学认为PCR过程不同的DNA片段变性时温度是不同的，你认为他的说法正确吗？说明你的理由。

提示：正确。变性目的是通过升高温度破坏氢键，将DNA分子双链变成单链，不同片段的DNA分子中氢键的数量不同导致稳定性不同，因此所需的温度不同。

3．在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因？

提示：第3轮

1．(2020·山东潍坊模拟改编)下列关于PCR的叙述，正确的是(　　)

A．PCR是体外复制DNA技术，关键酶是解旋酶和DNA聚合酶

B．DNA聚合酶从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸

C．第三轮循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段

D．延伸过程需要酶、ATP和4种核糖核苷酸

C　[PCR体外复制DNA不需要解旋酶，需要耐高温的DNA聚合酶，A错误；DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，B错误；第三轮循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段，这段固定长度的序列的数量呈指数扩增，C正确；PCR是在较高温度条件下进行的，该过程需要耐高温的DNA聚合酶，且PCR反应的产物是DNA，因此原料是4种游离的脱氧核苷酸，不是核糖核苷酸，也不需要ATP，D错误。]

2．如图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是(　　)

A．片段a、b、c的长度均相同

B．片段a、b只是第一次循环的产物

C．片段c最早出现在第二次循环的产物中

D．经过30次循环后，片段c的数量为230

C　[图中片段a、b只有一种引物，是由原始DNA链为模板复制而来，其长度比片段c长，A项不正确。由于原始模板在每次循环中均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段a、b，B项不正确。由于第一次循环的产物只有一种引物，而图中片段c有两种引物，则c最早出现在第二次循环，C项正确。经过30次循环后，得到的DNA片段总数为230，这包括图中的片段a、b，故D项不正确。]

3．2020年新型冠状病毒引发的疫情在世界范围内迅速传播。各研发机构迅速进行了针对新型冠状病毒检测和治疗的研发。回答下列问题。

(1)科研机构在拿到新型冠状病毒序列后，第一时间就进行了新型冠状病毒核酸检测试剂盒(双重荧光PCR法)的开发。

①这里涉及的PCR是利用________________的原理，将目的基因加以复制。

②PCR技术扩增目的基因的前提是要有_________________，以便根据它合成________。

③PCR扩增的过程：目的基因DNA________后解链为单链，________与单链相应互补序列结合，然后在______________作用下进行延伸，如此重复循环。

[解析]　(1)①PCR的原理是DNA双链复制。

②PCR技术扩增目的基因需要有一段已知目的基因的核苷酸序列，利用该序列合成引物。

③PCR扩增的过程：目的基因DNA受热变性形成单链，引物与单链相应序列结合，在耐高温的DNA聚合酶的催化作用下进行延伸，如此重复循环。

[答案]　(1)①DNA双链复制　②一段已知目的基因的核苷酸序列　引物　③受热变性　引物　耐高温的DNA聚合酶

　目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定

1．目的基因导入受体细胞的方法

2．目的基因的检测与鉴定

3．常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法

1．农杆菌转化法为什么要将目的基因插入农杆菌质粒的T­DNA片段？

提示：Ti质粒的T­DNA片段可以整合到受体细胞的染色体上。

2．如果改用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞，与农杆菌转化法相比有什么优点？

提示：(1)操作简便；(2)直接将目的基因导入受精卵，无须组织培养即可获得植株。(答出一个即可，其他答案合理也可)

3．将目的基因导入动物细胞的受体细胞除了受精卵外，还可以选择什么细胞？

提示：还可以将目的基因导入胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物体。

1．(2020·山东泰安期中改编)下列关于将目的基因导入受体细胞的叙述，错误的是(　　)

A．可利用花粉管通道法培育转基因植物

B．用Ca2＋处理大肠杆菌，以改变大肠杆菌细胞的生理状态

C．对于动物来说，受体细胞一般是受精卵

D．将目的基因转入微生物细胞常用显微注射法

D　[可利用花粉管通道法培育转基因植物，A正确；用Ca2＋处理大肠杆菌，使之处于一种能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B正确；对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性易于表现，C正确；将目的基因转入动物细胞常用显微注射法，将目的基因转入微生物细胞常用Ca2＋处理法，D错误。]

