高中生物考点精讲16 基因工程、生物技术的安全性与伦理问题（作业）

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细胞工程、基因工程
1．（2021全国甲卷·38）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_________（用数字序号表示）。
（2）操作③中使用的酶是_________，PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是_______ 。
（3）为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与_______ 特异性结合。
（4）PCR（多聚酶链式反应）技术是指_______。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
【答案】（1）④②③① （2）Taq酶（热稳定DNA聚合酶） 延伸 Taq酶从引物起始进行互补链的合成 （3）两条单链DNA （4）一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
【分析】
PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
【详解】
（1）PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是④采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段→①分析PCR扩增结果。
（2）在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，操作③中使用的酶是Taq酶（热稳定DNA聚合酶），PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性的结果是Taq酶从引物起始进行互补链的合成。
（3）DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与两条单链DNA特异性结合。
（4）据分析可知，PCR（多聚酶链式反应）技术是指一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
【点睛】
本题考查PCR技术及应用，难度较小，解答本题的关键是明确PCR技术的原理，具体反应过程，以及在临床病原菌检测中的应用。
2．（2021全国乙卷·38）用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。

回答下列问题：
（1）常用的DNA连接酶有E. coli DNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中__________酶切割后的DNA片段可以用E. coli DNA连接酶连接。上图中___________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能___________；质粒DNA分子上有______________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是______________。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指__________________。
【答案】（1）EcoRI、PstI EcoRI、PstI、 SmaI和EcoRV （2）磷酸二酯键 （3）自我复制 一至多个限制酶切位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 （4）位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
【分析】
基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
【详解】
（1）限制酶EcoRI和PstI切割形成的是黏性末端，限制酶SmaI和EcoRV切割形成的是平末端，E. coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRI和PstI切割后的DNA片段（黏性末端）可以用E. coli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaI和EcoRV切割后的DNA片段（平末端）也可以用T4DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。
（3）质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制性核酸内切酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。
（4）启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。
【点睛】
本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的概念、原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要
注意的细节，能结合所学的知识准确答题。
3．（2020·东北师大附中高三一模）Anti基因是小型猪器官表面抗原基因，人工合成的reAnti基因的模板链与Anti基因的模板链互补。科学家利用合成的reAnti基因培育出转基因克隆猪，用于解决人类器官移植时免疫排斥。
(l)利用PCR技术对reAnti基因进行扩增，其原理是 ___，在构建基因表达载体时，用两种不同的限制酶切割reAnti基因和运载体DNA来获得不同的黏性末端，原因是____。
(2)猪胎儿成纤维细胞培养过程中，需要用 ___酶将组织分散成细胞悬液。培育转基因猪时，应使用 ___技术将含有reAnti基因的表达载体导入猪成纤维细胞。再将该转基因猪的细胞核注入____时期的卵母细胞中，构建重组胚胎。
(3)胚胎培养液中除了一些无机盐和有机盐外，还需要添加“两酸、两素”以及动物血清，其中的“两酸”是指____。
(4)用 ___技术检测出转基因克隆猪的细胞核DNA中含有reAnti基因，但器官表面不含有抗原，原因是____。
【答案】DNA双链复制 防止目的基因和运载体DNA自身环化和反向连接（使目的基因定向连接到运载体上） 胰蛋白酶（胶原蛋白酶） 显微注射 减数第二次分裂中期 氨基酸和核苷酸 DNA分子杂交技术 reAnti基因抑制了Anti基因的翻译过程，不能合成相应的抗原（reAnti基因转录出的mRNA与Anti基因转录出的mRNA形成了双链，不能翻译合成相应的抗原）
【解析】
（l）利用PCR技术对reAnti基因进行扩增，其原理类似于DNA的天然复制过程，DNA聚合酶以单链DNA为模板，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在构建基因表达载体时，用两种不同的限制酶切割reAnti基因和运载体DNA来获得不同的黏性末端，是为了防止目的基因和运载体DNA自身环化和反向连接（使目的基因定向连接到运载体上）。
（2）动物组织的细胞之间相连的物质的化学本质是蛋白质，所以用胰蛋白酶或胶原蛋白酶对动物组织进行处理，使其水解成小分子物质，从而使动物组织分散成细胞悬液。
基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌，枯草杆菌，土壤农杆菌，酵母菌和动植物细胞等。其中，对于细菌或植物细胞，常用质粒作为载体将目的基因导入感受态细胞内；动物细胞则用显微注射的方法，将含有reAnti基因的表达载体导入猪成纤维细胞。再将该转基因猪的细胞核注入减数第二次分裂中期的卵母细胞中，构建重组胚胎。
（3）胚胎培养液中除了一些无机盐和有机盐外，还需要添加“两酸、两素”以及动物血清，其中的“两酸”是指氨基酸和核苷酸，两素指维生素和激素。
（4）用DNA分子杂交技术技术检测出转基因克隆猪的细胞核DNA中含有reAnti基因，但器官表面不含有抗原，原因是reAnti基因抑制了Anti基因的翻译过程，不能合成相应的抗原（reAnti基因转录出的mRNA与Anti基因转录出的mRNA形成了双链，不能翻译合成相应的抗原）。
4．（2020·西北狼联盟高三一诊模拟）类风湿性关节炎（RA）是一种自身免疫病，致残性强。研究表明，该病的病理改变与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）密切相关，而一种人鼠嵌合的抗TNF-α单克隆抗体能有效治疗RA。下图为该单克隆抗体制备过程示意图。

（1）图中的抗原A是______________，常用的促融剂是_______________。细胞融合完成后，融合体系中除含有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，可能还有骨髓瘤细胞自身融合细胞、淋巴细胞自身融合细胞。体系中出现多种类型细胞的原因是________________。
