高中生物高考2022年高考生物一轮复习 第10单元 第33讲　基因工程

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第33讲　基因工程
[目标要求]　1.基因工程的诞生。2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)。3.基因工程的应用。4.蛋白质工程。5.实验：DNA的粗提取与鉴定。
考点一　基因工程的操作工具

1．基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。
2．基因工程的基本工具
(1)限制性核酸内切酶

提醒：将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
教材中的隐性知识　源于选修3 P4“寻根问底”
①原核生物中存在限制酶的意义是什么？
提示　原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
提示　限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)DNA连接酶
①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，恢复被限制酶切开的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。

②类型
常用类型
E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
特点
只缝合黏性末端
缝合黏性末端和平末端

教材中的隐性知识　源于选修3 P6“寻根问底”：DNA连接酶和DNA聚合酶不是(填“是”或“不是”)一回事。原因是：①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
(3)载体


(1)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(　×　)
(2)限制酶只能用于切割目的基因(　×　)
(3)限制酶也可以识别和切割RNA(　×　)
(4)DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来(　×　)
(5)E·coli DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(　×　)
(6)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因(　×　)

(1)不同种生物的基因能拼接的理论基础是：①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸；②DNA分子都遵循碱基互补配对原则；③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
(2)外源基因在受体细胞内能表达的理论基础是：①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位；②遗传信息的传递都遵循中心法则；③生物界共用一套遗传密码。

1．与DNA有关的酶的比较
名称
作用部位
作用底物
作用结果
限制酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA切成两个片段
DNA连接酶
磷酸二酯键
DNA片段
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶(Taq酶)
磷酸二酯键
脱氧核苷酸
将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链末端
DNA(水解)酶
磷酸二酯键
DNA
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶
碱基对之间的氢键
DNA
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
RNA聚合酶
磷酸二酯键
核糖核苷酸
将单个核糖核苷酸依次连接到RNA单链末端

2.图解限制酶的选择原则

(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。

考向一　基因工程工具酶的应用
1．某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶(Amy)基因a，通过基因工程的方法，将基因a与载体结合后导入马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在。结合图形分析下列有关这一过程的叙述，正确的是(　　)

A．获取基因a的限制酶的作用部位是图中的①
B．基因工程所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶、质粒
C．连接基因a与载体的DNA连接酶的作用部位是图中的②
D．一种限制酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子
答案　A
2．某质粒载体的结构如图所示。现有BamHⅠ、MboⅠ、PalⅠ三种限制酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓GATCC、↓GATC、GG↓CC。已知目的基因的两端均有后两种限制酶的识别序列。回答下列问题：

(1)从表达载体的组成上看，氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因属于 。通常该结构必须具备的特性有：表达产物对细胞无害、表达产物及产物的功能便于检测、表达产物及产物的功能在受体细胞中本身 (填“不存在”或“已存在”)。
(2)上述三种限制酶中，能切割产生平末端的酶是 ，能切割产生相同黏性末端的酶是
。
(3)若将质粒和目的基因通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，应选用的限制酶是
_______________(填“MboⅠ”或“PalⅠ”)。不选用另一种酶的原因是
。
答案　(1)标记基因　不存在　(2)PalⅠ　BamHⅠ、MboⅠ　(3)PalⅠ　若用MboⅠ处理会破坏质粒中的两个标记基因，不利于重组质粒的鉴定与选择
考向二　基因工程载体的应用
3．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法正确的是(　　)
A．质粒不仅存在于细菌中，也存在于某些病毒中
B．细菌的基因只存在于质粒上
C．质粒为小型环状DNA分子，存在于细菌拟核DNA之外的细胞质中
D．质粒是基因工程中的重要工具酶之一
答案　C
4．下列有关基因工程中载体的说法，正确的是(　　)
A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体
C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子
D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
答案　D
解析　在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；具有一至多个限制酶切点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，B错误；质粒是一种独立于细菌拟核DNA外的环状DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因，而且能在受体细胞中复制并稳定保存，D正确。
考点二　基因工程的基本操作程序

