2023届高考生物二轮复习精研重难点(一)微生物的选择培养、鉴定和计数学案

精研重难点(一)　微生物的选择培养、鉴定和计数

从“高度”上研究高考

[典例]　(2022·全国甲卷)某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。

实验所用的培养基成分如下。

培养基Ⅰ：K2HPO4，MgSO4，NH4NO3，石油。

培养基Ⅱ：K2HPO4，MgSO4，石油。

操作步骤：

①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基 Ⅰ 中培养，得到A、B菌液；

②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。

回答下列问题。

(1)实验所用培养基中作为碳源的成分是______。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成____________(答出2种即可)等生物大分子。

(2)步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是______________。

(3)为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示(“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示无透明圈)，推测该同学的实验思路是______________________________________________________

________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(4)现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是________，理由是__________________________________________________________。

[解析]　(1)培养基的成分有碳源、氮源、无机盐和水等，从组成培养基的物质所含化学元素可知，作为碳源的成分是石油。生物大分子DNA、RNA、蛋白质都含有N元素，故氮源在菌体内可以参与合成这些物质。(2)由题意“资源和空间不受限制”可知，细菌的增殖呈“J”形曲线增长，由于DNA的半保留复制，细菌每繁殖一代就是上一代数量的2倍，根据公式Nt＝N0λt，λ＝2，繁殖n代后细菌的数量是N0•2n。(3)分析表格数据可知，实验的结果是在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能力高于B菌株；在平板Ⅱ上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，根据实验的单一变量和对照原则，推测该同学的思路。(4)由表格数据可知，在平板Ⅱ(无氮源的培养基)上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，所以要治理贫氮且被石油污染的土壤，应该选用A菌株，因为A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长。

[答案]　(1)石油　DNA、RNA、蛋白质

(2)N0•2n　(3)在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力　(4)A　A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长

从“深度”上提升知能

(一)选择培养基四种常见的制备方法

1．加入某些特定的物质

(前提是培养基具备全部营养成分)

2．改变培养基的营养成分

3．利用培养基“特定化学成分”分离

4．通过某些“特殊环境”分离

(二)辨析统计菌落数的两种方法

 从“宽度”上拓展训练

1．(2022·苏州一模)微生物的计数方法有多种，下列有关叙述错误的是(　 )

A．用滤膜法测定饮用水中大肠杆菌数目时，可利用鉴别培养基培养后计数

B．用平板划线法和稀释涂布平板法进行微生物计数时，结果往往比实际少

C．用血细胞计数板进行微生物显微计数时，高倍镜下观察不到完整的计数室

D．用已知密度红细胞悬液对待测菌液以比例计数法计数时，两种液体需混合均匀

解析：选B　测定饮用水中大肠杆菌的数目可取一定量的饮用水，之后按一定倍数稀释，再用加入伊红-亚甲蓝的鉴别培养基培养，对深紫色金属光泽菌落进行计数，A正确；平板划线法常用来筛选分离微生物，不用于计数，B错误；用血细胞计数板进行微生物显微计数时，高倍镜下观察不到完整的计数室，C正确；将已知颗粒(如霉菌孢子或红细胞)浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，即可得未知菌液的细胞浓度，D正确。

2．聚羟基脂肪酸酯(PHA)是嗜盐菌合成的一种胞内聚酯，可用于制造“绿色塑料”。从某咸水湖中获得高产PHA菌种的流程：①取样→②接种→③培养→④取单菌落培养→⑤检测PHA产量→⑥获得目标菌。下列叙述错误的是(　 )

A．②可用稀释涂布平板法接种到含PHA较高的选择培养基上

B．②所用培养基应加入琼脂以便挑取单菌落

C．③④要将培养皿倒置放入恒温箱

D．培养基用过后要灭菌处理

解析：选A　由题干信息分析可知，欲获得高产PHA菌种应将菌种在适宜其生长的培养基中培养，A错误；由流程分析可知，筛选出目的菌株，需要形成菌落，故使用固体培养基，即②所用培养基应加入琼脂以便挑取单菌落，B正确；③④要将培养皿倒置放入恒温箱，倒置培养能够防止培养基中的水分过快蒸发，又能防止冷凝形成的水珠落入培养基，C正确；培养基用过后要灭菌处理，防止污染环境或感染实验人员，D正确。

