高中生物专题13 基因工程（无答案）

这是一份高中生物专题13 基因工程（无答案），共20页。教案主要包含了难点精讲，难点突破，真题回顾，新题精练等内容，欢迎下载使用。
2020届高考生物难点及易错题精讲精练
专题13 基因工程
【难点精讲】
一、限制酶的选择

例题：（2016·全国卷Ⅲ，40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的）。

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
（1）经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被　　　　酶切后的产物连接，理由是_______________________________________________________________________________。
（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA分子，如图（c）所示，这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有　　　　，不能表达的原因是
______________________________________________________________。

图（c）
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有 　　和　 　，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_________。
【难点突破】

（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点），而且这种切点不致于破坏所有的“标记基因”以及启动子和终止子。
（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类

①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图乙中限制酶pst Ⅰ因其会破坏标记基因而不宜选择。
③所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点，如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
④所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图乙中HindⅢ会破坏启动子，EcoRⅠ会破坏终止子，而NdeⅠ和BamHⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。
（3）参考Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶
若质粒上标出T－DNA片段，则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入到T－DNA片段上——因为Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，如用两种限制酶Xba Ⅰ和Sac Ⅰ（两种酶切出的黏性末端不同）切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，则下图中甲、乙、丁，Ti质粒均不宜选择，而丙Ti质粒宜选取。（分析如下）

变式训练1：（2019·湖北武汉市调研）人类是乙型肝炎病毒的唯一宿主，现有的肝硬化、肝癌多从乙肝发展而来，接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。乙肝疫苗的研制先后经历了血源性疫苗和基因工程疫苗阶段。血源性乙肝疫苗是取用乙肝病毒感染者的血液，用高速离心法提纯血液中的乙肝病毒，之后再将其灭活，制成乙肝疫苗，具有一定的感染风险。如图所示为乙肝基因工程疫苗的生产和使用过程（注：质粒中lacZ基因可使细菌利用培养基中的物质X－gal，从而使菌落呈蓝色，若无该基因，则菌落呈白色）。请回答下列问题：

（1）过程①最好选用的限制酶方案可以是　　　　。
A．EcoR Ⅴ和BamH Ⅰ B．BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ
C．EcoR Ⅴ和EcoR Ⅰ D．只用BamH Ⅰ
（2）由图中过程③可知，该目的基因的具体功能是
______________________________________________________________。
（3）若要迅速获取大量的目的基因，以提高重组质粒产生的效率，常用的技术是
　　　　　　（写中文全称）。图中过程②常需要用　　　　处理，使大肠杆菌细胞转化为感受态细胞。
（4）为了筛选、获取含重组质粒的大肠杆菌，需在培养大肠杆菌的通用培养基中额外加入　　　　　　，培养一段时间挑选出呈　　　　（填“蓝色”或“白色”）的菌落进一步培养获得大量目的菌。
（5）用基因工程疫苗接种比血源性疫苗更安全，试从疫苗的结构特点解释原因
________________________________________________________________。

变式训练2：下列是基因工程的有关问题，请回答：

(1)限制性核酸内切酶可以识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并可以使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的______________(填化学键名称)断裂，形成的末端总体可分为两种类型，分别是____________________。
(2)目的基因和载体重组时需要的工具酶是______________，和限制性核酸内切酶相比，它对所重组的DNA两端碱基序列____________(填“有”或“无”)专一性要求。
(3)如图表示构建表达载体时的某种质粒与目的基因。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切割位点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切割位点是—↓GATC—。分析可知，最好选择限制酶________切割质粒，限制酶______切割目的基因所在的DNA，这样做的好处分别是_______
______________________、_____________________________。

二、 标记基因的工作原理

例题：（2019·湖南长沙长郡中学月考）下图是利用工程菌（大肠杆菌）生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：

