高中人教版 (2019)二 微生物的选择培养和计数优质课件ppt

1.2.2  微生物的选择培养和计数

考点1：选择培养基及微生物的选择培养

☆精讲

1. 实验室中微生物的筛选，也可以应用同样的原理，即人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他种类微生物生长。在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
2. 选择培养基配方的设计。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3再转化为NO3—、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。

3.由于土壤中细菌的数量庞大，要想得到能分解尿素的细菌的纯培养物，必须要对土样进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上，也就是采用稀释涂布平板法。

4.稀释涂布平板法操作过程如下：采集土样→将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释→取0.1 mL菌液，滴加到培养基表面→将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中→将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布→用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀→涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温箱中培养1～2 d。

5.待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中培养1-2d。在涂布有合适浓度菌液的 平板上就可以观察到分离的单菌落。

☆精练

【例1】下列关于微生物选择培养的叙述，错误的是（       ）

A．选择培养的目的是提高样品中目的微生物的含量

B．选择培养前要对样品进行稀释

C．选择培养时保持振荡，可以让微生物与营养物质充分接触，快速生长繁殖

D．当培养液变混浊时，要更换新鲜的培养液

【例2】在从土壤中分离出分解纤维素的微生物的实验中，先进行选择培养，再进行刚果红染色法筛选。先进行选择培养的目的是（       ）

A．增加纤维素分解菌的浓度 B．除去杂菌，获得能分解纤维素的纯菌种

C．杀灭不需要的微生物 D．在形成的菌落上获得纤维素分解菌种

考点2：微生物的数量测定

☆精讲

1.间接计数法(活菌计数法、稀释涂布平板法)

①原理:当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌,通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。

②计算公式:每克样品中的菌株数=(C÷V)×M,其中,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL),M代表稀释倍数。

③操作:设置对照和重复,增强实验的说服力与准确性。为了保证结果准确，一般选择菌落数为30-300的平板进行计数。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30-300、适于计数的平板。在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。

④缺点：统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。

2.显微镜直接计数法

①原理:利用特定细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下观察、计数，然后再计算一定容积的样品中微生物的数量。

②方法:用计数板计数。

③缺点:不能区分死菌与活菌。

☆精练

【例3】某同学利用稀释涂布平板法进行土壤微生物的数量测定，该同学首先将得到的1mL土壤样液稀释100倍，然后取0．1mL稀释液均匀的涂布在培养基表面，重复3个平板，在适宜条件下培养一段时间后，3个平板上的菌落数分别为70、73和75。下列叙述不正确的是（       ）

A．可得出土壤样液中活菌数大约为7．3×107个/L

B．此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低

C．一般选择菌落数在30-300的平板进行计数

D．显微镜直接计数法统计的都是稀释液中活菌数

【例4】微生物的培养、分离和计数是许多微生物学实验的基本要求，请回答下列与微生物学实验相关的问题：

(1)培养、分离微生物需要培养基，配制培养基的步骤是计算→______→溶化→______→倒平板，溶化后的培养基需冷却至______℃左右时才倒平板。

(2)测定微生物数量可以用显微镜直接计数，该方法不能区分死菌与活菌，统计活菌数常用______________________法，该方法的接种工具是______，该方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，原因是________________________________________________________________

__________________________________________。在统计活菌数时为了证明培养基没有被杂菌污染需设置对照，具体做法是_______________________________________________________

__________________________________________，为避免结果的偶然性，使结果更加准确可靠的办法是__________________________________________________________________，平板中菌落数量太少、太多都不合适，平板中合适的菌落数应该是______________个。

【例5】从自然菌样筛选较理想的生产菌种的一般步骤是：采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定。

（1）不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适合的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养分解纤维素的细菌样应从____________________的环境采集。

（2）富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境条件，同时抑制或阻止其他微生物生长，使其在群落中的数量大大增加，从而分离出所需微生物的培养方法。对纤维素分解菌的富集培养应选择_______________________的培养基，此外，在筛选纤维素的分解菌的过程中则是用____________染色法，培养基中出现以纤维素分解菌为中心的_________。

（3）对分离的菌种还要做进一步的鉴定，如在鉴定分解尿素的细菌时，需在培养基中加入________指示剂，若指示剂变________色，说明有目的菌株存在。

（4）从土壤中分离出分解尿素的细菌后，如需计数，在对样品悬液进行梯度稀释时，未经振荡而直接取上层悬液进行梯度稀释，用不同稀释倍数的样液接种到平板上进行培养和计数，统计出的菌落数往往比正确操作统计出的菌落数______（填偏大、偏小或相等）。