3．如图所示为从土壤中分离、纯化和扩大培养某种微生物的流程图。回答下列问题：

(1)称量土样时，土壤________(填“需要”或“不需要”)进行消毒和灭菌。

(2)进行梯度稀释操作时，若取待稀释菌液1 mL，注入9 mL的无菌水，则该1 mL待稀释菌液被稀释了______倍。

(3)平板浇注法分离指的是将1 mL稀释的样品放于空白的无菌培养皿之后，将冷却到45～50 ℃的培养基倒入，轻摇混匀、凝固，然后放于恒温箱中培养。从土壤中分离酵母菌和醋酸菌时，可以使用平板浇注法的是______，理由是_______________________________

______________________________________________________________。

(4)划线纯化阶段，对图示培养皿进行划线时接种环取菌液________次，该培养皿划线完成时接种环共需进行灼烧灭菌________次。

(5)扩大培养阶段，所用培养基是________(填“液体”或“固体”)培养基。

解析：(1)因为要从土壤中分离相关的微生物，所以不需要对土壤进行消毒和灭菌。(2)若取待稀释菌液1 mL，注入9 mL的无菌水，则菌液相当于被稀释了10倍。(3)平板浇注会使部分菌体埋入培养基中，酵母菌是兼性厌氧型生物，可以在低氧甚至无氧环境下生存繁殖，而醋酸菌是需氧生物，不能在无氧条件下生存，故从土壤中分离酵母菌和醋酸菌时，只有酵母菌可以使用平板浇注法。(4)划线纯化阶段，图中只有一个培养皿，接种环取1次菌液即可，每次接种前后都需对接种环进行一次灼烧灭菌处理，图中共划了5个区，故共灼烧6次。(5)扩大培养常用液体培养基进行培养，以增加微生物的数量。

答案：(1)不需要　(2)10　(3)酵母菌　平板浇注会使部分菌体埋入培养基中，酵母菌是兼性厌氧型生物，可以在低氧甚至无氧环境下生存繁殖　(4)1　6　(5)液体

[微课微练·一点一评]

1．回答下列与细菌培养相关的问题。

(1)在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是________(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是______________________________。硝化细菌在没有碳源的培养基上________(填“能够”或“不能”)生长，原因是______________________________________________。

(2)用平板培养细菌时一般需要将平板________(填“倒置”或“正置”)。

(3)单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是____________________________________________

________________________________________________________________________。

(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过______处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。

解析：(1)蛋白胨中含有碳元素和氮元素，可为细菌生长提供碳源和氮源，葡萄糖只能提供碳源，NaNO3只能提供氮源。不同细菌生长繁殖所需要的最适pH不同，制备培养基时要根据所培养细菌种类的不同来调节pH。硝化细菌是自养生物，可通过化能合成作用利用空气中的CO2合成有机物，所以在没有碳源的培养基上也能生长。(2)用平板培养细菌时，一般将平板倒置，防止皿盖上的水珠落入培养基中造成污染。(3)在一定的培养条件下，不同微生物表现出各自稳定的菌落特征，因此研究人员可根据菌落的形状、大小、颜色等特征初步区分微生物的种类。(4)消毒仅杀死物体表面或内部的部分微生物，灭菌可杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。使用后的培养基丢弃前要进行灭菌处理，防止其中的微生物感染操作者或污染环境。

答案：(1)蛋白胨　不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同　能够　硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源　(2)倒置　(3)在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征

(4)灭菌

2．(2020·全国卷Ⅰ)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。

回答下列问题：

(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是________。甲、乙培养基均属于________培养基。

(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释________倍。

(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是____________________________________(答出1点即可)。

(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：___________

________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即__________________________。

解析：(1)实验过程中，对盛有水或培养基的摇瓶进行灭菌时，常采用高压蒸汽灭菌法。据题图分析可知，乙培养基为固体培养基，与甲培养基相比，其特有的组分Y应是凝固剂琼脂。甲、乙培养基均只允许能利用物质S作为氮源和碳源的微生物生长，因此两培养基均为选择培养基。(2)据题意可知，假设至少将摇瓶M中的菌液稀释X倍，才能保证稀释后的100 μL菌液中细菌细胞数不超过200个，初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，则稀释之前100 μL菌液中有2×106个细菌，可得2×106×(1/X)＝200，则X＝104，因此至少应将摇瓶M中的菌液稀释104倍。(3)在筛选过程中，若培养基中S浓度过高，可能会导致细胞失水，进而抑制菌株的生长。(4)将含有能降解S的细菌的淤泥加入无菌水中，进行适当稀释后，利用稀释涂布平板法，取适量的菌液涂布到乙培养基上，在适宜条件下进行培养，一段时间后，统计菌落数，即可估算出淤泥中能降解S的细菌细胞数。(5)本实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌生长提供的营养物质是水、碳源、氮源和无机盐。