（2）HAT培养基的作用是经选择性培养筛选出杂交瘤细胞，之后还需要进行__________培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得能分泌单一抗体的杂交瘤细胞。最后获得的杂交瘤细胞只能产生一种单一抗体的原因是___________________。
（3）单克隆抗体的特点是__________________。单克隆抗体的制备涉及细胞工程中的动物细胞融合技术和____________技术。
（4）单克隆抗体主要的用途有：_______________________________（至少答两点）。
【答案】肿瘤坏死因子-α（或TNF-α） 聚乙二醇（PEG） 细胞融合是随机的，且融合率达不到100% 克隆化培养 每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 特异性强、灵敏度高、可大量制备 动物细胞培养 作为诊断试剂、用于治疗疾病、用于运载药物
【解析】
（1）要制备抗TNF-a单克隆抗体需要给小鼠注射肿瘤坏死因子a(TNF-a)，即图中的抗原A。常用物理或化学方法促融，最常用的化学促融剂是聚乙二醇(PEG)，细胞融合完成后，由于细胞融合是随机的，且融合率达不到100%，所以细胞融合完成后，融合体系中除含有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，可能还有骨髓瘤细胞自身融合细胞、淋巴细胞自身融合细胞。
（2）HAT培养基的作用是选择性培养筛选出杂交瘤细胞，在抗体检测之前需要进行克隆化培养，以增加杂交瘤细胞数量。经多次筛选，就可获得能分泌单一抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞只能产生一种单一抗体的原因是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。
（3）单克隆抗体典型优点是特异性强、灵敏度高、可大量制备。动物细胞培养技术是动物细胞工程的基础，单克隆抗体技术是动物细胞工程的应用之一。故单克隆抗体的制备涉及细胞工程中的动物细胞融合技术和动物细胞培养技术。
（4）单克隆抗体最广泛的用途是作为诊断试剂，也可用于治疗疾病、用于运载药物，主要是用于癌症治疗、也有少量是是用于其他治疗的。
5．波尔山羊被称为世界“肉用山羊之王”，某公司通过胚胎工程技术能快速繁殖大量波尔山羊。回答下列问题：
(1)山羊体外受精主要包括__________和受精等几个主要步骤。用__________(填激素名称)处理方法促进其排卵，从输卵管中冲取卵子，直接与获能的精子在体外受精。精子获能处理通常采用培养法和_________________。
(2)培养早期胚胎时，所用培养液的成分比较复杂，除了一些___________类外，还需要添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等物质。不同胚胎移植时间一般不同，山羊一般要培养到___________阶段才能进行移植。，
(3)为了使胚胎在移植前后所处的生理环境保持一致，处理方法是_________________。
(4)移植后的胚胎能在受体子宫中存活的生理基础是____________________。
【答案】卵母细胞的采集和培养、精子的采集和获能 促性腺激素 化学诱导法 无机盐和有机盐 桑椹胚阶段或囊胚阶段 对供体和受体母畜进行同期发情处理 受体子宫对外来胚胎不发生排斥反应
【解析】
（1）山羊体外受精主要包括卵母细胞的采集和培养、精子的采集和获能以及受精等几个主要步骤。用促性腺激素处理方法促进其排卵，从输卵管中冲取卵子，直接与获能的精子在体外受精。精子获能处理通常采用培养法和化学诱导法，化学诱导法即将精子放在一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液中获能。
（2）培养早期胚胎时，所用培养液除了一些无机盐和有机盐类外，还需要添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等物质。不同胚胎移植时间一般不同，山羊一般要培养到桑樵胚阶段或囊胚阶段才能进行移植。
（3）为了使胚胎在移植前后所处的生理环境保持一致，处理方法是对供体和受体母畜进行同期发情处理。
（4）移植后的胚胎能在受体子宫中存活的生理基础是受体子宫对外来胚胎不发生排斥反应。
6．在人体内胰岛素基因表达可合成出一条称为前胰岛素原的肽链，此肽链在内质网中经酶Ⅰ切割掉氨基端一段短肽后成为胰岛素原。进入高尔基体的胰岛素原经酶Ⅱ切割，去除中间片段C后，产生A、B两条肽链，再经酶Ⅲ作用生成由51个氨基酸残基组成的胰岛素。 目前，利用基因工程技术可大量生产胰岛素。
（1）人体细胞内合成前胰岛素原的细胞器是_______。胰岛素原由内质网运输到高尔基体，体现了生物膜具有_______性。
（2）你认为酶Ⅰ～Ⅲ是否为同种酶？_______。你作出此判断的理由是_______。
（3）利用基因工程技术生产胰岛素原过程中：
①可根据胰岛素原的氨基酸序列，设计并合成编码胰岛素原的_______序列，用该序列与_______构建胰岛素原基因重组表达载体。根据DNA的结构及组成，分析不同物种的DNA能拼接在一起的原因是_______。
②将重组表达体导入工程菌内，诱导目的基因表达。用胰岛素原的_____（填“抗体”或“抗原”）检测工程菌的提取物。若提取物发生反应，则用该工程菌进行_____（填“液体”或“固体”）发酵。
【答案】核糖体 流动 不同 酶具有专一性，它们催化的底物不同 DNA 质粒 不同物种的DNA都具有双螺旋结构，基本组成单位都是4种脱氧核苷酸 抗体 液体
【解析】
（1）胰岛素原的化学本质是多肽（蛋白质），合成场所在核糖体；胰岛素原由内质网运输到高尔基体，依赖于生物膜的流动性；
（2）酶具有专一性，由题干信息可知：酶Ⅰ的作用是切割氨基端，酶Ⅱ的作用是切割去除胰岛素原的中间片段C，酶Ⅲ的作催化51个氨基酸残基组成胰岛素，它们催化的底物不同，可知三种酶不同；
（3）①根据胰岛素原的氨基酸序列，可设计并合成编码胰岛素原的DNA序列（即目的基因），用该序列与质粒（运载体）构建胰岛素原基因重组表达载体；由于不同物种的DNA都具有双螺旋结构，基本组成单位都是4种脱氧核苷酸，故不同物种的DNA能拼接在一起；
②检测目的基因是否表达，应用抗原-抗体杂交技术，即用胰岛素原的抗体检测工程菌的提取物；工程菌通常用液体进行发酵。
7．通过基因工程研制的某新型基因治疗药物，其本质是利用腺病毒和人P53基因（抑癌基因）拼装得到的重组病毒。人的P53蛋白可对癌变前的DNA损伤进行修复，使其恢复正常，或诱导其进入休眠状态或细胞凋亡，阻止细胞癌变。该药物的载体采用第一代人5型腺病毒，其致病力很弱，其基因不整合到宿主细胞的基因组中，无遗传毒性；载体经基因工程改造后，只对细胞实施一次感染，不能复制，不会污染。请回答下列问题：
（1）在该药物的生产中，为了获得更高的安全性能，在载体一般应具备的条件中，科学家选择性地放弃了一般载体都应该具有的_________________（在“能自我复制”“有多个限制性酶切位点”“在宿主细胞中能稳定保存”中选答）。检测P53基因基因是否插入到染色体上，可从分子水平上检测，方法是___________。
（2）如果要获取人类基因组中抑癌基因P53，可以采取的方法通常包括_____________和人工方法合成。目的基因的大量扩增则可以采用_________________技术，该技术中需使用一种特殊的酶是_________________。
（3）如果要获得胚胎干细胞进行研究，则胚胎干细胞可来源于______________的内细胞团，或胎儿的原始性腺，也可以通过_________________技术得到重组细胞后再进行相应处理获得。在培养液中加入_________________，如牛黄酸等化学物质时就可以诱导胚胎干细胞向不同类型的组织细胞分化，这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段。
【答案】能自我复制 DNA分子杂交技术 自然界已有物种分离 PCR 热稳定的DNA聚合酶（Taq酶） 囊胚期 核移植 分化诱导因子
【解析】
（1）据题意可知，载体经基因工程改造后，只对细胞实施一次感染，不能复制，不能污染。故在载体一般应具备的条件中，科学家选择性地放弃了一般载体都应该具有的自我复制功能。检测P53基因的表达产物，可从分子水平上检测，采用DNA分子杂交技术。
（2）如果要获取人类基因组中抑癌基因P53，可以采取的方法通常包括从从基因文库获取和通过化学方法人工合成。目的基因的大量扩增则可以采用PCR技术，该技术中因需要高温处理，故需使用的一种特殊的酶是热稳定DNA聚合酶。
（3）在研究中如果要获得胚胎干细胞进行研究，则胚胎干细胞可来源于囊胚期的内细胞团，或胎儿的原始性腺，也可以通过核移植技术得到重组细胞后再进行相应处理获得。在培养液中加入分化诱导因子，可以诱导胚胎干细胞向不同类型的组织细胞分化。
8.研究人员利用小鼠的单倍体ES细胞（只有一个染色体组），成功培育出转基因小鼠。其主要技术流程如图所示，请分析回答下列问题：

（1）利用PCR技术可以扩增目的基因，PCR反应体系中除含缓冲液、模板DNA、dNTP（包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、引物外，还应含有____；引物应选用下图中____（填图中字母）。

