2023届高考生物二轮复习基因工程学案

这是一份2023届高考生物二轮复习基因工程学案，共21页。学案主要包含了网络构建，基础自评，真题解读，命题猜想等内容，欢迎下载使用。
第3讲 基因工程
　自主梳理·再夯基础　



1. (2022·江苏高考仿真模拟调研)科研工作者在盐碱地中找到了一种生长良好且耐盐碱的植物(以下简称植物a)。研究人员发现，植物a的液泡膜上特有一种Na＋/K＋逆向转运蛋白，这种蛋白是植物a耐盐碱的原因，并在植物a中找到控制该蛋白合成的Na＋/K＋逆向转运蛋白基因(TaNHX2基因)。该基因就是研究人员要找的耐盐碱的目的基因。研究人员进一步获得了如下图所示的物质结构。拟利用这些材料，用基因工程技术培育转基因棉花。

含有目的基因的DNA片段


农杆菌Ti质粒结构示意图
注：Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ为三种限制酶，Sau3AⅠ、BamHⅠ切割形成的黏性末端相同。
用基因工程技术培育转基因棉花的操作程序包括四个步骤：
(1) 目的基因的获取：将植物a不同基因的DNA片段导入受体菌的群体中储存，再根据目的基因的特定序列从受体菌中提取该基因，这种获取目的基因的方法称为 。
(2) 构建基因表达载体：计划用EcoRⅠ分别切割上图中DNA片段和上图所示质粒，以构建基因表达载体。
①构建表达载体除限制酶外还需要的工具酶是________；
②本方案的缺陷是：可能导致______________________以及目的基因与质粒的反向连接。
③为避免上述缺陷，最佳方案是用______________切割上图的DNA片段，用____________切割上图质粒。
(3) 将________导入受体细胞。成功导入受体细胞后，还需要利用________技术才能得到转基因棉花幼苗，这一技术的原理是 。
(4) 目的基因的检测与鉴定：要在个体生物学水平上检测耐盐新品种的培育效果，检测方法是 。
2. (2022·南京、盐城一模)研究发现人溶菌酶(hLZ)是天然抗生素替代品。科学家培育出转人溶菌酶基因山羊，以大规模生产人溶菌酶(从乳汁中提取)，过程如下图所示。其中编号①～⑨表示过程；质粒S中的基因Leu通过控制相关酶的合成而影响亮氨酸的合成(亮氨酸是山羊细胞维持生命活动必不可少的一种必需氨基酸)，基因GFP控制合成绿色荧光蛋白。四种限制酶的识别序列及切割位点见下表。请回答下列问题。

限制酶
BamHⅠ
BglⅡ
HindⅢ
XbaⅠ
识别序列和切割位点
G↓GATCC
A↓GATCT
A↓AGCTT
T↓CTAGA

(1) 物质A控制溶菌酶的合成包括转录和翻译两个阶段，涉及的场所主要有______________。
(2) 过程①通过PCR技术扩增物质A，需要的酶是________；过程②需要的限制酶是____________；过程③需要的酶是限制酶和______________。
(3) 为成功筛选出含重组质粒T的成纤维细胞，质粒S中用作标记基因的是________和________。为达到筛选目的，培养基的营养成分中应不含有________。将成纤维细胞培养一段时间后观察，筛选出________(选填“显示”或“不显示”)绿色荧光的细胞用于过程⑤。
(4) 过程④常用________法，过程⑨为________，图中早期胚胎的________(结构)将发育成转基因羊。
　考向引领·核心突破　
核心考点1　考查基因工程的基本理论

高考对该热点的考查形式为选择题或非选择题，主要命题方向：
1. 结合基因工程基本概念的理解及基本操作工具的作用，考查科学思维能力。
2. 联系转基因技术的安全性实例，考查社会责任。

(2014·江苏卷·23)(多选)下列关于基因工程技术的叙述，错误的是(　　)
A. 切割质粒的限制酶均特异性地识别6个核苷酸序列
B. PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应
C. 载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因
D. 抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达
笔记：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

