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高中生物高考2023年高考生物一轮复习（新人教新高考） 第10单元 第6课时 基因工程的基本工具和基本操作程序课件PPT
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这是一份高中生物高考2023年高考生物一轮复习（新人教新高考） 第10单元 第6课时 基因工程的基本工具和基本操作程序课件PPT，共60页。PPT课件主要包含了考点一，人们的愿望，转基因，生物类型，生物产品，重组DNA，原核生物，特定核苷酸序列，磷酸二酯键，黏性末端等内容，欢迎下载使用。
1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三 种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载 体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行 虚拟PCR实验。
考点一 重组DNA技术的基本工具
考点二 基因工程的基本操作程序
考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定
重温高考 真题演练
重组DNA技术的基本工具
1.基因工程的概念(1)手段：按照 ，通过 等技术，赋予生物新的遗传特性。(2)目的：创造出更符合人们需要的新的 和 。(3)水平： 水平。由于在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又叫作 技术。
梳理归纳 夯实必备知识
2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
(1)源于选择性必修3 P71“旁栏思考”：①原核生物中存在限制酶的意义是什么？
提示 原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
提示 限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)源于选择性必修3 P72“旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶 (填“是”或“不是”)一回事。原因是：①DNA连接酶连接的是 ，而DNA聚合酶是把单个的 连接到已有的DNA片段上。② 起作用时需要以一条DNA链为模板，而 不需要模板。
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶。
考向一 限制酶和DNA连接酶1.(2022·长春市高三期中)下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是
考向突破 强化关键能力
注：Y为C或T，R为A或G。
A.HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端B.Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部C.BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
2.第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是A.构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和 Sau3AⅠ切割目的基因和质粒B.图乙中只用EcRⅠ切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团C.用EcRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连 接产物D.抗原基因在体内表达时不需要解旋酶
考向二 基因工程载体的应用3.质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法正确的是A.质粒不仅存在于细菌中，也存在于某些病毒中B.细菌的基因只存在于质粒上C.质粒为小型环状DNA分子D.质粒是基因工程中的重要工具酶之一
4.下列有关基因工程中载体的说法，正确的是A.在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒B.所有的质粒都可以作为基因工程中的载体C.质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子D.作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记 基因
基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞 或获得预期 等的基因。(2)筛选合适的目的基因①从相关的已知 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。②利用 和序列比对工具进行筛选。(3)目的基因的获取①人工合成 。②常用 特异性地快速扩增目的基因
PCR技术和DNA复制的比较
(1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成 的原料，又可为DNA的合成提供 。(2)引物既可以是DNA单链，也可以为 。细胞内的DNA进行复制时，也需要 ，一般为RNA片段。(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加 。
(4)PCR扩增过程中的循环图示与规律
源于选择性必修3 P77“相关信息”：Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈 ，肠道细胞也无特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因 ，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成及作用
在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号(编码氨基酸)
翻译的结束信号(不编码氨基酸)
启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
3.将目的基因导入受体细胞
(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持__________的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是 。(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入，第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的 上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的 上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入 ，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入 。
(3)农杆菌特点①能在自然条件下侵染 和 ，而对大多数___________没有侵染能力。②农杆菌细胞内含有 ，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
4.目的基因的检测与鉴定
考向一 目的基因的获取5.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述，错误的是A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶B.变性过程中，双链DNA的解开不需要解旋酶C.复性过程中，引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D.延伸过程中，需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸
6.利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引 物b扩增的结果B.引物c和引物b上均含有与模板链不能互 补的碱基C.①过程需要先加热至90 ℃以上后再冷却 至50 ℃左右D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变 产物AD