（2）在基因工程操作步骤中，过程①②称为 ___。已知氨苄青霉素不能有效杀死小鼠细胞，而一定浓度的G418能有效杀死不具有Neo′的小鼠细胞。结合上图推测， 过程①选用的两种限制酶是 ___（填图中的编号），③处的培养液应添加____（填“氨苄青霉素”或“G418”）。
（3）图中桑椹胚需通过____技术移入代孕小鼠子宫内继续发育，进行该操作前需对受体小鼠进行____处理。
【答案】热稳定的DNA聚合酶（或Taq酶） A和D 基因表达载体的构建 Ⅰ和Ⅱ G418 胚胎移植 同期发情
【解析】
（1）根据分析可知，PCR反应体系中除含缓冲液、模板DNA、dNTP（包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、引物以外，还应含有耐高温的DNA聚合酶。为了扩增目的基因的片段，根据图示可知需要在引物A和D作用下以目的基因的两条链为模板合成子代目的基因。
（2）由图可知，过程①②是将目的基因和运载体连接形成重组质粒，即基因表达载体的构建过程。重组质粒上的抗生素抗性基因可作为标记基因，其作用是有利于筛选出含有目的基因的细胞。根据题意可知，氨苄青霉素不能有效杀死小鼠细胞，而一定浓度的G418能有效杀死不具有Neo′的小鼠细胞，因此应选择Neo′作为标记基因，即质粒上Neo′不能用限制酶切割，则过程①应选用Ⅰ和Ⅱ两种限制酶，图中③处的培养液应添加G418以便于起到筛选的作用。
（3）将桑椹胚通过胚胎移植技术移入代孕小鼠子宫内继续发育，进行该操作前需对受体小鼠进行同期发情处理，以保证供体与受体处于相同或相近的生理状态。
9.家蚕细胞具有高效表达外源基因能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可以提取干扰素用于制药。
（1）进行转基因操作前，需用________酶短时处理幼蚕组织，以便获得单个细胞。
（2）为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把来自cDNA文库的干扰素基因片段正确插入表达载体的__________和__________之间。导入家蚕细胞后若要检测干扰素基因在家蚕细胞中是否表达，可以采用的方法有___________________。
（3）培养家蚕细胞时，贴壁生长的细胞会产生接触抑制。通常将多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反应器中，这样可以_________________，增加培养的细胞数量，也有利于空气交换。
（4）“桑基鱼塘”生态系统能充分利用废弃物中的能量，形成“无废弃物农业”，这主要是遵循生态工程的__________原理。同时，通过饲养家禽、家畜，栽培食用菌，提高农民经济收入，使保护环境和发展经济相互协调，这又体现了生态工程的_________原理。
【答案】胰蛋白酶（或胶原蛋白酶） 启动子 终止子 分子杂交技术和抗原-抗体杂交法 增大细胞贴壁生长的附着面积 物质循环再生 整体性
【解析】
（1）动物细胞培养时，需要用胰蛋白酶处理动物组织，以便获得单个细胞；
（2）基因表达载体包括启动子、终止子、目的基因和标记基因。启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，故为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把来自cDNA文库的干扰素基因片段正确插入表达载体的启动子和终止子之间；基因表达包括转录和翻译两个步骤，要检测目的基因是否转录，可采用分子杂交技术，要检测目的基因是否翻译，可采用抗原-抗体杂交法；
（3）培养家蚕细胞时，贴壁生长的细胞会产生接触抑制，通常将多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反应器中，这样可以增大细胞贴壁生长的附着面积，增加培养的细胞数量，也有利于空气交换；
（4）“桑基鱼塘”生态系统能充分利用废弃物中的能量，形成“无废弃物农业”，这主要是遵循生态工程的物质循环再生原理；同时，通过饲养家禽、家畜，栽培食用菌，提高农民经济收入，使保护环境和发展经济相互协调，这又体现了生态工程的整体性原理。
10.2018年11月，一对名为“露露”和“娜娜”的基因编辑婴儿的诞生引发了国内巨大的争议。基因编辑过程的实质是用特殊的引导序列将“基因剪刀--Cas9酶”精准定位到所需修饰的基因上然后进行编辑。回答下列问题：
（1）科学家用______法将特殊的引导序列与“基因剪刀--Ca9酶”导入目的细胞，上述实例中目的细胞为______。
（2）“露露”与“娜娜”其实也是试管婴儿，试管婴儿需让成熟且______的精子与成熟的卵细胞结合形成受精卵，然后进行早期胚胎培养。该时期所用培养液中含有的物质有无机盐和有机盐类、氨基酸、维生素、______、______、水和血清等。
（3）一个处于囊胚期的早期胚胎经过______技术可形成两个甚至多个胚胎，该技术操作的关键是要做到将______，若科学家想在早期胚胎时就知道“露露”的性别，可通过______实现。
【答案】显微注射 受精卵 获能 激素 核苷酸 胚胎分割 内细胞团均等分割 取囊胚期胚胎的滋养层细胞进行染色体（或DNA）分析
【解析】
(1) 将特殊的引导序列与“基因剪刀——Ca9酶”导入目的细胞是受精卵细胞，采用显微注射法。
（2）体外受精需要将成熟的精子获能后与成熟的卵细胞结合形成受精卵；早期胚胎培养所用的培养基需要加入无机盐和有机盐类、氨基酸、维生素、激素、核苷酸、水和血清等。
（3）将囊胚期的早期胚胎采用胚胎分割技术可形成两个甚至多个胚胎，该技术操作的关键是要做到将内细胞团均等分割，取囊胚期胚胎的滋养层细胞进行染色体（或DNA）分析可以判断胎儿的性别。
11.下图是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒PO具有四环素抗性基因 ( telr)和氨苄青霉索抗性基因(ampr)。请回答下列问题：

(1)基因工程中所用的目的基因可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以 _________。利用PCR技术扩增目的基因片段时，常使用的酶是____ 。
(2)重组载体构建的过程中所需的酶有 ____和 ____。
(3)为进一步鉴定菌体是否含有重组质粒P3，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“-”代表不生长）。
菌落类型
平板类型
A
B
C
无抗生素
+
+
+
氨苄青霉素
+
-
+
四环素
+
-
-
氨苄青霉素+四环素
+
-
-
根据表中结果判断，A、B、C菌落质粒导入情况分别是____、____、____。
(4)将目的基因导入动物细胞的常用方法是____。
【答案】用人工的方法合成 热稳定DNA聚合酶（或“Taq酶”或“Taq DNA聚合酶”） 限制性核酸内切酶（或“限制酶”或“EcoR V”） DNA连接酶 已导入质粒PO 未导入质粒 已导入质粒P3 显微注射技术
【解析】
(1) 基因工程中所用的目的基因可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工的方法合成。利用PCR技术扩增目的基因片段时，所控制的温度条件至少为50℃左右，常使用的酶是具有耐高温特性的热稳定DNA聚合酶（或“Taq酶”、“Taq DNA聚合酶”）。
(2) 重组载体构建的过程中，需使用限制酶（EcoRV）切割载体质粒和含有目的基因的DNA片段，再用DNA连接酶将切割后的载体质粒和目的基因连接起来。
(3) 由图可知：用限制酶（EcoRV）切割后破坏了四环素抗性基因（tetr），但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因（ampr），因此含有重组质粒P3的菌落在含有四环素的培养基中不能生长，但在含有氨苄青霉素的培养基中能生长。分析表中信息：A菌落在含有氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其菌体中含有的氨苄青霉素抗性基因（ampr）和四环素抗性基因（tetr）的结构均完好，因此已导入质粒PO。B菌落在含有任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其菌体中不含有ampr tetr，所以未导入质粒。C菌落在含有四环素的培养基中不能生长，但在含有氨苄青霉素的培养基中能生长，说明其菌体中含有的ampr的结构完好，而含有的tetr的结构被破坏，因此C菌落已导入质粒P3。
(4) 将目的基因导入动物细胞，常用显微注射技术。
12.利用基因工程生产胰岛素有三种方法：一是将胰岛素基因转入细菌细胞，进行微生物培养，提取胰岛素；二是将胰岛素基因转入小鼠等动物细胞，进行细胞培养，提取胰岛素；三是将胰岛素基因转入高等哺乳动物的受精培养成转基因动物并从其乳汁或尿液中提取胰岛素。
（1）三种方法中，哪种方法得到的胰岛素需要进一步加工和修饰以使其获得生物活性?____________。方法二和方法三将目的基因导入受体细胞常用的方法是_________________