答案：(1)高压蒸汽灭菌　琼脂　选择　(2)104　(3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长　(4)取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数　(5)水、碳源、氮源和无机盐

3．(2022·全国乙卷)化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业，用菌株C可生产S，S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响，结果见表。

回答下列问题。

(1)通常在实验室培养微生物时，需要对所需的玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有__________________________________________________________(答出2点即可)。

(2)由实验结果可知，菌株C生长的最适碳源是______；用菌株C生产S的最适碳源是________。菌株C的生长除需要碳源外，还需要______________________________(答出2点即可)等营养物质。

(3)由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，其原因是____________。

(4)若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路：______________________________________________________

________________________________________________________________________。

(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，其意义是___________________________(答出1点即可)。

解析：(1)玻璃器皿常用的灭菌的方法有干热灭菌、高压蒸汽灭菌等。(2)由实验结果可知，以葡萄糖为碳源时菌株C的细胞干重最大，说明最适于菌株C生长的碳源是葡萄糖；而以制糖废液为碳源时，用菌株C生产S的产量最高，说明最适于生产S的碳源是制糖废液。微生物的生长一般都需要水、碳源、氮源和无机盐，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求，故菌株C的生长除需要碳源外，还需要氮源、无机盐、水等营养物质。(3)分析题图可以看出在以淀粉为碳源的培养基中，菌株C不能生长，原因可能是菌株C中缺少分解淀粉的酶，不能利用淀粉。(4)要测定生产S的最适以制糖废液为碳源的浓度，实验自变量为制糖废液的浓度，可分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较不同浓度制糖废液中的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度，即为生产S的最适碳源浓度。(5)利用制糖废液生产S可以实现废物利用，既有利于减少污染，节省原料，又能降低生产成本。

答案：(1)高压蒸汽灭菌、干热灭菌

(2)葡萄糖　制糖废液　氮源、无机盐、水

(3)缺少淀粉酶　(4)分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较不同浓度制糖废液中的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度即为生产S的最适碳源浓度　(5)减少污染、节省原料、降低生产成本

4．微生物产生的脲酶能够特异性分解尿素，在农业、食品加工业和污水处理中用途广泛。例如，饮料酒在生产过程中会产生少量尿素，酒体呈酸性，厂家常用脲酶分解酒体中的尿素以改善饮料酒的品质。请回答下列问题：

(1)从土壤中筛选产脲酶菌时，所配制的培养基以______为唯一氮源。与固体培养基相比，液体培养基更适于富集培养的原因是_________________________________________

________________________________________________________________________。

(2)在微生物培养过程中，获得纯净培养物的关键是______________________。复筛酸性脲酶菌的培养基为中性固体培养基，以酚红为指示剂，在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌液量不宜过多的原因是____________________________________________________。在挑选时，应选择______________(填“有红色圈的菌落”或“无红色圈的菌落”)。

(3)在纯化该菌时，为了得到单菌落，常用的接种方法有__________________________。为了进行计数，某同学吸取菌液1 mL稀释1 000倍，然后吸取稀释后的菌液0.2 mL，接种于固体培养基上培养。一段时间后观察菌落并计数，实验重复三次，得到三个培养皿中菌落数分别是78、88、74，则该菌的浓度是________个细菌/mL。若需较长时间保存该菌种，可用的方法是____________。

解析：(1)配制以尿素为唯一氮源的培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌。与固体培养基相比，液体培养基与菌体充分接触，菌体繁殖快，更适于富集培养。(2)在微生物培养过程中，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。复筛酸性脲酶菌的培养基为中性固体培养基，以酚红为指示剂，在涂布平板时，菌液过多会使培养基表面的菌悬液出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果，因此滴加到培养基表面的菌液量不宜过多。脲酶将尿素分解为氨，氨使培养基pH升高，酚红变红，因此在挑选时，应选择有红色圈的菌落。(3)在纯化该菌时，为了得到单菌落，常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。为了进行计数，某同学吸取菌液1 mL稀释1 000倍，然后吸取稀释后的菌液0.2 mL，接种于固体培养基上培养。一段时间后观察菌落并计数，实验重复三次，得到三个培养皿中菌落数分别是78、88、74，则该菌的浓度是(78＋88＋74)÷3÷0.2×1 000＝4×105(个细菌/mL)。若需较长时间保存该菌种，可用甘油管藏法。