1．目的基因的获取
(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
(2)获取目的基因的方法
①从基因文库中获取

③用化学方法直接人工合成
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成及作用

(3)构建过程

3．将目的基因导入受体细胞
生物种类
植物
动物
微生物
常用方法
农杆菌转化法
显微注射法
感受态细胞法
(用Ca2＋处理)
受体细胞
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到植物细胞的染色体的DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→胚胎移植→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子

4.目的基因的检测与鉴定


(1)目的基因就是指编码蛋白质的基因(　×　)
(2)用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物(　√　)
(3)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列(　√　)
(4)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达(　√　)
(5)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完成表达
(　×　)

(源于选修3 P11图1－10)据图回答问题：

构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。一个基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子及标记基因等。图中抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。

1．几种获取目的基因方法的比较
项目
从基因文库中获取
人工合成
方法
从基因组文库中获取
从cDNA文库中获取
化学合成法
反转录法
过
程
供体细胞中的DNA
↓限制酶
许多DNA片段
↓插入
载体
↓导入
受体菌群(基因组文库)
↓
外源DNA扩增，产生特定性状
↓分离
目的基因
目的基因的
mRNA
↓反转录
单链DNA
↓合成
双链DNA
↓插入
载体
↓导入
受体菌群
(cDNA文库)
↓分离
目的基因
蛋白质的氨
基酸序列
↓推测
mRNA的核
苷酸序列
↓推测
基因的核苷
酸序列
↓化学合成
目的基因
目的基因的mRN A
↓反转录
单链DNA
↓合成
双链DNA
(即目的
基因)
说
明
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库，包括基因组文库和cDNA文库
适用于片段较小，核苷酸序列已知的目的基因；利用DNA合成仪合成
以RNA为模板，需要逆转录酶

2.PCR技术相关分析
(1)PCR技术的过程

关于引物的2点提醒：①引物是一小段单链的DNA或RNA，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端；②只有通过引物，DNA才可以开始进行复制。
(2)PCR技术和DNA复制的比较

3．基因表达载体构建过程

若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：目的基因与目的基因的连接、目的基因与质粒的连接、质粒与质粒的连接，需筛选出重组质粒。

考向一　目的基因的获取途径
5．如图表示基因工程中获取目的基因的示意图，下列相关叙述不正确的是(　　)

A．③表示PCR技术，用来扩增目的基因
B．若获取的目的基因相同，则图中基因组文库小于cDNA文库
C．要从基因文库中得到所需的目的基因可以根据目的基因的相关信息来获取
D．若基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过化学方法直接人工合成获取
答案　B
6．(2019·全国Ⅰ，38)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题：
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括______________和 。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是 。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是 。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的 。
(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是
。
答案　(1)基因组文库　cDNA文库
(2)解旋酶　加热至90～95 ℃　氢键
(3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
解析　(2)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至90～95 ℃进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。(3)在PCR过程中，要加热至90～95 ℃，所以使用热稳定性高的Taq酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。
考向二　基因工程的基本操作程序
7．土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T－DNA片段转入植物细胞的基因组中。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述正确的是(　　)
A．目的基因应插入T－DNA片段外，以防止破坏T－DNA
B．用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞
C．Ti质粒是一种环状DNA分子，属于细菌的拟核DNA
D．T－DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物细胞的染色体上
答案　D
解析　目的基因应插入T－DNA片段上，通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞；若受体细胞为微生物，常采用Ca2＋处理，使微生物细胞成为感受态细胞；Ti质粒分布在细菌拟核DNA之外；T－DNA有助于外源DNA片段整合到植物细胞的染色体上。
8．(2017·全国Ⅲ，38)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。