1. 基因工程的三大操作工具


限制性内切核酸酶
DNA连接酶
载体
作用
切割目的基因和载体
拼接DNA片段，形成重组DNA分子
携带目的基因进入受体细胞
作用
特点
识别特定的核苷酸序列；
在特定位点上切割DNA分子
能连接黏性末端和平末端
能在宿主细胞内稳定存在并大量复制；
有一个至多个限制酶切割位点；
具有特殊的标记基因
2. 认识PCR技术
(1) 原理：体外DNA复制。
(2) 需要条件：模板DNA、2种引物、4种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。
(3) 过程：DNA受热(90～95 ℃)变性解旋为单链，冷却(55～60 ℃)后引物与单链相应互补序列结合(复性)，然后在DNA聚合酶作用下延伸(70～75 ℃)合成互补子链。
3. 理解基因表达载体


1. (2022·南通四模)递减 PCR 是常规 PCR 技术的发展，下图表示递减 PCR 各阶段温度及时间控制。相关叙述错误的是(　　)

A. PCR 反应体系中应加入 Taq 酶、模板 DNA 、dNTP、引物、缓冲液等物质
B. 第1阶段的目的是使模板 DNA 充分解旋，减少 DNA 复杂结构对扩增的影响
C. 第2阶段中退火温度较高可减少引物与模板链的非特异性结合，为第 3 阶段提供更多正确的模板
D. 第4阶段 72 ℃下维持 10 min，主要目的是使子链与互补模板链结合形成双螺旋
2. (2022·南京师大附中开学考试)(多选)载体是基因工程中携带外源 DNA 片段(目的基因)进入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。下图是利用细菌生产人胰岛素的基本流程示意图。下列相关叙述正确的是(　　)

A. 重组载体A、重组载体B分别是基因克隆载体和基因表达载体
B. 载体A和载体 B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因
C. 必须把目的基因插入重组载体A 的启动子和终止子之间
D. 培养细菌A和细菌B的培养基在营养成分和功能上没有明显差异
核心考点2　综合考查基因工程的操作流程及应用

高考对该热点的考查形式为非选择题，主要命题方向：
1. 结合基因工程的操作步骤过程图解，考查科学思维能力。
2. 结合科技热点及基因工程的应用实例，考查科学思维和探究能力。

(2021·江苏卷·13)下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略。下列相关叙述错误的是　(　　)

A. 分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有TDNA序列
B. 该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因需转到不同染色体上
C. 若要获得剔除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组
D. 获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异
笔记：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

(2021·江苏卷·23)某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag 标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题。

(1) 目的基因的扩增
①提取真菌细胞________，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。
②为了获得融合tag 标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致____________________。
③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除Taq DNA聚合酶(Taq酶)以外的各成分混合后，加热到80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增。下列叙述正确的有(　　)
A. Taq酶最适催化温度范围为50～60 ℃
B. 与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C. 两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸
D. PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性
(2) 重组质粒的构建
①将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进______________，形成A­m结合体。将A­m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及________酶等，完成质粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A­m仍能被SmaⅠ切开，则SmaⅠ的酶切位点可能在________。
(3) 融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A­m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是________________________________________________________________________。
②若通过抗原—抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag 标签，说明________，后续实验可借助tag 标签进行蛋白M的分离纯化。
笔记：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
(2020·江苏卷·33)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图所示(以EcoRⅠ酶切为例)。请据图回答问题。

(1) 步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种____________酶，它通过识别特定的________切割特定位点。
(2) 步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′羟基与5′磷酸间形成____________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得__________；Taq酶的作用是催化 。
(3) 若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填序号)。


DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
5′－AACTATGCGCTCATGA…GCAATGCGTAGCCTCT－3′
3′－TTGATACGCGAGTACT…CGTTACGCATCGGAGA－5′
PCR引物
①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′
②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′
③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′
④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
(4) 对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是(　　)
A. 5′－AACTATGCG…AGCCCTT－3′
B. 5′－AATTCCATG…CTGAATT－3′
C. 5′－GCAATGCGT…TCGGGAA－3′
D. 5′－TTGATACGC…CGAGTAC－3′
笔记：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
1. 基因组文库与部分基因文库