（2）转胰岛素基因牛可通过分泌乳汁来生产人胰岛素，在转入牛受精卵的基因表达载体中，人胰岛素基因的首端必须含有________________________。转入目的基因的牛受精卵要在___________________期取____________________细胞进行性别鉴定。为提高胚胎的利用效率，可以通过胚胎分割技术得到同卵双犊，在分割时，应将_______________________均等分割。
（3）大肠杆菌和酵母菌均可作为生产胰岛素的工程菌，该类工程菌的优点是_______。(至少答出两点)
（4）用基因工程生产的胰岛素被注射到患者血液中容易被分解，使治疗效果受到影响。科学工作者通过对传统胰岛素进行改造，生产出不易被分解的高效胰岛素，这属于生物工程中__________________________的范畴。
【答案】方法一 显微注射法 乳腺蛋白基因的启动子 囊胚 滋养层 囊胚的内细胞团 单细胞、繁殖快 蛋白质工程
【解析】
（1）细菌没有内质网和高尔基体，其生产的胰岛素需在体外进行加工修饰以获得生物活性；将目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射法；
（2）转胰岛素基因牛可通过分泌乳汁来生产人胰岛素，为使目的基因正常表达，人胰岛素基因的首端必须含有乳腺蛋白基因的启动子；进行性别鉴定时，可选取发育到囊胚期的滋养层细胞进行鉴定；利用胚胎分割技术时，为保证子代的成活率和生长一致性，应将囊胚的内细胞团均等分割；
（3）大肠杆菌和酵母菌均为单细胞生物，繁殖速度快，可快速获得大量产物，且产物容易提取，故均可作为生产胰岛素的工程菌；
（4）对胰岛素基因进行修饰，生产出不易被分解的高效胰岛素，这属于蛋白质工程的范畴。
13.如图的两幅图是制备单克隆抗体的示意图，请据图回答下列问题：

（1）图1和图2所示过程中，都必须用到的动物细胞工程技术是________。用PCR技术扩增无限增殖基因除需要原料、能量、模板外还需要________和________。
（2）图1中②过程与植物原生质体融合的不同之处是用________诱导，图2中B所示的细胞特点是________。
（3）培养杂交瘤细胞时应保证被培养的细胞处于________的环境。抗体在抵抗外来病原体入侵方面具有十分重要的作用，这体现了免疫系统的________功能。
（4）十九大提出“绿水青山就是金山银山”，要实现这一目标不仅需要对破坏的生态环境进行恢复，还要考虑当地人的经济发展和生活需要，这主要遵循了生态工程的________。
【答案】动物细胞培养 引物 Taq酶 灭活的病毒 既能无限增殖，又能产生特异性抗体 无菌无毒 防卫 整体性原理
【解析】
（1）制备单克隆抗体的技术属于生物技术的动物细胞工程，都需要使用动物细胞培养技术。PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术；其原理是DNA复制，需要一定的条件，包括模板DNA、能量、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。
（2）图1中的②表示B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，常在聚乙二醇（灭活的病毒、电刺激等）诱导下完成，与植物原生质体融合的不同之处是用灭活的病毒诱导，图2中B为杂交瘤细胞既能无限增殖，又能产生特异性抗体。
（3）培养杂交瘤细胞时应保证被培养的细胞处于无菌、无毒及充足氧气的环境中。免疫系统具有监控，防卫，清除功能，抗体抵抗外来病原体入侵体现了免疫系统的防卫功能。
（4）十九大提出“绿水青山就是金山银山”，要实现这一目标不仅需要对破坏的生态环境进行恢复，还要考虑当地人的经济发展和生活需要，这主要遵循了生态工程的整体性原理。
14.为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与Ti质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。回答下列问题：

（1） PCR技术所用到的关键酶是__________，利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，其目的是__________。
（2）图1是花色基因C两侧被EcoR I酶切后所形成的末端结构，请写出EcoR I酶识别序列并标出切点：__________（用“↓”表示切点位置）。图2中EcoRI酶所识别的位点应在Ti质粒的__________片段上。
（3）将导人目的基因的菊花细胞培养成植株需要利用__________技术，其原理是__________。
（4）在个体生物学水平上，如何鉴定转基因菊花培育是否成功？____________________
【答案】热稳定DNA聚合酶（Taq酶） 要根据这一序列合成引物 G↓AATTC T-DNA 植物组织培养 植物细胞具有全能性 观察转基因菊花是否表现出基因C所控制的花色
【解析】
（1）由于PCR技术应用了DNA双链复制的原理，在高温情况下进行，该过程需要的关键酶是热稳定DNA聚合酶；该过程中要有一段已知目的基因的核苷酸系列，以便根据这一序列合成引物；
（2）根据酶切后形成的序列，可以推测出EcoR I酶识别的序列为GAATTC，且在酶切以后单独形成一个G，所以酶切位点为G↓AATTC；由于后续需要将目的基因导入到受体细胞中，所以会将目的基因转移至Ti质粒的T-DNA片段上；
（3）目的基因导入到植物细胞，从而培育出新的植一般都需要植物组织培养技术的协助；该过程应用的原理是植物细胞具有全能性；
（4）目的基因的检测在个体水平上需要观察到明显的性状变化或蛋白质的合成，因此该过程需要观察转基因菊花是否表现出基因C所控制的花色。
15.酵母菌是一类在自然界中分布广泛的单细胞真菌，可以利用酵母菌制作果酒。请回答下列问题：
（1）果酒的制作离不开酵母菌。酵母菌中将葡萄糖分解为酒精的酶分布于__________。酵母菌大量繁殖除了需要果汁外，还要控制的条件有___________（答两点）等。
（2）某小组将三种酵母菌分别接种在相同浓度的培养液中，在相同且适宜条件下密闭发酵。实验中需轻轻摇晃瓶子并拧松瓶盖，请分析其中的原理：______________。每隔一段时间对发酵瓶进行称重，然后计算其失重量。失重量最大的发酵瓶相对应的菌种对酒精的耐力________________。
（3）固定化酵母细胞多采用________法固定，与固定化酶相比，固定化细胞的优缺点有____________________。
【答案】细胞质基质 有氧（氧气）、温度20℃左右 酒精发酵过程中有CO2产生，轻轻摇晃有利于放气，拧松但不打开瓶盖可在一定程度上防止杂菌污染 较大 包埋 优点：可催化一系列反应、成本低，操作简单、易回收；缺点：不容易与反应物接触，反应效率低
【解析】
（1）酵母菌将葡萄糖分解为酒精的过程属于无氧呼吸，在细胞质基质中进行，故酵母菌中将葡萄糖分解为酒精的酶也分布于细胞质基质中。酵母菌大量繁殖需要果汁为其提供碳源、氮源、水和无机盐，还要控制的条件有有氧、温度20℃左右等。
（2）某小组将三种酵母菌分别接种在相同浓度的培养液中，在相同且适宜条件下密闭发酵。酒精发酵过程中有CO2产生，故实验中需轻轻摇晃瓶子并拧松瓶盖而不打开，有利于放气，同时可以防止杂菌污染。每隔一段时间进行称重，然后计算发酵瓶的失重量，发酵瓶失重是由于有CO2放出，因此失重量最大的发酵瓶相对应的菌种释放CO2多，产生酒精多，对酒精的耐力较大。
（3）固定化酵母细胞多采用包埋法固定，与固定化酶相比，固定化细胞可催化一系列反应、成本低、操作简单、易回收，但不容易与反应物接触、反应效率低。
16.GOLS2基因表达可提高植物细胞内糖类含量，降低植物叶片气孔开度。科研人员将拟南芥GOLS2基因导人并整合到水稻染色体上。请回答下列问题：
（1）从cDNA文库中获得的目的基因___________ （填“含有”或“不含有”）启动子和终止子。通过PCR技术获取GOLS2基因的原理是_________________________，需设计_____种引物。
（2）GOLS2基因可以整合到水稻染色体上的遗传学物质基础是____________。需将GOLS2基因拼接在运载体上才能成功转化，转化指的是___________________。
（3）基因表达载体的组成除了GOLS2基因外，还必须有___________等；在构建基因表达载体过程中，常把两个启动子串联在一起形成双启动子，加在GOLS2基因上游，双启动子的作用可能是________________，进一步提高细胞内糖类含量。
【答案】不含有 DNA 双链复制 2 不同生物DNA分子的基本结构相同 目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程 标记基因、启动子、终止子 保证目的基因的高效转录（表达）
【解析】
（1）cDNA基因文库中的DNA是通过逆转录产生的，所以从cDNA文库中获得的目的基因不含有启动子和终止子。通过PCR技术获取GOLS2基因的原理是DNA双链复制，需设计2种引物。
（2）由于不同生物DNA分子的基本结构相同，所以GOLS2基因可以整合到水稻染色体上。基因工程中的转化指的是目的基因进人受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