考向二 基因工程的基本操作程序7.(2022·云南高三联考)戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2基因编码的结构蛋白(pORF2)位于病毒表面，构成病毒的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程如图。下列关于该疫苗的叙述，正确的是A.过程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是 A、U、G、CB.重组基因表达载体上的启动子需来源于戊型肝炎病毒C.过程⑤需要用聚乙二醇处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中 DNA分子的生理状态D.过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定
8.某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题：
(1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是_______；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为_________。该方法中农杆菌的作用是______________________________________________________。
基因插入到烟草细胞的染色体DNA上
(2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用HindⅢ和SalⅠ两种酶的好处是____________________________________________________________________。
基因自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率
(3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？____(填“是”或“否”)。为什么？__________________________________________。
含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏
(4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。
DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定(1)基本原理①原理：利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在 方面的差异，提取DNA，去除其他成分。②DNA的性质：DNA不溶于 ，但某些蛋白质溶于 ；DNA能溶于2 ml·L－1的 。③DNA的鉴定：在一定温度下，DNA遇 试剂会呈现蓝色。
基础提炼 通读实验内容
加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要 ，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)实验基础①PCR原理：利用了 原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动，这个过程就是电泳。③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的 等有关。
(2)PCR实验操作步骤
(3)DNA的电泳鉴定
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行 处理。(2)每吸取一种试剂后，移液器上的 都必须更换。(3)电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越 ，迁移速率越 ，DNA分子的相对分子质量越小，受到的阻力越 ，迁移速率越 。
考向一 DNA的粗提取与鉴定9.下列利用洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是A.将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，要弃去上清液B.采用体积分数为95%酒精溶液析出DNA的方法可去除部分杂质C.用塑料离心管是因为用玻璃离心管容易破损D.将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后振荡，观察颜色 变化
10.下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图。下列相关叙述不正确的是A.选用植物细胞提取DNA时需先 研磨破碎细胞B.图2所示实验操作中有一处明 显错误，可能导致试管2中蓝 色变化不明显C.图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精D.图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 ml/L的NaCl溶液遇二苯胺试 剂出现蓝色
考向二 DNA片段的扩增及电泳鉴定11.利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，下列有关“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的相关叙述，错误的是A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高 压蒸汽灭菌处理B.PCR利用了DNA的热变性原理C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的 枪头都必须更换
12.下列有关电泳的叙述，不正确的是A.电泳是指带电分子在电场的作用下发生迁移的过程B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电 泳中的迁移速率C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
重温高考 真题演练
1.(2019·江苏，10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近B.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂C.预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNAD.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
2.(2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是A.①＋③ B.①＋②C.③＋② D.③＋④
3.(2021·山东，25)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是______，在R末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要____种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是___________________________________________________。
F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
(3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，
据此结果可推测， BCL11A蛋白结合位点位于______________________________________________，理由是_________________________________________________________________________________
F1～ F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
引物F4与F5在调控序
根据有无荧光情况判断，
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
列上所对应序列之间的区段上