1.2.2  微生物的选择培养和计数

考点1：选择培养基及微生物的选择培养

☆精讲

3. 实验室中微生物的筛选，也可以应用同样的原理，即人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他种类微生物生长。在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
4. 选择培养基配方的设计。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，NH3再转化为NO3—、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源。

3.由于土壤中细菌的数量庞大，要想得到能分解尿素的细菌的纯培养物，必须要对土样进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上，也就是采用稀释涂布平板法。

4.稀释涂布平板法操作过程如下：采集土样→将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释→取0.1 mL菌液，滴加到培养基表面→将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中→将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布→用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀→涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温箱中培养1～2 d。

5.待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中培养1-2d。在涂布有合适浓度菌液的 平板上就可以观察到分离的单菌落。

☆精练

【例1】下列关于微生物选择培养的叙述，错误的是（       ）

A．选择培养的目的是提高样品中目的微生物的含量

B．选择培养前要对样品进行稀释

C．选择培养时保持振荡，可以让微生物与营养物质充分接触，快速生长繁殖

D．当培养液变混浊时，要更换新鲜的培养液

【答案】B

【详解】AB、选择培养的目的是阻止其他微生物的生长，让更多的营养物质充分被目的微生物利用，从而提高样品中目的微生物的含量，选择培养前无需对样品进行稀释，A正确，B错误；

C、选择培养时保持振荡，不仅可以让微生物与营养物质充分接触，还可以增加溶氧量，让微生物快速生长繁殖，C正确；D、随着培养时间延长，培养液中会有微生物代谢废物的积累，导致培养液变混浊，会影响微生物的生长繁殖，因此需要更换新鲜的培养液，D正确。故选B。

【例2】在从土壤中分离出分解纤维素的微生物的实验中，先进行选择培养，再进行刚果红染色法筛选。先进行选择培养的目的是（       ）

A．增加纤维素分解菌的浓度 B．除去杂菌，获得能分解纤维素的纯菌种

C．杀灭不需要的微生物 D．在形成的菌落上获得纤维素分解菌种

【答案】A

【详解】分解纤维素的微生物的分离的基本过程如下：土壤取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落，其中选择培养的目的是增加纤维素分解菌的浓度。故选A。

考点2：微生物的数量测定

☆精讲

1.间接计数法(活菌计数法、稀释涂布平板法)

①原理:当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌,通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。

②计算公式:每克样品中的菌株数=(C÷V)×M,其中,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL),M代表稀释倍数。

③操作:设置对照和重复,增强实验的说服力与准确性。为了保证结果准确，一般选择菌落数为30-300的平板进行计数。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30-300、适于计数的平板。在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。

④缺点：统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。

2.显微镜直接计数法

①原理:利用特定细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下观察、计数，然后再计算一定容积的样品中微生物的数量。

②方法:用计数板计数。

③缺点:不能区分死菌与活菌。

☆精练

【例3】某同学利用稀释涂布平板法进行土壤微生物的数量测定，该同学首先将得到的1mL土壤样液稀释100倍，然后取0．1mL稀释液均匀的涂布在培养基表面，重复3个平板，在适宜条件下培养一段时间后，3个平板上的菌落数分别为70、73和75。下列叙述不正确的是（       ）

A．可得出土壤样液中活菌数大约为7．3×107个/L

B．此方法统计的菌落数往往比实际的活菌数目低

C．一般选择菌落数在30-300的平板进行计数

D．显微镜直接计数法统计的都是稀释液中活菌数

【答案】D

【详解】AC、稀释涂布平板法中，一般选用30～300个菌落数进行计数，故稀释100倍的菌落数分别为70、73和75的每升土壤溶液中的活菌数为（70＋73＋75）÷3÷0.1×1000×100≈7.3×107个，A、C正确；B、由于两个或多个细菌可能形成一个菌落，所以统计的菌落数往往比实际的活菌数目低，B正确；D、显微镜直接计数法统计的都是稀释液中所有个体的数目，包括死菌，D错误。故选D。