回答下列问题：
(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是
。
(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为 ，加入了 作为合成DNA的原料。
(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。
①由图2可知：当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是 。
细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是 。
②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少 (填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
答案　(1)编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子　(2)模板　四种游离的脱氧核苷酸　(3)①进行细胞传代培养　维持培养箱中的pH　②C
解析　(1)因为编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子，因此所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙。
(2)PCR技术扩增目的基因的条件需要：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。序列甲作为模板DNA，DNA的原料为四种游离的脱氧核苷酸。
(3)①动物细胞可以通过细胞培养(传代培养)继续增殖。细胞培养过程中，需要气体环境，其中气体CO2的作用是维持培养箱中的pH。②分析坐标图：对比甲和乙蛋白刺激T淋巴细胞增殖情况发现：最终效果相当，只是增殖时间不同，可以推断出A、E片段编码的肽段不会降低T淋巴细胞增殖效果。将丙蛋白分别与甲和乙蛋白刺激T淋巴细胞增殖情况比较发现：丙蛋白降低了T淋巴细胞增殖。丙序列与甲和乙序列相比较，缺少了C片段，也就是说若缺少C片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
9．据报道，美国科研人员通过基因转移技术，从根本上治愈了实验小鼠所患的Ⅰ型糖尿病。这种技术把选定的X基因导入胰腺，这些基因随后得到整合并促使消化系统和其他类型的细胞制造胰岛素。请回答下列问题：
(1)在基因工程中，X基因称为 。利用PCR技术扩增X基因时，需要在反应体系中添加的有机物质是 、 、4种脱氧核糖核苷酸和热稳定DNA聚合酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。
(2)将X基因导入小鼠体内之前，需要操作的核心步骤是 ，此步骤最常用的运载工具是 ，所需要的酶是限制酶和 。
(3)X基因的检测可从分子水平和个体水平两方面进行，在分子水平上通常采用 技术检测X基因是否导入受体细胞，在个体水平上应检测
。
答案　(1)目的基因　引物　模板DNA　(2)基因表达载体的构建　质粒　DNA连接酶　(3)DNA分子杂交　实验小鼠所患的Ⅰ型糖尿病是否被根治




考点三　基因工程的应用和蛋白质工程

1．基因工程的应用
表现方面
具体内容
植物基因工程
①抗虫转基因植物；
②抗病转基因植物；
③抗逆转基因植物；
④利用转基因改良植物品质和利用植物生产药物
动物基因工程
①提高动物生长速度从而提高产品产量；
②用于改善畜产品的品质；
③用转基因动物生产药物，如乳腺生物反应器；
④用转基因动物作器官移植的供体
基因工程药物
控制药品合成的相应基因
基因治疗
①体外基因治疗；
②体内基因治疗

特别提醒　(1)青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程产生的。
(2)动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体。
(3)原核生物的基因(如抗虫基因)可以作为真核生物(棉花)的目的基因。
(4)Bt毒蛋白基因产生的Bt毒蛋白只在某些昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也无特异性受体，因此，Bt毒蛋白不会对人畜产生危害。
2．蛋白质工程
(1)概念
①基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
②手段：基因修饰或基因合成。
③结果：对现有蛋白质进行改造或制造出新的蛋白质。
(2)流程图

A．转录、B.翻译、C.分子设计、D.多肽链、E.预期功能。
教材中的隐性知识　源于选修3 P26“旁栏问题”：对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？原因是什么？
提示　应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造。主要原因有：①蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；②改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传。

(1)转基因抗病农作物不需要使用农药(　×　)
(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中(　×　)
(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用(　×　)
(4)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质(　√　)
(5)蛋白质工程可以合成自然界中不存在的蛋白质(　√　)
(6)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构(　×　)

(源于选修3 P17“正文”)从某些生物中分离出具有杀虫活性的基因，将其导入作物中，使其具有抗虫性，已成为防治作物虫害的发展趋势。据此回答问题：
(1)用于杀虫的基因主要是Bt毒蛋白的基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制基因、植物凝集素基因等。
(2)转基因抗虫棉抗虫的原理是Bt毒蛋白在昆虫肠道内被分解成相对分子质量比较小的、有毒的多肽，与肠上皮细胞特异性受体结合，会导致细胞膜穿孔，最后造成昆虫死亡。
(3)抗虫转基因植物的种植优势表现在减少使用化学农药造成的环境污染，减轻使用化学农药对人类健康的损害，降低生产成本等。