（3）基因表达载体的组成除了GOLS2基因外，还必须有标记基因、启动子、终止子等；在构建基因表达载体过程中，常把两个启动子串联在一起形成双启动子，加在GOLS2基因上游，双启动子的作用可能是保证目的基因的高效转录（表达），进一步提高细胞内糖类含量。
17.人体移植器官短缺是一个世界性难题。但随着生物技术的发展，人们逐渐有了新的解决思路：

I.寻求可替代器官
剔除猪的某些基因，用猪的器官作为供体。目前科学家借助CPISPR—Cas9基因编辑技术能够剔除猪的某些相关基因，如图为Cas9蛋白依据sgRNA片段切割DNA示意图（不同的sgRNA可以识别不同的DNA序列），请回答下列问题：
（1）DNA重组技术主要用到的工具酶包括DNA连接酶和_____________，图中充当该酶的物质是_________________。
（2）Cas9—sgRNA复合体能够精准识别某核苷酸序列的原因可能是_____________。
II.自体器官培养
大体思路是：将病人的体细胞核放入去核的卵母细胞中，让重组细胞发育为早期胚胎，利用胚胎干细胞诱导分化为特定的器官。
（3）重组细胞体外培养需要一定的O2和CO2，CO2的主要作用是__________；胚胎干细胞的功能特点为：______________。
（4）该过程的核心技术是：_________，该过程依据的原理是_________。这种方法获得的器官移植时不会发生免疫排斥反应，这是因为：_____________。
【答案】限制性核酸内切酶（限制酶） Cas9—sgRNA复合体 sgRNA（是单链）可与特定（靶）核苷酸序列碱基互补配对 维持培养液的pH值 具有（发育的）全能性 （动物体细胞）核移植技术 动物体细胞的细胞核具有全能性 该器官的遗传物质与原机体基本相同，进入机体后，不会成为抗原，不会发生免疫排
【解析】
（1）DNA重组技术主要用到的工具酶包括DNA连接酶和限制性核酸内切酶，图中充当该酶的物质是Cas9—sgRNA复合体。
（2）Cas9—sgRNA复合体能够精准识别某核苷酸序列的原因可能是单链sgRNA可与特定核苷酸序列碱基互补配对。
（3）重组细胞体外培养需要一定的O2和CO2，CO2的主要作用是维持培养液的pH值；胚胎干细胞的功能特点为：具有发育的全能性。
（4）该过程的核心技术是：核移植技术，该过程依据的原理是动物体细胞的细胞核具有全能性。这种方法获得的器官移植时不会发生免疫排斥反应，这是因为：该器官的遗传物质与原机体基本相同，进入机体后，不会成为抗原，不会发生免疫排。
18.2019 年中国科学院神经科学研究所利用 CRISPR—Cas9 基因编辑技术，成功构建了世界首例核心节律基因 BMAL1 敲除猕猴模型，并成功用基因敲除猴的体细胞通过克隆技术培育了5只克隆疾病猴，为节律紊乱相关疾病机理的研究提供了比较理想的动物模型。CRISPR—Cas9 基因编辑系统由单链向导 RNA（sgRNA）和 Cas9 蛋白组成。回答下列问题：
（1）科学家常用______法将 CRISPR—Cas9 基因编辑系统导入猕猴细胞，编辑系统利用 sgRNA 来识别靶基因 DNA，并引导 Cas9 蛋白剪切 DNA，使靶基因发生改变，实现基因敲除。sgRNA 能识别靶基因 DNA 的原因是______________________ 。
（2）在体外培养猕猴体细胞时，需要一定比例的 O2 和 CO2，故通常采用________或_________________________（填实验器材），将其置于 CO2 培养箱中进行培养。所使用的培养基属于_________________________（填“合成”或“天然”）培养基，培养基除了灭菌外，还需要通过_____________________________来保证无菌无毒环境。
（3）进行体细胞克隆选择去核卵母细胞作为受体细胞，可能原因是 _____________________ （答出两点）。
（4）克隆猴被用于人类疾病研究与治疗中所具有的突出优点是_____________________。（答出一点）
【答案】显微注射 sgRNA 的碱基序列能与靶 DNA 的碱基序列发生互补结合 培养皿 松盖培养瓶 合成 添加一定量的抗生素并定期更换培养液 去核卵母细胞的体积较大，易于进行实验操作；含有较多的营养物质，可以满足早期胚胎发育的需要；含有使已经分化的细胞核恢复分裂能力的物质 亲缘关系近；克隆动物能减少个体差异的影响
【解析】
（1）将目的基因注入动物细胞常用显微注射，sgRNA本质是RNA，基因 DNA本质是DNA分子，都是由核苷酸组成的长链，遵循碱基互补配对原则，所以二者能够识别的原因是sgRNA 的碱基序列能与靶DNA的碱基序列发生互补结合。
（2）动物细胞培养可以在培养皿和松盖培养瓶中进行，将其置于 CO2 培养箱中进行培养。所用的培养基需要明确各种化学成分，所以是合成培养基，培养基需要添加一定量的抗生素（可以杀菌）并定期更换培养液来保证无菌无毒环境。
（3）去核卵母细胞的体积较大，易于进行实验操作；含有较多的营养物质，可以满足早期胚胎发育的需要；含有使已经分化的细胞核恢复分裂能力的物质，所以可以作为受体细胞。
（4）猴子与人的亲缘关系近；克隆动物能减少个体差异的影响，所以克隆猴被用于人类疾病研究与治疗。
19.动物细胞融合是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。利用细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。回答下列问题。
（1）细胞融合技术突破了有性杂交方法的局限，使___________杂交成为可能。诱导动物细胞融合时，常用的诱导因素有______________（答出2点）和灭活的病毒等。
（2）灭活的病毒诱导细胞融合的原理是：病毒表面含有的____________能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝聚，细胞膜上的____________重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
（3）把从免疫小鼠的脾脏中提取的B细胞与骨髓瘤细胞混合，体外诱导细胞融合，第一次筛选时，未融合的亲本细胞和____________都会死亡，而保留的细胞是_____________，这种细胞的特点是______________________。
【答案】远缘（或不同物种之间的） 聚乙二醇（或PEG）、电激 糖蛋白和一些酶 蛋白质分子和脂质分子 融合的具有同种细胞核的细胞 杂种细胞（或杂交痼细胞） 既能迅速大量繁殖，也能产生抗体
【解析】
（1）细胞融合技术突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。诱导动物细胞合时，常用的诱导因素有聚乙二醇（PEG）、电激和灭活的病毒等。
（2）灭活病毒诱导细胞融合的原理是病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
（3）进行细胞融合时，会得到融合的具有相同细胞核的细胞，细胞融合的具有不同细胞核的细胞和未融合的亲本细胞。融合的具有不同细胞核的细胞也就是杂种细胞或杂交瘤细胞。“既能迅速大量繁殖，也能产生抗体”是杂交瘤细胞的特点。
20.回答下列与生物工程相关的问题：
（1）基因工程是指将自然界中已有的一种生物的基因转移到另一种生物体内，使后者可以产生它本不能产生的蛋白质。而被称为第二代基因工程的蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因____________，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
（2）基因工程的工具酶之一是限制酶，它主要是从____________中获得，其特点是___________。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切位点，这些限制酶切位点的作用是____________。
（3）基因工程的另一种工具酶是DNA连接酶。T4DNA连接酶相比E·coliDNA连接酶，其独特的作用是____________________。
（4）动物基因工程通常用__________作受体细胞，当胚胎发育到__________阶段时，通过__________技术移入母体子宫内继续发育，暂不移入的胚胎可使用冷冻方法保存。
【答案】修饰或合成 原核生物（或微生物） 能够识别DNA分子特定的（脱氧）核苷酸序列，并在特定位点切割DNA 供外源DNA片段（基因）插入 可以连接双链DNA片段的平末端 MⅡ中期的卵母细胞（或受精卵） 桑椹胚或囊胚 胚胎移植
【解析】
（1）根据蛋白质工程的定义可知，蛋白质工程是是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求；
（2）限制酶是基因工程的“手术刀”，能够识别DNA分子特定的（脱氧）核苷酸序列，并在特定位点切割DNA，主要从原核生物中获得；质粒分子限制酶切位点的作用是供外源DNA片段（基因）插入；