2. 目的基因导入受体细胞的方法

细胞种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法、基因枪法、
花粉管通道法
显微注射技术
感受态细胞法(Ca2＋处理法)
受体细胞
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
3. 农杆菌转化法的原理
植物受损伤时伤口处分泌物可吸引农杆菌→农杆菌中Ti质粒上的T­DNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上(若将目的基因插入到Ti质粒的T­DNA上，则目的基因将被一起带入)。
4. 目的基因的检测与鉴定


(2022·扬州三模)酵母细胞基因转录需要转录因子，转录因子包括 DNA 结合功能域(DNA­BD)和转录激活结构域(DNA­AD)，两结构域分开时不能激活转录。如果将待测蛋白质 X 与 DNA­BD 融合，蛋白质Y 与 DNA­AD 融合，蛋白质X 和 Y 有相互作用时，两结构域能重新呈现完整转录因子活性，并可激活报告基因的转录，过程如图 1 所示。已知报告基因 LacZ 表达的酶可以将无色化合物 X­gal 水解成蓝色产物。研究人员为了验证蛋白质X 和Y 是否具有相互作用，分别构建不同的酵母表达载体(如图 2 和图 3 所示)，其中 Ampr为氨苄青霉素(抑制细菌细胞壁的形成)抗性基因，HIS3和 TRPI 分别为控制组氨酸和色氨酸合成的基因。请回答下列问题。

图4　巢式PCR的工作原理示意图
(1) 研究小组采用了巢式PCR技术获取蛋白质X和Y基因的编码区序列，技术原理是利用两套PCR引物进行两轮PCR扩增(如图4所示)，首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在DNA进行15～30个循环的扩增；第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物(内引物或巢式引物)进行15～30个循环扩增。相比于常规PCR获得的产物而言，巢式 PCR 获得的产物特异性________(填“强”或“弱”)，原因是_______________________________。
(2) 研究人员的主要技术路线如下表所示，请完善下表：

实验目的
方法步骤要点(部分)
获取X 和Y 基因的编码区序列
巢式PCR 扩增蛋白质Y 编码区序列时需在两个①________(填“内”“外”或“内和外”)引物的 5′端分别添加序列②____________________；为验证目的基因在PCR 扩增时是否发生了基因突变，可对PCR 产物进行③____________。
pLexA­JL和pB42AD
载体的构建
用特定限制酶切割目的基因和载体并连接，连接产物导入大肠杆菌后扩增；为确定质粒构建是否成功，需要抽提两种质粒并酶切，电泳后观察④________________________________________________________________________。
转化酵母细胞
将成功构建的载体通过⑤____________法导入到营养缺陷型酵母菌中，培养基中需添加物质有⑥____________(用下列字母填写)。
a.氨苄青霉素　b．色氨酸　c．亮氨酸　d．X­gal　e．琼脂　f．甲硫氨酸
实验验证
通过观察培养基中⑦____________来验证蛋白质X 和Y 是否具有相互作用。
(3) 酵母双杂交技术在研究和鉴定蛋白质互作方面起着重要的作用。下列选项中适合采用此技术进行研究的有 ________。
A. 在细胞体内检测抗原和抗体能否发生相互作用
B. 判断控制某一性状的两对基因是否能够独立遗传
C. 判断 RNA 聚合酶与某启动子的结合是否具有组织特异性
D. 筛选宿主细胞上能与新冠病毒 S 刺突蛋白特异性结合的受体