1．动物反应器
(1)外源基因：药用蛋白基因。
(2)表达条件：药用蛋白基因＋乳腺蛋白基因的启动子等。
(3)受体生物——牛、山羊等动物。
(4)种类：乳腺生物反应器和膀胱反应器。
2．工程菌
(1)概念：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。
(2)外源基因：控制合成抗体、疫苗、激素等的基因。
(3)受体细胞：微生物细胞。
(4)特点：细菌内没有内质网、高尔基体等，产生的药物可能没有活性。
(5)药物提取：从微生物细胞中提取。
3．体外基因治疗与体内基因治疗的比较
　　方法
比较　　
体外基因治疗
体内基因治疗
不
同点
途径
从患者体内获取某种细胞→体外完成基因转移→筛选、细胞扩增→输入体内
直接向患者体内组织细胞中转移基因
特点
操作复杂，但效果可靠
方法较简单，但效果难以控制
相同点
都是将外源基因导入靶细胞，以纠正缺陷基因，目前两种方法都处于临床试验阶段

4.蛋白质工程与基因工程的比较
项目
蛋白质工程
基因工程
区别
原理
中心法则的逆推、中心法则
基因重组
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达)
结果
可生产自然界没有的蛋白质
生产自然界已有的蛋白质
联系
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程，对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现；②基因工程所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造


考向一　基因工程的应用
10．红细胞生成素(EPO)是体内促进红细胞生成的一种激素物质，是当今最成功的基因工程药物，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，目前临床使用的红细胞生成素主要来自基因工程技术生产的重组人红细胞生成素(rhEPO)。其简要生产流程如图，下列相关叙述正确的是(　　)