（3）E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端，T4DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端，故T4DNA连接酶相比E·coliDNA连接酶，其独特的作用是可以连接双链DNA片段的平末端；
（4）因受精卵的全能性高，故动物基因工程的受体细胞通常是受精卵；为充分发挥优良个体的繁殖潜力，可用胚胎移植的方法来实现，胚胎移植的时期是桑椹胚或囊胚期。
21.现代生物工程技术推动了医药学、免疫学等领域的发展。例如，为解决不孕不育夫妇的生育问题而出现的试管婴儿技术，给千万家庭带来了福音，但生物技术是一把双刃剑，可以造福人类，若使用不当也可能给人类带来灾难。请回答下列问题：
（1）试管婴儿技术是体外受精技术、早期胚胎培养和___________技术等人工助孕技术的俗称；通过试管婴儿技术繁殖后代属于___________（填“有性”或“无性”）生殖。
（2）体外受精首先需采集卵子，发育到____期的卵子能与获能的精子在___________或___________中完成受精作用。
（3）胚胎移植时，受体对移人子宫的外来胚胎基本上不发生___________，这为胚胎在受体内的存活提供了可能；通过试管动物技术培养发育成的早期胚胎，再经过___________可产生多个基因型相同的后代。
（4）“试管婴儿”技术诞生后，继而出现了“设计试管婴儿”技术，后者可以用于治疗需要骨髓移植或造血干细胞移植等疾病。与“试管婴儿”技术不同的是，“设汁试管婴儿”技术胚胎在移植前需进行___________。
（5）现在大多数人反对设计婴儿性别，其原因是___________。
【答案】胚胎移植 有性 减数第二次分裂中 获能溶液 专用的受精溶液 免疫排斥反应 胚胎分割和胚胎移植 遗传学诊断 此做法破坏了人类正常的性别比例，违反了伦理道德（答案合理即可给分）
【解析】
（1）试管婴儿技术是体外受精技术、早期胚胎培养和胚胎移植技术等人工助孕技术的俗称；试管婴儿技术中仍有精子和卵细胞结合成受精卵的过程，其生殖方式仍然是有性生殖。
（2）体外受精主要包括卵母细胞的采集、精子的获取和受精等几个主要步骤。采集的卵子，需将其培养到减数第二次分裂中期才具备与精子受精的能力，精子获能后可以在获能溶液或专用的受精溶液中与培育成熟的卵子完成受精作用形成受精卵。
（3）胚胎移植时，受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应，这为胚胎在受体内的存活提供了可能。通过试管动物技术培养发育成的早期胚胎，再经过胚胎分割和胚胎移植可产生多个基因型相同的后代。
（4）“试管婴儿”技术主要用于治疗不孕不育夫妇的生育问题，而“设计试管婴儿”技术可以用于治疗需要骨髓移植或者造血干细胞移植等疾病，且胚胎在移植前需进行遗传学诊断。
（5）设计婴儿性别等会引起性别比例失调，违反了伦理道德。
22.人血清白蛋白（HSA）具有重要的医用价值。下图是以基因工程技术获取HSA的两条途径，其中报告基因表达的产物能催化无色物质K呈现蓝色。回答下列问题。

（1）基因工程中可通过PCR技术扩增目的基因。生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是___________；在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是___________上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA分子双链间的___________。
（2）已知碱性磷酸酶能除去核苷酸末端的5磷酸，构建表达载体的过程中用该酶处理Ti质粒，但HSA基因不用碱性磷酸酶处理，这样做的目的是___________，经过上述处理后的Ti质粒在DNA连接酶的作用下可与HSA基因之间形成___________个磷酸二酯键，再经相关处理获得结构完整的重组DNA分子。
（3）过程①中需将植物细胞与农杆菌混合后共同培养后，还应转接到含___________的培养基上筛选出转化的植物细胞。③过程中将目的基因导入绵羊受体细胞，采用最多，也是最为有效的方法是___________，还可以使用动物病毒作为载体，实现转化。
（4）为检测HSA基因的表达情况，可提取受体细胞的___________，用抗血清白蛋白的抗体进行杂交实验。
【答案】解旋酶 加热至90~95℃ 氢键 防止Ti质粒发生自身连接 2 无色物质K 显微注射技术 蛋白质
【解析】
（1）生物体细胞内的DNA复制开始时，在解旋酶的作用下可以解开DNA双链；在体外利用PCR技术扩增目的基因时，加热至90~95℃引起模板DNA解链为单链，上述两个解链过程均破坏了DNA分子双链间的氢键。
（2）为了防止Ti质粒发生自身连接，构建表达载体的过程中用该酶处理Ti质粒，但HSA基因不用碱性磷酸酶处理。目的基因两端的序列均与质粒连接，故在DNA连接酶的作用下可与HSA基因之间形成2个磷酸二酯键，再经相关处理获得结构完整的重组DNA分子。
（3）由于报告基因表达的产物能催化无色物质K呈现蓝色，故过程①中需将植物细胞与农杆菌混合后共同培养后，还应转接到含无色物质K的培养基上筛选出转化的植物细胞。③过程常用显微注射法将目的基因导入绵羊受体细胞，还可以使用动物病毒作为载体，实现转化。
（4）为检测HSA基因的表达情况，看其是否表达出HAS，可提取受体细胞的蛋白质，用抗血清白蛋白的抗体进行杂交实验，看是否出现杂交带。
23.电影《我不是药神》中的格列宁是一种治疗癌症的靶向药物，此类靶向药物可称为“生物导弹”。利用单克隆抗体来诊断和治疗癌症可能会成为攻克癌症的重要手段，以下为单克隆抗体制备流程图：

（1）若该图中的单克降抗体与药物结合制成“生物导弹”治疗肠癌，则图中特定抗原通常是_________。靶向药物比普通的化疗药物疗效高、毒副作用小是因为______________________。
（2）图中诱导细胞融合时常用的化学试剂是_____________，选择性培养基上未融合的亲本细胞和_____________的细胞都会死亡，只有__________才能生长。
（3）近年来，科学家发现丁酸钠对杂交瘤细胞产生单克隆抗体有一定的影响，某科研小组进行了相关实验，结果如下表：
丁酸钠对杂交瘤细胞产生单克隆抗体的影响
丁酸钠的浓度（mmo1/L）
时间（h）
48
96
144
0
1∶320
1∶640
1∶1200
0．25
1∶320
1∶1280
1∶2500
0．5
1∶160
1∶2500
1∶2500
0．75
1∶320
1∶320
1∶640
注：（表中比值表示抗体效价，1：#中#值越高表明越有利于抗体的产生）
该实验过程中培养杂交瘤细胞的培养瓶放在了含的培养箱中培养，的主要作用是___________，该实验的自变量为________________。在该实验基础上，请设计实验：探究培养时间为144h，促进杂交瘤细胞产生单克隆抗体的丁酸钠的最适浓度。
简述设计思路：_______________________。
【答案】（肠）癌细胞（膜）表面的蛋白质 既不损伤正常细胞，又减少了用药剂量 聚乙二醇 融合的具有同种核的细胞 融合的杂种细胞 维持培养液的pH 丁酸钠的浓度和培养时间 在丁酸钠浓度范围内，设置系列更小浓度梯度实验，培养时间144h，其余条件与原实验相同，检测各组抗体效价。（能够正确体珂自变量的控制即浓度范围和梯度、无关变量的控制、因变量检测指标）
【解析】
（1）单克隆抗体在癌症治疗中可作为“生物导弹”，单克隆抗体有两个V区，其中一个V区可以识别癌细胞表面特定的抗原（癌细胞表面的蛋白质），另一个V区可以和T细胞、抗癌药物、放射性物质等结合，使其定向杀伤癌细胞，将癌细胞消灭掉而不影响正常细胞，所以疗效高，毒副作用小。
（2）诱导动物细胞融合常用的诱导因素有电激、聚乙二醇（PEG）、灭活的病毒等。若该过程是制备单克隆抗体，在诱导细胞融合中，所形成的融合细胞有两两融合细胞3种：AA型、BB型、AB型，用来培养的融合细胞应该是AB型的杂交瘤细胞，从中选择出它的方法是用选择性培养基进行筛选，同种自身融合的细胞都不能存活，存活生长的是异种细胞融合的杂交细胞，杂交瘤细胞的特点是：既能无限繁殖，又能产生特异性抗体。
（3）细胞培养应在含有5%CO2的恒温培养箱中进行，其中CO2的作用是维持培养液的pH。从表格中看出，实验处理不同的素是丁酸钠的浓度和处理时间，是实验的自变量。检测的指标是抗体效价为因变量。实验数据显示，培养时间为144小时，丁酸钠的浓度为0.25～0.5 mmo1/L时，抗体效价最高。在这个浓度范围内，为探究更适宜的浓度，可以设置系列更小浓度梯度的实验相互对照，按照单克隆抗体的制备过程，在杂交瘤细胞的培养液中，分别加入等量的不同浓度的丁酸钠溶液，再加入等量的同种杂交瘤细胞，在培养箱中培养144小时，检测实验组抗体的效价，确定较适浓度。
24.有些人饮用牛奶后，不能完全消化牛奶中的乳糖。若将乳糖酶基因导入奶牛基因组中，可以使获得的转基因牛分泌的乳汁中乳糖含量大大减少，而其他营养成分不受影响。请回答下列问题：
(l)为了获得乳糖酶基因，可以从人体细胞内提取____来合成cDNA，再以cDNA为模板，利用 ___（填中文名称）扩增乳糖酶基因。
(2)质粒载体作为基因工程的运载体，应具备的基本条件有 ___（答出两点）等。按其来源不同，基因工程中使用的DNA连接酶分为两类，即 _____________。
(3)将重组表达载体导入奶牛受精卵常用的方法是____。为了获得母牛，需对已成功转入目的基因的胚胎进行 _________。