一、易错辨析1.限制酶也可以识别和切割RNA( )2.DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来( )连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端( )4.用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物( )5.DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精( )6.在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关( )
二、填空默写1.(选择性必修3 P67)基因工程：___________________________________________________________________________________________________。2.(选择性必修3 P71)限制酶能够识别双链DNA分子的 序列，并且使每一条链中特定部位的 断开。3.(选择性必修3 P72)载体上有特殊的标记基因，便于 。4.(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供 、 、4种 和耐高温的 。
按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋
予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
5.(选择性必修3 P80)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有 等。6.(选择性必修3 P81)转化：_____________________________________________________________。
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内
一、选择题1.若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是
A.用EcRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体B.用BglⅡ和EcRⅠ切割目的基因和P1噬 菌体载体C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬 菌体载体D.用EcRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
2.农杆菌中的Ti质粒是植物基因工程中常用的载体，下列相关叙述正确的是A.Ti质粒是能够自主复制的单链DNAB.Ti质粒中磷酸基团都与两个脱氧核糖相连接C.重组Ti质粒的受体细胞只能是植物愈伤组织细胞D.Ti质粒上的基因可全部整合到受体细胞染色体上
3.利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是A.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基 因的全部序列B.设计引物时需要避免引物之间形成碱基 互补配对而造成引物自连C.复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物D.第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为 15/16
4.(2022·北京高三一模)下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述错误的是
A.应选择的限制酶组合是酶F和酶GB.所选用的受体菌不能含有AmpR和 TetR基因C.用含氨苄青霉素的培养基筛选出 含重组质粒的受体菌D.同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到4个条带
注：AmpR：氨苄青霉素抗性基因，TetR：四环素抗性基因
5.科学家将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin－Ⅱ导入杨树细胞，培育成了抗虫杨树。下图表示含目的基因的DNA分子和农杆菌质粒，图中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，NeR表示新霉素抗性基因，箭头表示识别序列完全不同的4种限制酶的酶切位点。下列叙述不正确的是A.目的基因插入到质粒的T－DNA上，才 能整合到受体细胞染色体中B.为使目的基因与质粒高效重组，最好选 用EcRⅠ和PstⅠC.成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素D.可用PCR等技术或抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否表达
6.(2022·扬州市高三期中)实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是
A.做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA 后再进行扩增C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒D.病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原 理都是抗原—抗体杂交
7.一种双链DNA分子被三种不同的限制酶切割，切割产物通过电泳分离，用大小已知的DNA片段的电泳结果作为分子量标记(下图左边一列)。关于该双链DNA，下列说法错误的是A.呈环状结构B.分子质量大小为10 kbC.有一个NtⅠ和两个EcRⅠ切点D.其NtⅠ切点与EcRⅠ切点的最短距离 为2 kb
8.科学家将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因(抗虫基因)导入棉花的愈伤组织细胞，鉴定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株并无抗虫性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作，下列分析错误的是A.提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若能检测到Bt抗 虫蛋白，则可能是抗虫基因表达效率低B.若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用核酸分子杂交技术检测细胞中的 RNA，若测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是抗虫基因能转录，但不能正常翻译C.若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA，可采用核酸分子杂交技术检测细 胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中D.若经C检测确定细胞中无抗虫基因，则可能只是载体DNA分子导入受体细胞
9.某线性DNA分子含有5 000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列叙述不正确的是
A.a酶与b酶切断的化学键相同B.a酶与b酶切出的黏性末端能相互连接C.仅用b酶切割，则得到2个DNA分子产物D.限制酶将一个DNA分子片段切成两个片段需消耗两个水分子
10.荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当TaqDNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。Ct值(循环阈值)的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。下列说法不正确的是A.检测新冠病毒时，需加入逆转录酶将新冠病毒RNA 转化为cDNAB.PCR每个循环包括变性、复性(引物和模板结合)、延 伸3个阶段C.Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高D.若样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，检测结果可能为阴性