A．过程①用到的工具酶有DNA聚合酶、限制酶和DNA连接酶
B．构建的重组表达载体中终止子的作用是终止翻译过程
C．检测重组细胞是否表达出rhEPO常用抗原—抗体杂交技术
D．用乳腺生物反应器生产EPO可将人EPO基因导入哺乳动物体细胞获得
答案　C
解析　过程①构建基因的表达载体，需用限制酶切割目的基因和载体，并用DNA连接酶连接，该过程无需DNA聚合酶参与，A错误；终止子的作用是终止转录过程，B错误；检测重组细胞是否表达出rhEPO，可利用抗原—抗体特异性结合的原理，采用抗原—抗体杂交技术检测，C正确；采用细胞培养生产EPO成本比较高，可以采用乳腺生物反应器，将基因表达载体转入雌性哺乳动物受精卵中，使EPO基因在转基因动物的乳腺细胞中表达，通过分泌的乳汁来生产EPO，目前还不能直接用高度分化的体细胞克隆哺乳动物，D错误。
11．甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为了改善黄瓜的品质，科学家采用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞，得到了转基因植株。回答下列问题：
(1)用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜 (填“受伤的”或“完好的”)叶片与含重组质粒的农杆菌共同培养，选用这种叶片的理由是
。
(2)若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中的 已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1∶1，则说明甜蛋白基因已经整合到 (填“核基因组”“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”)中。
(3)假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用
作为外植体进行组织培养。
(4)通常，基因工程操作主要有4个步骤，即目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为
。
答案　(1)受伤的　叶片伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，可吸引农杆菌移向这些细胞　(2)甜蛋白基因　核基因组　(3)茎尖　(4)按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
解析　(1)农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。所以选择受伤的黄瓜叶片与含重组质粒的农杆菌共同培养。(2)甜蛋白基因是目的基因，若在转基因黄瓜中检测到该甜蛋白，表明该重组质粒中的甜蛋白基因已转移至植物细胞中且能够表达；非转基因植株无甜蛋白基因，用OO表示，与转基因黄瓜(用AO表示)的某一植株杂交，子代含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1∶1，说明转基因黄瓜是杂合子，且甜蛋白基因整合到核基因组中。(3)植物分生区附近(如茎尖)的病毒含量少，甚至无病毒，利用其作为外植体进行组织培养，可获得脱毒苗。
12．(2018·天津，10)甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。
(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用 技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的 ，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。
(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与__________连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的 进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。
(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加___________的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是 (单选)。
A．病毒的DNA聚合酶 B．宿主的DNA聚合酶
C．病毒的RNA聚合酶 D．宿主的RNA聚合酶
(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起 免疫，增强免疫保护效果。
答案　(1)PCR　多肽(或蛋白质)　(2)载体　总RNA　(3)非天然氨基酸(Uaa)　D　(4)细胞
解析　(1)体外进行DNA扩增采用的技术手段是多聚酶链式反应(PCR技术)。将基因内个别编码氨基酸的序列改造成编码终止密码的序列后，在翻译时终止密码提前出现，不能合成完整长度的多肽(或蛋白质)。
(2)为了使目的基因能够在受体细胞中稳定存在并正常表达，需要将目的基因与载体连接后导入受体细胞。利用分子杂交技术鉴定，筛选获得成功表达目的RNA的细胞时，需提取宿主细胞的总RNA。
(3)将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，宿主细胞内由于没有Uaa，翻译将会在终止密码处停止，将不能翻译出改造病毒基因的完整蛋白，所以要想翻译出完整蛋白，需要在培养基中加入Uaa。转录时，识别启动子的酶为RNA聚合酶，因为转录在宿主细胞中进行，所以转录用的酶为宿主细胞的RNA聚合酶。
(4)不具有侵染性的灭活病毒不能进入人体细胞内，只会引发体液免疫，而减毒的活疫苗虽然不能在人体细胞内正常增殖，但可以侵入人体细胞，能引起人体产生细胞免疫，增强免疫保护效果。
考向二　蛋白质工程
13．某生物中发现一种基因的表达产物是具有较强抗菌性和溶血性的多肽P1，科研人员预期在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的蛋白质药物，下一步要做的是(　　)
A．合成编码多肽P1的DNA片段
B．构建含目的肽DNA片段的表达载体
C．设计抗菌性强但溶血性弱的蛋白质结构
D．利用抗原—抗体杂交的方法对表达产物进行检测
答案　C
14．干扰素可以用于治疗病毒感染和癌症，但在体外保存相当困难。如果将其分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，那么，在－70 ℃条件下可以保存半年，这需要利用蛋白质工程来完成。请回答下列问题：
(1)天然蛋白质的合成过程是按照 进行的，而蛋白质工程与之相反。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过 ，对现有蛋白质进行改造，或制造新的一种蛋白质，以满足人类生产和生活的需要。
(2)若将干扰素的一个半胱氨酸变成丝氨酸，推测相应的脱氧核苷酸序列 (填“是”或“不是”)唯一的。可利用PCR技术扩增相应基因，该技术的前提是要有一段 ，以便根据这一序列合成引物。
(3)科学家在基因工程和蛋白质工程中常用大肠杆菌作为受体细胞，原因是其
(答出两点即可)。
大肠杆菌常用的转化方法：首先用 处理后成为 细胞，再与重组表达载体混合于缓冲溶液中完成转化。
(4)干扰素基因是否翻译出蛋白质，可用 (填物质)进行检测。
答案　(1)中心法则　基因修饰或基因合成(缺一不可)　(2)不是　已知目的基因的核苷酸序列　(3)繁殖快，为单细胞，遗传物质相对较少　Ca2＋　感受态　(4)(干扰素)抗体
解析　(2)由于丝氨酸对应的密码子有四个，若将干扰素的一个半胱氨酸变成丝氨酸，相应的脱氧核苷酸序列不唯一，可利用PCR技术扩增相应基因，该技术需要引物，要根据已知目的基因的核苷酸序列合成引物。(4)可用抗原—抗体杂交法来检测干扰素基因是否翻译出蛋白质。
考点四　DNA的粗提取与鉴定

1．基本原理
(1)DNA的粗提取
①原理：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
②DNA与蛋白质在物理和化学性质方面的差异
比较项目
DNA
蛋白质
溶
解
性
2 mol·L－1
NaCl溶液中