（1）过程①所用到的组织细胞是　　　　，过程④所用的酶是　　　　。⑤过程常用　　　　溶液处理大肠杆菌。
（2）经②过程得到的互补DNA片段，称为　　　　。
（3）如果用限制酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ对图中质粒进行切割，用一种酶、两种酶和三种酶分别切割时形成的DNA片段种类与用一种酶和两种酶分别切割时形成的DNA片段种类　　　　（填“相同”或“不同”），这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有　　　　种和　　　　种。
（4）如果只用限制酶Pst Ⅰ切割目的基因和质粒，完成过程④、⑤后（受体大肠杆菌不含Ampr、Tetr），将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取培养基甲上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选　　　　　　　　的大肠杆菌；接种到培养基乙上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的是　　　　　　。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是_____________________________________________
_______________________________________________________________。
（5）将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素、四环素培养基上的过程，属于基因工程基本操作中的_____________________________________________________
步骤。该基因工程中的pBR322质粒彻底水解的产物是
_______________________________________________________________。


【难点突破】
标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，倘若在选择培养基中不能存活，则表明无质粒转入，当然不会有“目的基因”转入，能存活时必含该载体，原理如下图所示：

变式训练：（2016·全国卷Ⅰ，40）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：

（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有
_______________________________________________________________
（答出两点即可），而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________________________________________；
并且　　　　和　　　　的细胞也是不能区分的，其原因是______________________________。
在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有　　　　的固体培养基。
（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于__________________________________________________________。

三、 利用PCR技术扩增目的基因

例题：（2019·河北石家庄质检）资料一　PCR（聚合酶链式反应）三个基本反应步骤是模板DNA在体外加热至95 ℃时解旋成单链，温度降至55 ℃左右，引物与模板单链按碱基互补配对的原则结合，再调至72 ℃左右时，DNA聚合酶沿5′→3′（磷酸到五碳糖）的方向延伸引物合成互补链。三个步骤完成一次称一个循环。
资料二　图1显示了目的基因及限制酶切点，A、B、C、D是四种单链DNA片段；图2是质粒（显示限制酶切点和标记基因），一般来说，为了使切割后的目的基因与运载体结合，往往使用两种限制酶，同时还要破坏载体上的一个标记基因。
根据资料回答：

（1）若利用PCR技术增加目的基因的数量，所用的酶是　　　　。由图1可知，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取　　　　作为引物，该DNA分子在PCR仪中经过4次循环后会产生DNA片段　　　　个。
（2）为了提高目的基因和质粒的重组成功率，同时有利于受体细胞的筛选，应该选择的限制酶是　　　　。如果用限制酶Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ对质粒进行切割，假设同时只有任意两个位点被切割且每次机会相等，则形成的含有完整抗四环素基因的DNA片段有　　　　种。
（3）DNA连接酶中既能连接黏性末端又能连接平末端的是　　　　。将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是　　　　。
（4）对基因组文库的描述，错误的是　　　　。
A．含有某种生物的全部基因
B．基因中含有启动子和内含子
C．文库的基因是通过受体菌承载的
D．文库中的全部基因可以在物种间交流



【难点突破】
PCR技术

（2）PCR反应过程
过程
说明
图解
变性
当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解旋为单链

复性
温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

延伸
72 ℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5′端向3′端延伸

（3）结果： 上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子 ，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。

变式训练：.(2019·广东深圳调研)据报道，美国科研人员通过基因转移技术，从根本上治愈了实验小鼠所患的Ⅰ型糖尿病，这种技术把选定的X基因输入胰腺，这些基因随后得到整合并促使消化系统和其他类型的细胞制造胰岛素，请回答下列问题：
(1)在基因工程中，X基因称为________。利用PCR技术扩增X基因时，需要在反应体系中添加的有机物质是________、________、4种脱氧核糖核苷酸和耐热性的DNA聚合酶，扩增过程在PCR扩增仪中完成。
(2)将X基因导入小鼠体内之前，需要操作的核心步骤是________________，此步骤最常用的运载工具是________，所需要的酶是限制酶和________。
(3)X基因的检测可从分子水平和个体水平两方面进行，在分子水平上通常采用________技术检测X基因是否导入受体细胞，在个体水平上应检测______________________________________________。


【真题回顾】
1．（2017·江苏省高考真题）金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：

（1）从高表达MT 蛋白的生物组织中提取mRNA，通过______________获得______________用于PCR扩增。
（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的______________位点。设计引物时需要避免引物之间形成______________，而造成引物自连。
（3）图中步骤1代表______________，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
（4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏_________的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但____________的引物需要设定更高的退火温度。
（5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有___________（填序号：①升高退火温度 ②降低退火温度 ③重新设计引物）。