第3讲　基因工程
　自主梳理·再夯基础　
【网络构建】
①DNA连接酶　②构建基因表达载体　③基因
④没有的蛋白质
【基础自评】
1. (1) 从基因文库中获取目的基因
(2) ①DNA连接酶　②目的基因和质粒的自我环化　③EcoRⅠ、BamHⅠ　EcoRⅠ、Sau3AⅠ
(3) 目的基因　植物组织培养　细胞的全能性
(4) 将转基因棉花种植在盐碱地，观察其生长状况
解析：(1) 获取目的基因的方法有：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成法，而将植物a不同基因的 DNA 片段导入受体菌的群体中储存，再根据目的基因的特定序列从受体菌中提取该基因，这种获取目的基因的方法称为从基因文库中获取目的基因。
(2) ①构建表达载体除限制酶外还需要的工具酶是DNA连接酶，限制酶用于切割目的基因和质粒载体，DNA连接酶用来连接目的基因和质粒载体；②用EcoRⅠ分别切割图1中 DNA 片段和图2所示质粒，由于只有一种黏性末端，可能导致目的基因和质粒的自我环化以及目的基因与质粒的反向连接。③已知Sau3AⅠ、BamHⅠ切割形成的黏性末端相同，由图可知在目的基因两侧有EcoRⅠ、BamHⅠ的识别位点，在质粒上有Sau3AⅠ、EcoRⅠ的识别位点，故为避免目的基因和质粒的自我环化以及目的基因与质粒的反向连接，最佳方案是用两种限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ切割图1的DNA，用EcoRⅠ、Sau3AⅠ切割图2质粒。
(3) 目的基因成功导入受体细胞后，要想得到转基因棉花苗，还需要利用植物组织培养技术，这一技术的原理是植物细胞的全能性。
(4) 目的基因的检测与鉴定有分子水平检测和个体水平检测，要在个体生物学水平上检测耐盐新品种的培育效果，检测方法是将转基因棉花种植在盐碱地，观察其生长状况。
2. (1) 细胞核和核糖体
(2) Taq 酶　BamHⅠ、Hind Ⅲ　DNA连接酶
(3) 基因Leu　基因GFP　亮氨酸　不显示
(4) 显微注射　胚胎移植　内细胞团
解析：(1) 溶菌酶是蛋白质，蛋白质的合成场所在核糖体，物质A是基因，主要存在于细胞核，故物质A控制溶菌酶的合成包括转录和翻译两个阶段，涉及的场所主要有细胞核和核糖体。(2) 过程①通过PCR技术扩增物质A基因，即完成DNA体外复制，需要的酶是Taq 酶(耐高温的DNA聚合酶)。过程②是获取目的基因，据图分析，B形成的黏性末端GATCC…与BamHⅠ的识别序列一致，黏性末端AGCTT…与HindⅢ的识别序列一致，故物质 B 是用限制酶BamHⅠ、HindⅢ切割的结果。过程③是将目的基因和质粒S用同种限制酶切割，再连接形成重组质粒，需要的酶是DNA连接酶。(3) 为成功筛选出含重组质粒T的成纤维细胞，质粒S中用作标记基因的是基因Leu和基因GFP。据第2问的分析可知，用限制酶BamHⅠ、HindⅢ切割质粒S和目的基因，形成的重组质粒 T是(Leu＋XbaⅠ＋B)，不含有基因GFP，无法控制合成绿色荧光蛋白，而标记基因 Leu 控制合成亮氨酸，为达到筛选目的，培养基的营养成分中应不含有亮氨酸，将成纤维细胞培养一段时间后观察，含重组质粒T的成纤维细胞可以合成亮氨酸而存活，只需要筛选出不显示绿色荧光的细胞用于过程⑤即可。(4) 过程④是将目的基因导入受体细胞，动物常用显微注射法，过程⑨为胚胎移植。图中早期胚胎的内细胞团是发育为胚胎本身的基础细胞，将发育成转基因羊。
　考向引领·核心突破　
核心考点1
【真题解读】
ABC　命题意图：本题意在考查基因工程的基本理论，要求学生能理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系。本题属于中等难度题。
名师点睛：不同的限制酶识别的核苷酸序列的数目不同；PCR中温度的周期性改变是不同反应步骤需要不同的温度，如高温解旋，低温复性，中温延伸；载体质粒通常采用抗生素抗性基因作为标记基因；外源基因导入受体细胞染色体上后未必能正常表达。
【命题猜想】
1. D　解析：PCR 反应体系中应加入 Taq 酶(催化DNA子链的形成)、模板 DNA 、dNTP(原料)、引物、缓冲液等物质，A正确；据图可知，第1阶段是在96℃条件下处理4 min，该阶段的目的是使模板DNA在高温下充分解旋，得到单链DNA，以减少 DNA 复杂结构对扩增的影响，B正确；引物的碱基数量越少，变性时破开的氢键越少，则退火温度越低，但能与引物发生配对的片段就越多，目标DNA获得率越低，故第 2 阶段中退火温度较高可减少引物与模板链的非特异性结合，为第 3 阶段提供更多正确的模板，C正确； 72℃下维持 10 min，主要目的是使引物链延伸，以形成新的脱氧核苷酸链，D错误。