溶解
析出
0.14 mol·L－1
NaCl溶液中
析出
溶解
酒精溶液中
析出
溶解
耐
受
性
蛋白酶
无影响
水解
高温
80 ℃以上变性
不能忍受60～80 ℃的高温

(2)DNA的鉴定：DNA＋二苯胺蓝色。
2．操作流程


(1)提取DNA时，如果没有鸡血材料，可用猪血代替(　×　)
(2)进行DNA的粗提取与鉴定实验时，加入洗涤剂后用力进行快速、充分地研磨(　×　)
(3)洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度(　×　)
(4)在溶有DNA的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色(　×　)
(5)在DNA的粗提取与鉴定实验中，用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同
(　×　)
(6)实验中两次使用蒸馏水的目的不同(　√　)


(源于选修1 P55～56)下图为“DNA粗提取与鉴定”实验的相关操作，请仔细观察并分析①～④操作的目的分别是什么？


①使鸡血细胞吸水涨破释放出核物质；
②析出DNA，除去溶于酒精的杂质；
③使DNA溶解在2 mol·L－1NaCl溶液中；
④稀释NaCl溶液使其浓度接近0.14 mol·L－1，除去溶于浓度为0.14 mol·L－1NaCl溶液的杂质。

1．DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”
实验操作
实验操作的目的
加蒸馏水2次
①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破；②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度稀释到0.14 mol/L，使DNA析出
用纱布过滤4次
①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；②过滤用2 mol/L的NaCl溶液充分溶解的DNA，滤去溶液中的杂质；③滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
用NaCl溶液4次
①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA

2.注意事项
(1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。
(2)加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
(3)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
(4)提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
(5)在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95%的酒精溶液的作用是溶解杂质和析出DNA。

考向一　DNA的粗提取
15．下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验原理的叙述，正确的是(　　)
A．利用DNA能溶于酒精溶液，而蛋白质不溶于酒精溶液的特点，可将DNA与蛋白质分离
B．利用85 ℃的高温能使蛋白质变性却对DNA没有影响的特性，将DNA与蛋白质分离
C．利用DNA在2 mol·L－1NaCl溶液中溶解度最大的特点，可将DNA与杂质分离
D．在DNA滤液中加入嫩肉粉，通过木瓜蛋白酶的作用，可将DNA与蛋白质分离
答案　D
16．某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动，具体步骤如下：
材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g，剪碎后分成两组，一组置于20 ℃条件下、另一组置于－20 ℃条件下，分别保存24 h。
DNA的粗提取：
第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入15 mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。
第二步：先向6只小烧杯中分别注入10 mL滤液，再加入20 mL体积分数为95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。
第三步：取6支试管，分别加入等量的2 mol·L－1的NaCl溶液溶解上述絮状物。
DNA的鉴定：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表。
材料保存温度
花菜
辣椒
蒜黄
20 ℃
＋＋
＋
＋＋＋
－20 ℃
＋＋＋
＋＋
＋＋＋＋

注：“＋”越多表示蓝色越深。
分析上述实验过程，回答下列问题：
(1)该探究性实验的课题名称是
。
(2)第二步中“缓缓地”搅拌，这是为了减少
。
(3)根据实验结果，得出结论并分析。
①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，DNA的提取量较多。
结论2： 。
②针对结论1，请提出合理的解释：
。
(4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。为了进一步提高DNA纯度，依据氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是
，然后用体积分数为95%的冷酒精溶液使DNA析出。
答案　(1)探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响　(2)DNA断裂　(3)①等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄中提取的DNA量最多　②低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢　(4)将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液
解析　(1)从表格可以看出，该实验有两个自变量：材料和温度，所以该探究性实验的课题名称为“探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响”。低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢，提取的DNA量较多。(2)第二步中用玻璃棒搅拌的目的是获取DNA絮状物，所以若搅拌速度快，易造成DNA断裂。(3)本实验的结论可从两个方面来考虑：①相同材料在不同保存温度下的结论；②不同材料在相同保存温度下的结论。(4)氯仿能使蛋白质变性，而对DNA影响极小，所以可将第三步获得的溶液与氯仿混合，又因氯仿密度大于水，所以蛋白质沉淀位于溶液下部，DNA位于上清液中。
考向二　DNA分子的鉴定
17．实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
试管
序号
A
B
1
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
2
不加
加入提取的DNA丝状物并搅拌
3
加4 mL二苯胺试剂，混匀
加4 mL二苯胺试剂，混匀
4
沸水浴5 min
沸水浴5 min
实验现象