2．（2019·全国高考真题）基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
（1）基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。
（2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
（3）目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________。

3．（2018·全国高考真题）某种荧光蛋白（GFP）在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1-GFP融合基因（简称为甲），并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。

回答下列问题：
（1）据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是_________。使用这两种酶进行酶切是为了保证_______________，也是为了保证__________________。
（2）将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和_________过程。
（3）为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的_____________移入牛的____________中、体外培养、胚胎移植等。
（4）为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的____________（填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”）作为PCR模板。

4．（2016·天津高考真题）人血清白蛋白(HSA) 具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA（rHSA）的两条途径。

（1）为获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取_____________合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。

（2）启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是_____________（填写字母，单选）。
A．人血细胞启动子 B．水稻胚乳细胞启动子 C．大肠杆菌启动子 D．农杆菌启动子
（3）利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是____________。
（4）人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才有活性。与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是____________________________________。
（5）为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与_________________的生物学功能一致。

5．（2020·浙江省高考真题）回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与泡菜制作有关的问题：
（1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜，用热水短时处理，可抑制某些微生物产生_____，从而使成品泡菜口感较脆。同时，该处理也会使泡菜发酵时间缩短，其原因是_______。
（2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，会使______菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，会使______菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，会使乳酸菌受到抑制。
（3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行______，再用______的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。该培养基必须含有______，以便于观察是否产酸。
（4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加______。
（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：
（1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经______处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。然后测定该原生质体的活性，可采用的方法有______（答出2点即可）。
（2）若要获得已知序列的抗病基因，可采用______或PCR的方法。为了提高目的基因和质粒重组的成功率，选择使用______，对含目的基因的DNA片段进行处理，使其两端形成不同的粘性末端，对质粒也进行相同的处理，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中______，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。
（3）原生质体在培养过程中，只有重新形成______后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过______或器官发生的途径再生植株。

6．（2016·江苏省高考真题）下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
限制酶
BamHⅠ
BclⅠ
Sau3AⅠ
HindⅢ
识别序
列及切
割位点






(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于________态的大肠杆菌。
(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中______________。
(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为_______，对于该部位，这两种酶________(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。
(4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。

7．（2019·天津高考真题）B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。

据图回答：
（1）B基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中________。
A．含B基因的染色体缺失 B．DNA聚合酶失活
C．B基因发生基因突变 D．B基因的启动子无法启动转录
（2）从水稻体细胞或________中提取总RNA，构建____________文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因（表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光）连接成融合基因（表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能），然后构建重组表达载体。
（3）在过程①、②转化筛选时，过程______________中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上，过程__________________在培养基中应加入卡那霉素。
（4）获得转基因植株过程中，以下鉴定筛选方式正确的是________。
A．将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交
B．以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交
C．以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交
D．检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光
（5）从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明_________________。

8．（2017·全国高考真题）真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子）可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
（1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是__________。
（2）若用家蚕作为表达基因A的载体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用_______作为载体，其原因是_________。
（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有________(答出两点即可)等优点。
（4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”）。
（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是______________。

9．（2019·江苏省高考真题）图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：

（1）EcoRV酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为___________末端。
（2）用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为___________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是__________（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_____、________________。

（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是_______________。

10．（2019·海南省高考真题）人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质（Y），该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。
（1）若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取___________作为模板，在____________催化下合成cDNA，再利用_______________技术在体外扩增获得大量Y的基因。
（2）将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的__________________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经_______________。
（3）天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是__________________。

【新题精练】
1．（2020·山东省高三二模）玉米是我国重要的粮食作物和饲料来源，低温会影响玉米的产量和品质。研究者将从微生物中获得的CSP（冷激蛋白）基因与玉米基因的ubi启动子相连后构建基因表达载体，并将其导入玉米细胞中，获得了具有低温耐受性的玉米植株，过程如图1所示。