【例4】微生物的培养、分离和计数是许多微生物学实验的基本要求，请回答下列与微生物学实验相关的问题：

(1)培养、分离微生物需要培养基，配制培养基的步骤是计算→______→溶化→______→倒平板，溶化后的培养基需冷却至______℃左右时才倒平板。

(2)测定微生物数量可以用显微镜直接计数，该方法不能区分死菌与活菌，统计活菌数常用______________________法，该方法的接种工具是______，该方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，原因是________________________________________________________________

__________________________________________。在统计活菌数时为了证明培养基没有被杂菌污染需设置对照，具体做法是____________________________________________

__________________________________________，为避免结果的偶然性，使结果更加准确可靠的办法是__________________________________________________________________，平板中菌落数量太少、太多都不合适，平板中合适的菌落数应该是______________个。

【答案】(1)称量     灭菌     50     (2)稀释涂布平板     涂布器     当相邻两个或多个细胞连在一起时，平板上只能形成一个菌落     将一个（不接种的）空白培养基放在恒温箱中培养一段时间，若空白培养基不出现菌落就说明培养基没被污染     每个稀释度的菌液接种3个平板，取3个平板的平均菌落数     30~300

【分析】微生物常见的接种方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。(1)在微生物培养中，配制培养基的一般步骤是计算、称量、溶化、（调pH）、灭菌、倒平板，溶化后的培养基需冷却至50℃左右时，不烫手才倒平板。(2)统计活菌数常用稀释涂布平板，又称为活菌计数法。该方法需要借助涂布器，将菌液均匀的涂布到培养基上。但活菌计数法统计的菌落往往比活菌的实际数目低，因为当2个或者多个细胞连在一起是，平板上观察到的只是一个菌落。在统计活菌数时为了证明培养基没有被杂菌污染需设置对照，具体做法是将一个（不接种的）空白培养基放在恒温箱中培养一段时间，若空白培养基不出现菌落就说明培养基没被污染。为避免结果的偶然性，使结果更加准确可靠的办法是利用重复性原则，每个稀释度的菌液接种3个平板，取3个平板的平均菌落数，平板中菌落数量太少、太多都不合适，平板中合适的菌落数应该是30~300个。

【例5】从自然菌样筛选较理想的生产菌种的一般步骤是：采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定。

（1）不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适合的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养分解纤维素的细菌样应从____________________的环境采集。

（2）富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境条件，同时抑制或阻止其他微生物生长，使其在群落中的数量大大增加，从而分离出所需微生物的培养方法。对纤维素分解菌的富集培养应选择_______________________的培养基，此外，在筛选纤维素的分解菌的过程中则是用____________染色法，培养基中出现以纤维素分解菌为中心的_________。

（3）对分离的菌种还要做进一步的鉴定，如在鉴定分解尿素的细菌时，需在培养基中加入________指示剂，若指示剂变________色，说明有目的菌株存在。

（4）从土壤中分离出分解尿素的细菌后，如需计数，在对样品悬液进行梯度稀释时，未经振荡而直接取上层悬液进行梯度稀释，用不同稀释倍数的样液接种到平板上进行培养和计数，统计出的菌落数往往比正确操作统计出的菌落数______（填偏大、偏小或相等）。

【答案】富含纤维素    以纤维素为唯一碳源    刚果红    透明圈    酚红    红    偏大   

【详解】（1）不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适合的环境采集菌样，分解纤维素的细菌在富含纤维素的环境中含量较多，因此培养分解纤维素的细菌样应从富含纤维素的环境采集。（2）纤维素分解菌能够产生纤维素酶从而能利用纤维素，因此对纤维素分解菌的富集培养应选择以纤维素为唯一碳源的培养基。在筛选纤维素分解菌的过程中，可以使用刚果红染色法，该方法的原理是刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，根据透明圈来筛选纤维素分解菌。（3）分解尿素的细菌能合成脲酶，脲酶能催化尿素分解产生氨，氨会使培养基的碱性增强，酚红指示剂在碱性条件下会变成红色，所以在鉴定分解尿素的细菌时，需在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红色，说明有目的菌株存在。（4）若对土壤悬液进行梯度稀释时，未经振荡而直接取上层悬液进行梯度稀释，用不同稀释倍数的样液接种到平板上进行培养和计数，统计出的菌落数往往比正确操作统计出的菌落数偏大，这是因为土壤颗粒密度大，沉降速度相对快一些，而细菌相对就集中在靠上的位置。