(4)在胚胎移植前，通过____技术能获得多个胚胎从而获得多个转乳糖酶基因牛，这体现了早期胚胎细胞的 ______。
【答案】mRNA 多聚酶链式反应 有自我复制能力；有一个或多个限制酶的切割位点；带有标记基因；分子大小适宜 T4 DNA连接酶和E．coli DNA连接酶 显微注射法 性别鉴定 胚胎分割 全能性
【解析】
（1）为了获得乳糖酶基因，可以从人体细胞内提取mRNA，反转录来合成互补DNA，即cDNA，然后通过多聚酶链式反应（PCR）短时间内大量扩增目的基因。
（2）质粒载体作为基因工程的运载体，应具备的基本条件有：有自我复制能力；有一个或多个限制酶的切割位点；带有标记基因；分子大小适宜等。基因工程中使用的DNA连接酶为：T4 DNA连接酶和E．coli DNA 连接酶。
（3）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，为了获得母牛，需对已成功转入目的基因的胚胎进行性别鉴定。
（4）胚胎分割是指采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术，通过该技术能获得多个胚胎从而获得多个转乳糖酶基因牛，体现了早期胚胎细胞的全能性。
25.糖尿病已经成为危害人类健康的严重疾病之一。糖尿病不仅与人们不健康的生活方式有关，也与患者体内胰岛素的缺乏有关。利用转基因技术实现胰岛素的批量生产就成为了目前糖尿病治疗的新思路，请回答下列相关问题：
（1）对于胰岛素基因的获取，一是通过提取____________细胞中的胰岛素mRNA，经过 _____________过程合成，之后通过 _________技术大量扩增；二是通过分析胰岛素的______________________________序列，进行人工合成。
（2）利用基因工程技术实现胰岛素的批量生产的过程中，关键操作环节是 ________。这一关键操作的目的是：①使目的基因 ______________________________ ；②使目的基因能够表达和发挥作用。
（3）为了将改造后的分子顺利导入大肠杆菌体内，一般需要用Ca2+处理大肠杆菌，使之成为 ______ 细胞。得到的人胰岛素需要体外加工才具有生物活性，原因是大肠杆菌 _____________________________________ 。
【答案】胰岛B 反转录 PCR 氨基酸 基因表达载体的构建 在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给后代 感受态 没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质进行加工
【解析】
（1）对于胰岛素基因的获取，一是通过提取胰岛B细胞的胰岛素mRNA，经过逆转录过程合成，之后通过PCR技术大量扩增；二是氨基酸序列法获取目的基因，通过分析胰岛素的氨基酸序列，进行人工合成。
（2）基因工程的操作步骤中，构建基因表达载体是基因工程操作步骤中的关键环节。构建基因表达载体的目的包括：①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给后代；②使目的基因能够表达和发挥作用。
（3）为了将改造后的分子顺利导入大肠杆菌体内，一般需要用CaCl2溶液处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞。由于大肠杆菌属于原核生物，没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质进行加工，因此得到的人胰岛素需要体外加工才具有生物活性。
26.GRFT是一种来源于红藻的外源凝集素，能作为治疗艾滋病的候选药物。某实验小组将GRFT基因导入烟草细胞的染色体基因组中，发现烟草中GRFT基因的表达量可达60%~90%。请回答下列问题：
（1）将GRFT基因导入烟草细胞的染色体基因组的方法为__________，该方法能将GRFT基因导人烟草细胞的染色体基因组，利用的是T—DNA具有_________的特点。
（2）构建重组质粒时可插入NPTII基因，具有该基因的转基因植物的叶绿体离体培养时会出现退绿现象，据此可知重组质粒中的NPTII基因实质上是一种_________，其作用是_________。基因工程中的运载体除了质粒外，还有___________。
（3）欲大量获得GRFT，可利用植物组织培养技术将转基因烟草细胞培育到______阶段，原因是该阶段的细胞具有______________________的特点。
【答案】农杆菌转化法 可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体的DNA上 标记基因 鉴别受体细胞中是否有目的基因，从而将含自的基因的细胞筛选出来 动植物病毒以及λ噬菌体的衍生物 愈伤组织 分裂、代谢旺盛
【解析】
（1）将GRFT基因导入烟草细胞的染色体基因组的方法为农杆菌转化法，该方法能将GRFT基因导入烟草细胞的染色体基因组，农杆菌中Ti质粒上的T-DNA具有可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体的DNA上的特点。
（2）构建重组质粒时可插入NPTII基因，具有该基因的转基因植物的叶绿体离体培养时会出现退绿现象，据此可知重组质粒中的NPTII基因实质上是一种标记基因，其作用是鉴别受体细胞中是否有目的基因，从而将含自的基因的细胞筛选出来。基因工程中的运载体除了质粒外，还有动植物病毒以及λ噬菌体的衍生物。
（3）欲大量获得GRFT，可利用植物组织培养技术将转基因烟草细胞培育到愈伤组织阶段;原因是该阶段的细胞分裂、代谢旺盛，可从培养液中大量获得GRFT。
27.大约有超过1/3的非洲人靠木薯获取超过一半的热量，然而以木薯为主食会营养不均衡，铁和锌的缺乏在非洲非常常见，严重影响了人体的健康。科学家从植物拟南芥中获得IRTⅠ基因（编码铁转运蛋白）和FERⅠ基因（编码铁储存蛋白），从而获得铁、锌含量高的木薯。回答下列问题：
（1）从拟南芥细胞中获得IRT1基因的mRNA得到cDNA，依据的原理是_________，该cDNA不包括基因中的_________部分。
（2）基因表达载体的构建是基因工程的核心，构建成的基因表达载体中，IRT1基因和FERI基因的首端，需加上_______（填“拟南芥”或“木薯”）细胞中能表达基因的启动子。标记基因的作用是____________。
（3）将目的基因导入木薯细胞中采用最多的是______法，生产实践发现，损伤的木薯植物更容易被转化，原因是_________。带有目的基因的细胞经过__________技术培育成转基因植物。
（4）IRTI基因和FERⅠ基因已经整合到基因组中的转基因植株内，但运输铁的能力没有提高，根据中心法则的内容分析，最可能的原因是___________。
【答案】在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对原则可以合成cDNA 启动子和内含子 木薯 鉴别和筛选出含有目的基因的细胞 农杆菌转化 伤口处细胞分泌的酚类化合物，利于农杆菌的侵染 植物组织培养 IRT1基因未表达（未转录或未翻译）
【解析】
（1）在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对原则可以合成cDNA，从而以拟南芥细胞中获得IRT1基因的mRNA，逆转录得到cDNA，但是cDNA不包括基因中的启动子和内含子。
（2）从拟南芥中获得得IRT1基因和FER1基因是逆转录出来得cDNA，而后导入到木薯细胞中，所以需要加上木薯细胞中能表达基因的启动子。标记基因的作用是鉴别和筛选出含有目的基因的细胞。
（3）基因工程中导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化，生产实践发现，损伤的木薯植物更容易被转化，原因是伤口处细胞分泌的酚类化合物，利于农杆菌的侵染。带有目的基因的细胞经过植物组织培养技术培育成转基因植物。
（4）IRT1基因和FER1基因已经整合到基因组中的转基因植株内，但运输铁的能力没有提高，所以最可能的原因是IRT1基因未成功表达。
28.2018年7月，某生物公司的百白破疫苗检验不符合规定。为生产高效价疫苗和简化计划免疫程序，科学家研制出基因工程乙肝-百白破(rHB-DTP)四联疫苗，经各项检测均通过rHB-DTP四联疫苗制检规程的要求。其有效成分是乙肝病毒表面抗原、百日咳杆菌、白喉杆菌和破伤风杆菌的四种类毒素。请分析回答下列问题：
(1)为获取百日咳杆菌类毒素的基因，可从百日咳杆菌的细胞中提取对应____________，在逆转录酶的作用下合成双链cDNA片段，获得的cDNA片段与百日咳杆菌中该基因碱基序列__________________(填“相同”或“不同”)。
(2)由于乙肝病毒表面抗原的基因序列比较小，且序列已知，获得目的基因可采用__________，然后通过____________大量扩增，此技术的前提是已知一段目的基因的核苷酸序列以便合成引物。
(3)把目的基因导受体细胞时，科学家采用了改造后的腺病毒作为载体，写出你认为科学家选它的理由________________________________________________。(写出2点)