11.某中学生物兴趣小组进行DNA的粗提取与鉴定时，选取如下实验材料：新鲜花椰菜、体积分数为95%的冷酒精、研磨液(含表面活性剂SDS、DNA酶抑制剂EDTA、适量的NaCl)、0.015 ml·L－1的NaCl溶液、二苯胺试剂、蒸馏水以及其他必要实验器材。下列有关选择实验材料的理由，叙述不正确的是A.新鲜的花椰菜DNA含量丰富，易获取B.SDS具有瓦解植物细胞膜的作用C.DNA溶于冷酒精，而蛋白质等杂质不溶D.EDTA可减少提取过程DNA的降解
12.缺乏维生素A容易导致夜盲症或营养不良，甚至能够威胁到生命。而β-胡萝卜素可以在人体内转化成维生素A。科学家尝试通过转基因技术生产富含β-胡萝卜素的大米。八氢番茄红素合酶(其基因用psy表示)和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用crtI表示)参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。根据以上信息分析，下列叙述错误的是A.pmi基因作为标记基因可以鉴别受体细胞中是否含有目的基因B.psy基因和crtI基因的序列中可以含有用到的限制酶的识别序列C.可通过基因枪法将目的基因导入水稻的受体细胞D.PCR技术不能检测目的基因是否表达出相应的蛋白质
二、非选择题13.如图pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素(一种抗生素)抗性基因；mel为黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而三种限制酶SacⅠ、SphⅠ、BglⅡ在pIJ702上分别只有一处识别序列。回答下列问题：
注：“＋”表示生长；“－”表示不生长。
(1)限制酶可以识别双链DNA中特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的___________断裂，切割形成的末端有_________________两种。
(2)以SacⅠ和SphⅠ切取目的基因，与质粒pIJ702上长度为0.4 kb的SacⅠ/SphⅠ片段进行置换，构建重组质粒pZHZ8。上述两种质粒经限制酶BglⅡ酶切后所得片段长度见表1。由此判断目的基因的片段长度为____kb，判定目的基因中含有一个BglⅡ切割位点的理由是___________________________________________________________________________________。
pIJ702上的原有BglⅡ切
割位点被目的基因置换得到的环状pZHZ8，仍能被BglⅡ切割成一条线段
(3)导入目的基因时，首先用Ca2＋处理链霉菌使其成为感受态(能吸收周围环境中DNA分子的生理状态)细胞，再将重组质粒pZHZ8溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下可以促进链霉菌完成_____过程。
(4)不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素的固体培养基上生长状况如表2所示。若要筛选导入pZHZ8的链霉菌细胞，所需硫链丝菌素浓度至少应在___μg/mL以上，挑选成功导入pZHZ8的链霉菌的具体方法是____________________________________________________________________________________________________。若要检测整合到染色体DNA上的目的基因是否发挥功能作用，第一步需检测受体细胞的______(填“DNA”或“RNA”)。
pIJ702的链霉菌菌落呈黑色、导入pZHZ8的链霉菌菌落呈白色的特点，通过观察菌落的颜色进行挑选
14.(2022·济南联考)下图是利用工程菌(大肠杆菌)生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶PstⅠ、EcRⅠ和Hind Ⅲ的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：
(1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有________的因子。过程①所用到的组织细胞是_______________，③过程的目的是_______________________，⑤过程常用_____处理大肠杆菌。
将平末端处理为黏性末端
(2)如果用限制酶PstⅠ、EcRⅠ和HindⅢ对图中质粒进行切割，形成的DNA片段种类有____种，这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有____种和____种。
1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三 种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载 体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行 虚拟PCR实验。
考点一 重组DNA技术的基本工具
考点二 基因工程的基本操作程序
考点三 DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定
重温高考 真题演练
重组DNA技术的基本工具
1.基因工程的概念(1)手段：按照 ，通过 等技术，赋予生物新的遗传特性。(2)目的：创造出更符合人们需要的新的 和 。(3)水平： 水平。由于在DNA分子水平上进行设计和施工，因此又叫作 技术。
梳理归纳 夯实必备知识
2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
(1)源于选择性必修3 P71“旁栏思考”：①原核生物中存在限制酶的意义是什么？
提示 原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
提示 限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)源于选择性必修3 P72“旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶 (填“是”或“不是”)一回事。原因是：①DNA连接酶连接的是 ，而DNA聚合酶是把单个的 连接到已有的DNA片段上。② 起作用时需要以一条DNA链为模板，而 不需要模板。
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶。
考向一 限制酶和DNA连接酶1.(2022·长春市高三期中)下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是
考向突破 强化关键能力
注：Y为C或T，R为A或G。
A.HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端B.Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部C.BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
2.第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是A.构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和 Sau3AⅠ切割目的基因和质粒B.图乙中只用EcRⅠ切割后的质粒，含有2个游离的磷酸基团C.用EcRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连 接产物D.抗原基因在体内表达时不需要解旋酶
考向二 基因工程载体的应用3.质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法正确的是A.质粒不仅存在于细菌中，也存在于某些病毒中B.细菌的基因只存在于质粒上C.质粒为小型环状DNA分子D.质粒是基因工程中的重要工具酶之一
4.下列有关基因工程中载体的说法，正确的是A.在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒B.所有的质粒都可以作为基因工程中的载体C.质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子D.作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记 基因