实验结论



(1)根据上图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？
。
(3)在沸水浴中加热的目的是 ，同时说明DNA对高温有较强的 。
(4)A试管在实验中的作用是 。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与 有关。
答案　(1)溶液不变蓝色　溶液逐渐变蓝色　DNA在沸水浴的情况下与二苯胺反应呈现蓝色　(2)溶液颜色基本不变　(3)加快颜色反应速度　耐受性　(4)对照　(5)加入试管中的DNA(丝状物)的多少
解析　与A试管相比，B试管中含DNA丝状物，其他条件均完全相同，A、B两试管形成对照。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。




1．核心概念
(1)(选修3 P1)基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(2)(选修3 P6)质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。
(3)(选修3 P9)目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
(4)(选修3 P12)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
(5)(选修3 P23)基因治疗：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，是治疗遗传病的最有效手段。

2．教材结论性语句
(1)(选修3 P4)实现基因工程操作过程至少需要三种工具，即准确切割DNA的“手术刀”、将DNA片段再连接起来的“缝合针”、将体外重组好的DNA导入受体细胞的“运输工具”。
(2)(选修3 P5)当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。
(3)(选修3 P5～6)E·coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。而T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。
(4)(选修3 P8～14)获取目的基因是实施基因工程的第一步；基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心；将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步；目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传持性，只有通过检测与鉴定才能知道，这是基因工程的第四步工作。
(5)(选修3 P11)一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。
(6)(选修3 P26)基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。
(7)(选修3 P27)蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。