答案：(1)尿素　培养基与菌体充分接触，菌体繁殖快　(2)防止外来杂菌的入侵　菌液过多会使培养基表面的菌悬液出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果　有红色圈的菌落　(3)平板划线法和稀释涂布平板法　4×105　甘油管藏法

5．反硝化细菌能在无氧环境中将硝酸盐转化为氮气(2NO＋10e－＋12H＋→…→N2O→N2)，在处理工业污水、治理水体富营养化中具有重要作用。科研人员想从一污水处理厂的活性污泥中筛选分离出耐高温(42 ℃)的反硝化细菌(目的菌)，用于提升温度较高的工业污水的脱氮效率，具体流程如图所示(BTB培养基初始pH＝6.8，BTB是酸碱指示剂，酸性条件下为黄色，中性条件下为绿色，碱性条件下为蓝色)：

(1)BTB培养基灭菌后待平板凝固后，应倒置放在超净台上，目的是____________

________________________________________________________________________。

(2)将污泥样品梯度稀释后，使用________(填工具)将样液均匀涂布在BTB培养基上，放在__________环境中培养2～3天后，挑选周围显____色的单菌落在固体培养基上划线分离，获得纯菌株。

(3)将纯菌株接种在液体培养基上培养一段时间，若在培养瓶顶部检测到N2O，即可鉴定为目的菌。不能依据培养液中硝酸盐的浓度变低来鉴定目的菌，原因是_____________

________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(4)为保持纯化后的微生物菌种的纯净，需要对菌种进行保藏。临时保藏的方法具有__________________________________等缺点，它比较适合那些使用频率高的菌种的保藏。

(5)C/N(碳氮含量比)对反硝化效率有一定的影响。科研人员测得不同C/N条件下目的菌对硝酸盐的去除率，结果如图所示：

科研人员提出，在利用目的菌株处理工业污水时，需要适当向污水中投放少量淀粉，据图分析这样做的主要目的是______________________________________________________。

(6)为计数微生物的数量，一位同学在4个平板培养基上分别接种稀释倍数为106的土壤样液0.1 mL，培养后菌落数分别为155、160、176、149个，则每毫升原土壤样液中上述微生物数量为________个。

解析：(1)BTB培养基灭菌后待平板凝固后，应倒置放在超净台上，目的是防止皿盖上的水珠落入培养基，避免培养基中的水分过快的挥发。(2)将污泥样品梯度稀释后，使用涂布器将样液均匀涂布在BTB培养基上，由题干信息可知，反硝化细菌能在无氧环境中将硝酸盐转化为氮气，科研人员欲筛选分离出耐高温(42 ℃)的反硝化细菌，故需要放在无氧、42 ℃环境中培养2～3天，根据反硝化过程的产物可知，反硝化细菌能在无氧环境中将硝酸盐转化为氮气，反应过程中消耗培养基中的H＋，因此会导致菌落周围为弱碱性呈蓝色，应挑选周围显蓝色的单菌落在固体培养基上划线分离，获得纯菌株。(3)不能依据培养液中硝酸盐的浓度变低来鉴定目的菌，这是因为其他微生物也能利用硝酸盐进行代谢，硝酸盐浓度同样会降低。(4)为保持纯化后的微生物菌种的纯净，需要对菌种进行保藏。临时保藏的方法具有保存时间短、容易被污染或产生变异等缺点，它比较适合那些使用频率高的菌种的保藏，若要长期保存菌种，可采用甘油管藏法。(5)由题图信息分析可知，在一定范围内，目的菌株对硝酸盐的去除率随着培养液中的C/N升高而升高，据此推测，用反硝化细菌进行污水处理过程中，有时需要向污水中加入少量淀粉，其主要目的是提高污水中的C/N，以提高目的菌对污水中硝酸盐的去除率。(6)为计数微生物的数量，一位同学在4个平板培养基上分别接种稀释倍数为106的土壤样液0.1 mL，培养后菌落数分别为155、160、176、149个，则每毫升原土壤样液中上述微生物数量为(155＋160＋176＋149)÷4÷0.1×106＝1.6×109(个)。

答案：(1)防止皿盖上的水珠落入培养基，避免培养基中的水分过快的挥发　(2)涂布器　无氧、42 ℃　蓝　(3)其他微生物也能利用硝酸盐进行代谢，硝酸盐浓度同样会降低　(4)保存时间短、容易被污染或产生变异　(5)适当提高污水中的C/N，从而提高目的菌对污水中硝酸盐的去除率　(6)1.6×109