基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞 或获得预期 等的基因。(2)筛选合适的目的基因①从相关的已知 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。②利用 和序列比对工具进行筛选。(3)目的基因的获取①人工合成 。②常用 特异性地快速扩增目的基因
PCR技术和DNA复制的比较
(1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成 的原料，又可为DNA的合成提供 。(2)引物既可以是DNA单链，也可以为 。细胞内的DNA进行复制时，也需要 ，一般为RNA片段。(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加 。
(4)PCR扩增过程中的循环图示与规律
源于选择性必修3 P77“相关信息”：Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈 ，肠道细胞也无特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。
2.基因表达载体的构建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因 ，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成及作用
在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号(编码氨基酸)
翻译的结束信号(不编码氨基酸)
启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
3.将目的基因导入受体细胞
(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持__________的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是 。(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入，第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的 上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的 上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入 ，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入 。
(3)农杆菌特点①能在自然条件下侵染 和 ，而对大多数___________没有侵染能力。②农杆菌细胞内含有 ，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
4.目的基因的检测与鉴定
考向一 目的基因的获取5.利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述，错误的是A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶B.变性过程中，双链DNA的解开不需要解旋酶C.复性过程中，引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D.延伸过程中，需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸
6.利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引 物b扩增的结果B.引物c和引物b上均含有与模板链不能互 补的碱基C.①过程需要先加热至90 ℃以上后再冷却 至50 ℃左右D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变 产物AD
考向二 基因工程的基本操作程序7.(2022·云南高三联考)戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2基因编码的结构蛋白(pORF2)位于病毒表面，构成病毒的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程如图。下列关于该疫苗的叙述，正确的是A.过程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是 A、U、G、CB.重组基因表达载体上的启动子需来源于戊型肝炎病毒C.过程⑤需要用聚乙二醇处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中 DNA分子的生理状态D.过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定
8.某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题：
(1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是_______；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为_________。该方法中农杆菌的作用是______________________________________________________。
基因插入到烟草细胞的染色体DNA上
(2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用HindⅢ和SalⅠ两种酶的好处是____________________________________________________________________。
基因自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率
(3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？____(填“是”或“否”)。为什么？__________________________________________。
含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏
(4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。
DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定(1)基本原理①原理：利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在 方面的差异，提取DNA，去除其他成分。②DNA的性质：DNA不溶于 ，但某些蛋白质溶于 ；DNA能溶于2 ml·L－1的 。③DNA的鉴定：在一定温度下，DNA遇 试剂会呈现蓝色。
基础提炼 通读实验内容
加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要 ，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)实验基础①PCR原理：利用了 原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷 的电极移动，这个过程就是电泳。③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的 等有关。
(2)PCR实验操作步骤
(3)DNA的电泳鉴定
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行 处理。(2)每吸取一种试剂后，移液器上的 都必须更换。(3)电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越 ，迁移速率越 ，DNA分子的相对分子质量越小，受到的阻力越 ，迁移速率越 。
考向一 DNA的粗提取与鉴定9.下列利用洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是A.将研磨液加入切碎的洋葱，充分研磨后过滤，要弃去上清液B.采用体积分数为95%酒精溶液析出DNA的方法可去除部分杂质C.用塑料离心管是因为用玻璃离心管容易破损D.将白色丝状物溶解在NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后振荡，观察颜色 变化