(4)研究发现，如果将白喉杆菌类毒素20位和24位的氨基酸改变为半胱氨酸，免疫效果更好，请写出此种技术的基本流程____________________________________。
(5)实验证明，一定时间内间隔注射该疫苗3次效果更好，其主要原因是体内产生的_________数量增多，当同种抗原再次侵入人体时二次免疫的特点是____________，免疫预防作用更强。
【答案】mRNA 不同 化学方法人工合成（人工化学合成） PCR技术 能自主复制 有多个限制酶切位点、有标记基因 从预期蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列 记忆细胞 短时间内迅速产生大量的抗体和记忆细胞
【解析】
(1)为获取百日咳杆菌类毒素的基因，可从百日咳杆菌的细胞中提取对应mRNA，在逆转录酶的作用下合成双链cDNA片段，获得的cDNA片段与百日咳杆菌中该基因碱基序列不同。
(2)由于乙肝病毒表面抗原的基因序列比较小，且序列已知，获得目的基因可采用化学方法人工合成（人工化学合成），然后通过PCR技术大量扩增。
(3)改造后的腺病毒有多个限制酶切位点、有标记基因，且能自主复制，因此可作为载体将目的基因导受体细胞。
(4)将白喉杆菌类毒素20位和24位的氨基酸改变为半胱氨酸利用的是蛋白质工程原理，基本流程是：从预期蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。
(5)实验证明，一定时间内间隔注射该疫苗3次效果更好，其主要原因是体内产生的记忆细胞数量增多，当同种抗原再次侵入人体时会引发二次免疫，二次免疫的特点是短时间内迅速产生大量的抗体和记忆细胞，免疫预防作用更强。
29.含有限制酶的细胞中通常还具有相应的甲基化酶，这两种酶对 DNA 分子有相同的作用序列，但具有不同的催化功能。甲基化酶可以对 DNA 序列进行修饰，使限制酶不能对这一序列进行识别和切割。回答下列问题：
（1）目前，基因工程中使用的限制酶主要是从__________生物中分离纯化获得的，鉴定其化学本质可用_____________________。构建“基因组文库”和“cDNA文库”的过程中需要使用DNA连接酶的是____________(填“基因组文库”、“cDNA 文库”或“基因组文库和 cDNA 文库”）。
（2）含有某种限制酶的细胞，可以利用限制酶切割外源 DNA，但不破坏细胞自身的 DNA，其原因可能有①_______________________；②__________________________。
（3）DNA分子复制过程需要引物，引物是一小段____________。体外扩增DNA的PCR技术的中文名称是______________，PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、复性和延伸三步。在循环之前，常要进行一次预变性，以便_______________________
【答案】原核 双缩脲试剂 基因组文库和cDNA文库 细胞自身的 DNA 分子没有该限制酶的识别序列 甲基化酶对细胞自身的 DNA 分子进行了修饰 DNA或RNA(核酸) 多聚酶链式反应 增加大分子模板DNA彻底变性的概率
【解析】
（1）基因工程中常会使用到限制性内切酶，而限制性内切酶主要是从原核生物中分离纯化获得的，限制性内切酶的化学本质是蛋白质，故鉴定其化学本质可用双缩脲试剂；在构建我们现代的“基因组文库”和“cDNA”文库的过程中，所获取的基因都需要导入到受体菌的群体中储存起来，因此都需要使用到的DNA连接酶。
（2）对于某种限制酶切割一定的DNA序列来言，如果细胞自身的DNA分子没有该限制酶的识别序列，或者甲基化酶对细胞自身的DNA分子进行了修饰，那么由于酶的专一性，这种限制性酶就不会对细胞本身发挥作用，可以切割外源的DNA，但是不会破坏细胞自身的DNA。
（3）DNA分子复制过程的引物是一小段DNA或RNA(核酸)。PCR技术的中文名称是多聚酶链式反应，PCR在循环之前，常要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。
30.通过基因工程利用小球藻生产人胰岛素能克服利用细菌生产时的诸多不利影响。小球藻可大规模种植，并且所生产的胰岛素可以直接用于医疗和保健，该技术能提高小球藻的药用价值，形成高附加值的生物技术产品，同时也能降低医用蛋白的价格，使人胰岛素的应用得到普及。回答下列问题：
（1）基因工程操作的核心步骤是_______________，其目的是使目的基因在受体细胞中________________，并且可以通过复制遗传给下一代，同时，使目的基因表达和发挥作用。
（2）组成基因表达载体的单体是__________，基因表达载体上的启动子的作用是_____________________。
（3）在生物体外常用PCR技术来扩增目的基因。PCR的原理是__________________________________。在PCR体系中需要加入dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP），dNTP脱去两个磷酸后形成的物质能作为DNA合成的原料，则dATP和ATP在组成成分上的差别是___________________，在PCR体系中____________（填“需要”或“不需要”）加入ATP。
【答案】构建基因表达载体 稳定存在 脱氧核苷酸 RNA聚合酶识别和结合的部位，这种结合完成后才能驱动目的基因通过转录合成mRNA DNA的双链复制 构成dATP的是脱氧核糖，构成ATP的是核糖 不需要
【解析】
（1）基因工程的核心步骤是构建基因表达载体；构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以通过复制遗传给下一代，同时，使目的基因表达和发挥作用。
（2）基因表达载体的本质是DNA，其基本组成单位是脱氧核苷酸；基因表达载体中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，这种结合完成后才能驱动目的基因通过转录合成mRNA。
（3）PCR的原理是DNA的双链复制。在PCR体系中需要加入dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP），dNTP脱去两个磷酸后形成的物质能作为DNA合成的原料，则dATP和ATP在组成成分上的差别是构成dATP的是脱氧核糖，构成ATP的是核糖。在PCR体系中不需要ATP。
31.人血清白蛋白（HSA）是血浆中含量最丰富的蛋白质，在维持血浆渗透压、抗凝血等方面起着重要作用，具有重要的医用价值。如图是用基因工程技术获取重组HSA（rHSA）的两条途径。

（1）为获取HSA基因，首先要提取人血细胞中的mRNA，利用_______法合成cDNA，再利用PCR技术进行快速扩增，在这一过程中，需要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成_______，PCR过程中，温度降低到55℃的目的是_________________。
（2）构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体时，需要选择水稻胚乳细胞启动子，而不能选择其他物种和组织细胞的启动子，原因可能是_________________。
（3）在利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，为了吸引农杆菌移向水稻受体细胞，需添加_________物质。
（4）选用大肠杆菌作为受体细胞的优点有____________（答出两点即可）。但相比于水稻胚乳细胞，利用大肠杆菌获得的rHSA也有一些缺点，请从生物膜系统的角度进行分析_____________________。
（5）利用上述方法获得的rHSA不能直接用于临床医疗，你推测的原因是_____________。
【答案】反转录 引物 两种引物通过互补配对与两条单链DNA结合 启动子具有（物种及组织）特异性 酚类 繁殖快；单细胞；遗传物质少 大肠杆菌没有生物膜系统（或内质网和高尔基体），不能对rHSA进行深加工 rHSA可能没有生物活性或功能性较差或rHSA可能有安全隐忠
【解析】
（1）获取HSA基因，提取人血细胞中的mRNA，在逆转录酶的催化下利用反转录法合成cDNA，再利用 PCR技术进行快速扩增，PCR过程中，需要一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物，温度降低到55℃的目的是两种引物通过互补配对与两条单链DNA结合。
（2）由于启动子具有物种或组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体时，需要选择水稻胚乳细胞启动子。
（3）酚类物质会吸引农杆菌移向水稻受体细胞，在利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，故需添加酚类物质。
（4）大肠杆菌受体细胞的优点有繁殖快；单细胞。但相比于水稻胚乳细胞，大肠杆菌没有生物膜系统（或内质网和高尔基体），不能对rHSA进行深加工。
（5）利用上述方法获得的rHSA可能没有活性，不能直接用于临床医疗。