2. AB　解析：重组载体A导入受体菌后随着受体菌的繁殖而扩增，因此是基因克隆载体，而重组载体B导入受体菌后，表达产生胰岛素，因此是基因表达载体，A正确；作为运载体必须要具备的条件有：含有限制酶的切割位点(便于目的基因的插入)、复制原点(便于目的基因的扩增)及标记基因(便于筛选含有目的基因的受体细胞)等，因此载体A和载体B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因，B正确；培养细菌A的目的是扩增目的基因，不需要获得表达产物，因此目的基因不一定要插入重组载体A 的启动子和终止子之间，C错误；培养细菌A的目的是扩增目的基因，培养细菌B的目的是获得胰岛素，因此培养两者的培养基在营养成分和功能上有明显差异，D错误。
核心考点2
【真题解读】
D　命题意图：本题以剔除转基因植物中标记基因操作流程为载体，考查基因工程在生产实践中的应用，要求学生能有效提取图中信息，并结合教材相关知识解决相关问题。本题属于难度较大题。
名师点睛：农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，故分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA序列，进而成功整合到受体细胞染色体上；该方法需要利用农杆菌转化法，在高转化频率的基础上，将目的基因和标记基因整合到染色体上，由图可知，标记基因和目的基因位于细胞中不同的染色体上；通过杂交分离结果可知，经过有性繁殖阶段遗传重组后获得了三种类型细胞，其中包括只含目的基因的、只含标记基因的和既含目的基因又含标记基因的；获得的无筛选标记转基因植株发生了基因重组。
(1) ①RNA　②蛋白M上不含tag 标签
③BC　(2) ①黏性末端碱基配对　DNA连接　②基因m的连接处、基因m的内部　(3) ①受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因可以长成菌落　②融合基因表达(或融合基因正确解码)
命题意图：本题主要考查了基因工程的操作工具和基本步骤中的相关知识，一方面需要学生识别图解，另一方面需要学生对相关知识的系统理解。建议在平时的学习中以基因工程的基本步骤为主线，注重将教材中的知识结合题中信息进行知识迁移能力的培养。本题属于难度较大题。
名师点睛：(1) ①以逆转录获得cDNA的方式，要先从真菌细胞中提取基因m转录出来的mRNA。
②从构建好的重组质粒上看，tag序列位于目的基因下游，若m基因的转录产物mRNA上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，则不会对tag 序列的转录产物继续进行翻译，蛋白M上就不含tag 标签。
③从题干信息可知，“80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增”，故Taq酶最适催化温度范围为94℃左右；PCR 反应的最初加热过程中，样品温度上升到70℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在Taq DNA 聚合酶的作用下延伸，结果会导致引物错配形成的产物的扩增，影响反应的特异性；热启动可减少引物错配形成的产物的扩增，提高反应的特异性； DNA分子复制具有方向性，都是从5′端向3′端延伸； Taq酶没有特异性，与普通的DNA聚合酶相比，Taq酶更耐高温。
(2) ①从图上看，载体A只有一个SamⅠ的酶切位点，故被SamⅠ切开后，载体由环状变为链状DNA，将SamⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载体A与添加同源序列的m的黏性末端碱基互补配对。将A­m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。
②重组质粒中，载体A被SmaⅠ切开的位置已经与基因m相连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的重组质粒A­m仍能被SmaⅠ切开，则SamⅠ的酶切位点可能在基因m的连接处或基因m内部。
(3) ①筛选目的菌株的机理是：导入了质粒A­m的目的菌株由于含有URA3基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而URA3基因缺失型酵母则不能存活。
②若通过抗原—抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag 标签，位于tag 标签上游的基因m应该正常表达，说明融合基因表达(或融合基因正确解码)。
(1) 限制　核苷酸序列　(2) 磷酸二酯键　DNA单链　以DNA为模板的DNA链的延伸　(3) ②④　(4) B
命题意图：本题主要考查PCR的过程和应用，意在强化学生对PCR技术的理解，要求学生能分析题图提取有效信息，从引物碱基序列、延伸方向等方面进行分析和解答，对考生的理解和分析能力提出了较高要求。本题属于难度较大题。