10.下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图。下列相关叙述不正确的是A.选用植物细胞提取DNA时需先 研磨破碎细胞B.图2所示实验操作中有一处明 显错误，可能导致试管2中蓝 色变化不明显C.图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精D.图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 ml/L的NaCl溶液遇二苯胺试 剂出现蓝色
考向二 DNA片段的扩增及电泳鉴定11.利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，下列有关“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的相关叙述，错误的是A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高 压蒸汽灭菌处理B.PCR利用了DNA的热变性原理C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的 枪头都必须更换
12.下列有关电泳的叙述，不正确的是A.电泳是指带电分子在电场的作用下发生迁移的过程B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电 泳中的迁移速率C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
重温高考 真题演练
1.(2019·江苏，10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近B.DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂C.预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNAD.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
2.(2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是A.①＋③ B.①＋②C.③＋② D.③＋④
3.(2021·山东，25)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是______，在R末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要____种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是___________________________________________________。
F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
(3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，
据此结果可推测， BCL11A蛋白结合位点位于______________________________________________，理由是_________________________________________________________________________________
F1～ F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
引物F4与F5在调控序
根据有无荧光情况判断，
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
列上所对应序列之间的区段上
一、易错辨析1.限制酶也可以识别和切割RNA( )2.DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来( )连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端( )4.用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物( )5.DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精( )6.在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关( )
二、填空默写1.(选择性必修3 P67)基因工程：___________________________________________________________________________________________________。2.(选择性必修3 P71)限制酶能够识别双链DNA分子的 序列，并且使每一条链中特定部位的 断开。3.(选择性必修3 P72)载体上有特殊的标记基因，便于 。4.(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供 、 、4种 和耐高温的 。
按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋
予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
5.(选择性必修3 P80)基因表达载体是载体的一种，除目的基因、标记基因外，还必须含有 等。6.(选择性必修3 P81)转化：_____________________________________________________________。
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内
一、选择题1.若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是
A.用EcRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体B.用BglⅡ和EcRⅠ切割目的基因和P1噬 菌体载体C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬 菌体载体D.用EcRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
2.农杆菌中的Ti质粒是植物基因工程中常用的载体，下列相关叙述正确的是A.Ti质粒是能够自主复制的单链DNAB.Ti质粒中磷酸基团都与两个脱氧核糖相连接C.重组Ti质粒的受体细胞只能是植物愈伤组织细胞D.Ti质粒上的基因可全部整合到受体细胞染色体上
3.利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是A.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基 因的全部序列B.设计引物时需要避免引物之间形成碱基 互补配对而造成引物自连C.复性温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物D.第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为 15/16
4.(2022·北京高三一模)下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述错误的是
A.应选择的限制酶组合是酶F和酶GB.所选用的受体菌不能含有AmpR和 TetR基因C.用含氨苄青霉素的培养基筛选出 含重组质粒的受体菌D.同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到4个条带
注：AmpR：氨苄青霉素抗性基因，TetR：四环素抗性基因
5.科学家将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin－Ⅱ导入杨树细胞，培育成了抗虫杨树。下图表示含目的基因的DNA分子和农杆菌质粒，图中AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，NeR表示新霉素抗性基因，箭头表示识别序列完全不同的4种限制酶的酶切位点。下列叙述不正确的是A.目的基因插入到质粒的T－DNA上，才 能整合到受体细胞染色体中B.为使目的基因与质粒高效重组，最好选 用EcRⅠ和PstⅠC.成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素D.可用PCR等技术或抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否表达