2．目的基因导入受体细胞后，需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是(　　)

A．目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNA

B．可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译

C．可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质

D．抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平的检测

C　[目的基因导入受体细胞后，首先要检测转基因生物(染色体)DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键，A错误；PCR可用于检测目的基因是否转录，检测目的基因是否翻译用抗原—抗体杂交技术，B错误；抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于个体生物学水平的鉴定，D错误。]

本案例考查学生演绎与推理的科学思维及对实验结果交流与讨论的科学探究能力。

(1)该载体是环形DNA还是链状DNA？说明理由。(科学思维)

(2)两种限制酶在载体上的酶切位点各有几个？(科学思维)

(3)限制酶R1与R2的酶切位点的最短距离是多少？(科学思维)

提示：(1)该载体应为环形DNA，因为仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度为800 Kb的DNA片段。

(2)两种限制酶在载体上的酶切位点各有1个。

(3)限制酶R1与R2的酶切位点的最短距离为200 Kb。

[课堂小结]

1．基因工程主要操作步骤的顺序是(　　)

①基因表达载体的构建

②将目的基因导入受体细胞

③目的基因的检测与鉴定

④目的基因的获取

A．③②④①   B．②④①③

C．④①②③      D．③④①②

C　[基因工程的主要操作步骤顺序是：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定。]

2．(2021·辽宁省适应性测试)PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，与人体细胞内DNA分子复制相比，下列有关叙述错误的是(　　)

A．都遵循碱基互补配对原则

B．DNA聚合酶作用的最适温度不同

C．都是边解旋边复制的过程

D．复制方式都是半保留复制

C　[DNA分子的体外复制和体内复制都遵循碱基互补配对原则，A正确；PCR技术是在较高温度条件下进行的，因此PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高，B正确；PCR技术是在较高温度条件下打开双链后进行扩增的，不是边解旋边复制的，C错误；DNA复制方式都是半保留复制，D正确。]

3．(2020·山东枣庄八中月考)以下关于基因表达载体的构建的说法正确的是(　　)

A．基因表达载体的构建是在生物体的细胞内完成的

B．表达载体中只有启动子才能驱动目的基因转录出mRNA

C．基因表达载体的组成应包括启动子、终止密码子、目的基因、标记基因等

D．表达载体通常采用抗生素合成基因作为标记基因

B　[基因表达载体的构建是在生物体外完成的，A错误；基因表达载体的组成应包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，终止密码子位于mRNA上，C错误；表达载体通常采用抗生素抗性基因作为标记基因，D错误。]

4．下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是(　　)

A.培育“黄金大米”可用花粉管通道法导入目的基因

B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法

C．目的基因导入大肠杆菌最常用的方法是Ca2＋处理法

D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法

A　[水稻的花很小，不适合用花粉管通道法导入目的基因，A错误；将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，B正确；将目的基因导入微生物细胞最常用的方法是用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态，C正确；将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，此外还有基因枪法和花粉管通道法，D正确。]

5．下图是将某细菌的基因A导入大肠杆菌内制备“工程菌”的示意图。

据图回答：

(1)获得A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在________酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在________的作用下合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的__________序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的________序列，再通过化学方法合成所需基因。

(2)利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有________、________、4种脱氧核糖核苷三磷酸和耐高温的DNA聚合酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。

(3)由A和载体B拼接形成的C通常称为________________。

(4)在基因工程中，常用Ca2＋处理D，其目的是______________。

[解析]　(1)利用逆转录法合成目的基因的过程是：以mRNA为模板，在逆转录酶的催化作用下合成单链DNA，然后在DNA聚合酶作用下，合成双链DNA分子；根据蛋白质工程合成目的基因的过程是：根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测DNA中脱氧核苷酸的排列顺序，通过化学方法合成。(2)PCR过程中需要酶、底物、模板、引物和能量等条件。(3)目的基因和载体结合，形成基因表达载体。(4)在利用大肠杆菌作受体细胞时，需要先用Ca2＋处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态。

[答案]　(1)逆转录　DNA聚合酶　氨基酸　脱氧核苷酸　(2)引物　模板(A基因)　(3)基因表达载体　(4)使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态