名师点睛：采用PCR技术扩增DNA的过程为变性、退火、延伸、终止，PCR技术扩增目的基因的原理：DNA双链复制，引物是一小段单链DNA，引物5′端的碱基可以与DNA两条链的3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5′→3′。
(1) EcoRⅠ是一种限制酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定的位点。
(2) DNA连接酶可催化相邻核苷酸之间的3′羟基和5′磷酸之间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95 ℃时，DNA受热变性后解旋为单链；Taq酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA链为模板的DNA链的延伸。
(3) 引物是一小段单链DNA，引物5′端的碱基可以与DNA两条链的3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5′→3′，据题图分析，结合已知序列可知，能与片段F左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤Ⅲ选用的PCR引物应当为②④。
(4) 对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoRⅠ剪切的两端，它识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5′端应该是AATTC，3′端是GAATT。
【命题猜想】
(1) 强　如果利用外引物扩增产生了错误片段，再利用内引物扩增在错误片段上进行引物配对并扩增的概率低　(2) ①内　②GAATTC 和 CTCGAG
③DNA 测序　④是否出现预期大小的目标条带　⑤Ca2＋处理(感受态细胞)　⑥def　⑦菌落的颜色(菌落是否呈现蓝色)　(3) AD
解析：(1) 巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片段，第二对引物的功能是特异性地扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段。第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增，从而提高反应的特异性，获得的产物特异性更强，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。
(2) 据图可知，pB42AD中目的基因的两端是GAATTC 和 CTCGAG序列，因此巢式PCR 扩增蛋白质Y 编码区序列时需在两个内引物的5′端分别添加序列GAATTC 和 CTCGAG。PCR 扩增时是否发生了基因突变(判断基因中是否发生碱基对的增添、缺失或者替换)，可对PCR 产物进DNA 测序。观察可知pLexA­JL载体的目的基因插入位点含有的酶切位点对应限制酶分别为EcoRⅠ和BamHⅠ，pB42AD载体的目的基因插入位点含有的酶切位点对应的限制酶分别为EcoRⅠ和 XhoⅠ。构建好基因表达载体后，可以使用DNA电泳，观察电泳结果是否出现预期大小的目标条带，来确定表达载体构建是否成功。将目的基因导入微生物细胞常用的方法为Ca2＋处理法。鉴别培养基属于固体培养基，需要加琼脂，报告基因 LacZ表达的酶可以将无色化合物 X­gal 水解成蓝色产物，报告基因 LacZ是否表达可以通过加入X­gal 后培养基中菌落颜色来鉴定，另外还需要加入氨基酸作为营养物质(不需要加入色氨酸和亮氨酸，本身自己能够合成)，因此培养基中还需要接入X­gal 、琼脂和甲硫氨酸，即def。由于只有当蛋白质X和蛋白质Y相互作用时，转录因子的DNA结合功能减(DNA­BD)和转录激活结构域(DNA­AD)才能发挥作用，进而激活报告基因的启动子，从而驱动对报告其因(LacZ基因)的转录，进而得以表达，报告基因 LacZ 表达的酶可以将无色化合物 X­gal 水解成蓝色产物，因此，可以通过检测菌落的颜色(菌落是否呈现蓝色)来确定蛋白质X 和Y 是否具有相互作用。
(3) 酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质的相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测到。它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。在细胞体内检测抗原和抗体能否发生相互作用和筛选宿主细胞上能与新冠病毒 S 刺突蛋白特异性结合的受体都涉及蛋白质之间关系，判断控制某一性状的两对基因是否能够独立遗传和判断 RNA 聚合酶与某启动子的结合是否具有组织特异性不是蛋白质之间的相互关系，A、D正确，B、C错误。