6.(2022·扬州市高三期中)实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是
A.做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA 后再进行扩增C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒D.病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原 理都是抗原—抗体杂交
7.一种双链DNA分子被三种不同的限制酶切割，切割产物通过电泳分离，用大小已知的DNA片段的电泳结果作为分子量标记(下图左边一列)。关于该双链DNA，下列说法错误的是A.呈环状结构B.分子质量大小为10 kbC.有一个NtⅠ和两个EcRⅠ切点D.其NtⅠ切点与EcRⅠ切点的最短距离 为2 kb
8.科学家将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因(抗虫基因)导入棉花的愈伤组织细胞，鉴定后，将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株并无抗虫性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作，下列分析错误的是A.提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若能检测到Bt抗 虫蛋白，则可能是抗虫基因表达效率低B.若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用核酸分子杂交技术检测细胞中的 RNA，若测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是抗虫基因能转录，但不能正常翻译C.若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA，可采用核酸分子杂交技术检测细 胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中D.若经C检测确定细胞中无抗虫基因，则可能只是载体DNA分子导入受体细胞
9.某线性DNA分子含有5 000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列叙述不正确的是
A.a酶与b酶切断的化学键相同B.a酶与b酶切出的黏性末端能相互连接C.仅用b酶切割，则得到2个DNA分子产物D.限制酶将一个DNA分子片段切成两个片段需消耗两个水分子
10.荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当TaqDNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。Ct值(循环阈值)的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。下列说法不正确的是A.检测新冠病毒时，需加入逆转录酶将新冠病毒RNA 转化为cDNAB.PCR每个循环包括变性、复性(引物和模板结合)、延 伸3个阶段C.Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高D.若样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，检测结果可能为阴性
11.某中学生物兴趣小组进行DNA的粗提取与鉴定时，选取如下实验材料：新鲜花椰菜、体积分数为95%的冷酒精、研磨液(含表面活性剂SDS、DNA酶抑制剂EDTA、适量的NaCl)、0.015 ml·L－1的NaCl溶液、二苯胺试剂、蒸馏水以及其他必要实验器材。下列有关选择实验材料的理由，叙述不正确的是A.新鲜的花椰菜DNA含量丰富，易获取B.SDS具有瓦解植物细胞膜的作用C.DNA溶于冷酒精，而蛋白质等杂质不溶D.EDTA可减少提取过程DNA的降解
12.缺乏维生素A容易导致夜盲症或营养不良，甚至能够威胁到生命。而β-胡萝卜素可以在人体内转化成维生素A。科学家尝试通过转基因技术生产富含β-胡萝卜素的大米。八氢番茄红素合酶(其基因用psy表示)和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用crtI表示)参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。根据以上信息分析，下列叙述错误的是A.pmi基因作为标记基因可以鉴别受体细胞中是否含有目的基因B.psy基因和crtI基因的序列中可以含有用到的限制酶的识别序列C.可通过基因枪法将目的基因导入水稻的受体细胞D.PCR技术不能检测目的基因是否表达出相应的蛋白质
二、非选择题13.如图pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素(一种抗生素)抗性基因；mel为黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而三种限制酶SacⅠ、SphⅠ、BglⅡ在pIJ702上分别只有一处识别序列。回答下列问题：
注：“＋”表示生长；“－”表示不生长。
(1)限制酶可以识别双链DNA中特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的___________断裂，切割形成的末端有_________________两种。
(2)以SacⅠ和SphⅠ切取目的基因，与质粒pIJ702上长度为0.4 kb的SacⅠ/SphⅠ片段进行置换，构建重组质粒pZHZ8。上述两种质粒经限制酶BglⅡ酶切后所得片段长度见表1。由此判断目的基因的片段长度为____kb，判定目的基因中含有一个BglⅡ切割位点的理由是___________________________________________________________________________________。
pIJ702上的原有BglⅡ切
割位点被目的基因置换得到的环状pZHZ8，仍能被BglⅡ切割成一条线段
(3)导入目的基因时，首先用Ca2＋处理链霉菌使其成为感受态(能吸收周围环境中DNA分子的生理状态)细胞，再将重组质粒pZHZ8溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下可以促进链霉菌完成_____过程。
(4)不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素的固体培养基上生长状况如表2所示。若要筛选导入pZHZ8的链霉菌细胞，所需硫链丝菌素浓度至少应在___μg/mL以上，挑选成功导入pZHZ8的链霉菌的具体方法是____________________________________________________________________________________________________。若要检测整合到染色体DNA上的目的基因是否发挥功能作用，第一步需检测受体细胞的______(填“DNA”或“RNA”)。
pIJ702的链霉菌菌落呈黑色、导入pZHZ8的链霉菌菌落呈白色的特点，通过观察菌落的颜色进行挑选
14.(2022·济南联考)下图是利用工程菌(大肠杆菌)生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶PstⅠ、EcRⅠ和Hind Ⅲ的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：
(1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有________的因子。过程①所用到的组织细胞是_______________，③过程的目的是_______________________，⑤过程常用_____处理大肠杆菌。
将平末端处理为黏性末端
(2)如果用限制酶PstⅠ、EcRⅠ和HindⅢ对图中质粒进行切割，形成的DNA片段种类有____种，这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有____种和____种。
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