（1）研究者提取玉米的DNA，利用PCR技术将ubi启动子扩增出来。该过程需设计合适的引物，引物设计时需已知___________，为便于进行后续操作还在引物中添加了限制酶的识别序列。在反应体系内，至少需___________次扩增才能获得所需的ubi启动子。
（2）图1所示的流程图中，过程①需___________的催化，获得的ubi-CSP基因在构建基因表达载体时，在Ti质粒上的插部位为___________。过程②需要用CaCl2溶液处理农杆菌，其目的是___________。过程③完成后，将玉米愈伤组织转入含___________的培养基中进行筛选，筛选后的愈伤组织再经培育获得转基因玉米。
（3）研究者分别提取了野生型玉米及5株转基因玉米的染色体DNA，用限制酶处理后进行电泳。电泳后的DNA与基因探针进行杂交，得到图2所示放射性检测结果，该基因探针应为___________片段，实验结果表明___________。

（4）在个体水平上对转玉米植株进行___________实验，可检测CSP基因是否已在玉米中表达。

（2020·上海高三二模）pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素（一种抗生素）抗性基因，mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落：而限制酶A、B、C、D在pIJ702上分别只有一处识别序列。以B和C切取的目的基因置换pIJ702上0．4kb（1kb=1000对碱基）的B/C片段，构成重组质粒，如图。

2．构成重组质粒时除了限制酶还需用到工具酶是_____________。上述基因工程中的受体细胞是_____________（硫链丝菌/链霉菌）细胞。
3．将上述两种质粒的限制酶酶切片段长度列在表中。
限制酶
pIJ702
重组质粒
A
5．7
1．6Kb，5．1Kb
D
5．7
2．2Kb，4．5Kb
由此判断目的基因内部是否含有限制酶A、D切割位点，其情况是目的基因中 。
A．只有A酶切割位点 B．只有D酶切割位点
C．两者都有切割位点 D．两者都没有切割位点
不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素固体培养基上的生长状况如表所示。
固体培养基中硫链丝菌素浓度（ug/mL）
0
1
2
5
10
不含质粒的链霉菌生长状况
+++++
+++
+
-
-

“+”表示生长；“-”表示不生长
4．若要筛选接纳了pIJ702或重组质粒的链霉菌细胞，所需的硫链丝菌素最小浓度应为____________ug/mL（填写表3中给定浓度）；含有重组质粒的菌落呈____________（白/黑）色。
5．上述目的基因来源于原核生物，其蛋白质编码序列（即编码从起始密码子到终止密码子之间的序列）经测定为1256对碱基，试判断对这段序列的测定是否存在错误？并说明依据。____________。

（2020·上海高三二模）在天宫二号上进行的拟南芥培育实验中，为监控植物的开花过程，科研人员给拟南芥安装了“追踪器”，即利用控制植物开花基因相同的“启动子”（启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，决定基因的转录与否）带动绿色荧光蛋白（GFP）基因在微重力条件下表达并获得实时荧光图像。转基因拟南芥植物在构建过程中首先需分别构建植株A和植株B，安装“追踪器”和构建植株A过程如图1所示。

6．据图1分析，图中步骤①进行的切割，选择的限制酶是 。
A．EcoRⅠ酶 B．HindⅢ酶
C．EcoRⅠ酶和HindⅢ酶 D．HindⅢ酶和BamHⅠ酶
7．获得转基因拟南芥植株A的基因工程目的基因是___________；受体细胞是___________。基因工程步骤④是___________。
8．在步骤⑤中，让含重组Ti质粒1的农杆菌侵入拟南芥愈伤组织而非拟南芥叶肉细胞的主要原因是______________________；步骤⑥主要运用的技术是____________。
科研人员进一步构建植株B，构建过程如图2所示，图2中启动子序列与图1中相同。

9．已知步骤⑤为农杆菌转化法。因为Ti质粒既有在细菌中表达的基因，同时又有在高等植物中表达的基因，所以需要将重组质粒2与Ti质粒重组后，再导入受体细胞。下列关于所选Ti质粒的说法正确的是
A．Ti质粒本身应具有绿色荧光蛋白基因
B．Ti质粒本身应具有植物开花基因
C．Ti质粒为双链闭环DNA分子
D．Ti质粒的受体细胞应为农杆菌细胞
10．科研人员对重组质粒2直接进行基因测序，以筛选获得重组质粒2。除此方法外，利用图2所给信息，试举出其他筛选重组质粒2的方法。____________________________________。
11．科研人员成功获得植株A和植株B后，如何获得纯合转基因拟南芥植株?纯合转基因拟南芥植株有何优点?________________________________________________。