1．(2020·浙江7月选考，24)下列关于基因工程的叙述，正确的是(　　)
A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D．已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带，用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
答案　D
解析　基因工程中，若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶(简称限制酶)，重组质粒进入大肠杆菌体内后，该限制酶可以切割重组质粒，使重组质粒不能保持结构稳定，A项错误；将抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐，若抗除草剂基因转入到抗盐基因的编码区，破坏了抗盐基因，则会出现由抗盐到不抗盐的改变，可说明抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入有关，B项错误；抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂，则前者应表达了抗性蛋白，而后者可能表达了抗性基因RNA但不能进行翻译过程，也可能没有表达出抗性基因RNA，C项错误；已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带，用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现几条带则表明该质粒上一定至少有几个被酶切开的位置，注意若完全酶切链状DNA后，出现3条带，则表明该链状DNA上一定至少有2个被酶切开的位置，D项正确。
2．(2019·江苏，10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是(　　)
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
答案　A
解析　哺乳动物(如兔)成熟的红细胞中无细胞核和众多细胞器，不能提取到DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要轻柔且沿着一个方向，B正确；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精溶液，预冷的酒精溶液可用来进一步纯化粗提的DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色，因此，用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热，D正确。
3．(2020·天津，11)阅读下列材料，回答下题。
在应用基因工程改变生物遗传特性，进而利用种间关系进行生物防治方面，中国科学家取得了许多重要进展。
资料一　人类使用化学农药防治害虫，致使环境不断恶化。王成树等从黄肥尾蝎中克隆出一种神经毒素基因AalT，将其导入能寄生在许多害虫体内的绿僵菌中，增强绿僵菌致死害虫的效应，可有效控制虫害大规模爆发。
资料二　小麦赤霉病是世界范围内极具毁灭性的农业真菌病害。王宏伟、孔令让等从长穗偃麦草中克隆出抗赤霉病主效基因Fhb7。将Fhb7导入小麦，其表达产物可减轻赤霉菌对小麦的感染，从而避免小麦赤霉病大规模爆发。
资料三　疟疾由受疟原虫感染的雌按蚊通过叮咬在人群中传播。王四宝等从几种微生物中克隆出5种不同抗疟机制的基因，将它们导入按蚊的肠道共生菌AS1中。在按蚊肠道内，AS1工程菌分泌的基因表达产物可杀灭疟原虫。因AS1可在按蚊亲代和子代种群中扩散，所以在含AS1工程菌按蚊的群落中，疟疾传播一般可被阻断。
目的基因是基因工程的关键要素。关于上述资料中涉及的目的基因，下列分析正确的是(　　)
A．来源：必须从动物、植物或微生物的基因组文库中直接获取
B．作用：上述基因表达产物一定影响防治对象的生长或存活
C．转化：均可采用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞
D．应用：只有将目的基因导入防治对象才能达到生物防治目的
答案　B
解析　资料一、二、三中的目的基因都是科学家从生物体内直接分离并克隆的，并非从动物、植物或微生物的基因组文库中直接获取，A项错误；资料一中，基因表达产物能有效控制虫害大规模爆发，资料二中，基因表达产物能避免小麦赤霉病大规模爆发，资料三中，基因表达产物可杀灭疟原虫，阻断疟疾的传播，说明上述基因表达产物一定影响防治对象的生长或存活，B项正确；资料一中将神经毒素基因AalT导入绿僵菌中，资料三中将5种不同抗疟机制的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中，受体细胞均是细菌，将目的基因导入微生物细胞常采用感受态细胞法；资料二中将抗赤霉病主效基因Fhb7导入小麦，小麦属于单子叶植物，农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力，因此将目的基因导入小麦细胞不可采用农杆菌转化法，而是采用基因枪法，基因枪法是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，C项错误；在资料一中将神经毒素基因AalT导入绿僵菌中防治害虫，资料三中将5种不同抗疟机制的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中杀灭疟原虫，两者均未直接导入防治对象中，D项错误。
4．(2020·山东，25)水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因(Wx基因)启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
(1)将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是
，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为 。
(2)根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了 ，
从而改变了Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列 (填“发生”或“不发生”)改变，原因是__________
。
(3)为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA (Wx mRNA)的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经 过程获得总cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，原因是
。
(4)各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为 ，原因是

。

答案　(1)限制性核酸内切酶和DNA连接酶　转化
(2)RNA聚合酶与启动子的识别和结合　不发生　编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子
(3)逆转录(或反转录)　引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)
(4)品系3　品系3的Wx mRNA量最少，控制合成的直链淀粉合成酶的量最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
解析　(1)构建基因表达载体需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶，可以对目的基因和载体进行切割和连接，重组载体进入受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。(2)RNA聚合酶与启动子识别和结合后启动转录，启动子的序列改变会影响与RNA聚合酶的识别和结合，从而改变基因的转录，3个突变品系中改变的是启动子的序列，影响mRNA的转录，而编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含有启动子的序列，所以编码合成的直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。(3)通过mRNA获得cDNA是逆转录(或反转录)过程。PCR过程中需要模板、原料、酶、引物等，其中引物是根据已知基因上的一段序列合成的，这样要从总cDNA中专一性的扩增出Wx基因的cDNA，关键是要根据Wx基因的一段已知序列合成出相应的引物。(4)据题中信息可知，水稻胚乳中直链淀粉所占比例越小，糯性越强，题图中品系3中的Wx mRNA量最少，这样合成的直链淀粉合成酶的量最少，则合成的直链淀粉所占比例最小，糯性最强。
5．(2020·天津，16)Ⅰ型糖尿病是因免疫系统将自身胰岛素作为抗原识别而引起的自身免疫病。小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原，能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱，从而缓解症状。科研人员利用Ⅰ型糖尿病模型小鼠进行动物实验，使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原，为此构建重组表达载体，技术路线如下。

据图回答：
(1)为使人胰岛素在乳酸菌中高效表达，需改造其编码序列。下图是改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列。据图分析，转录形成的mRNA中，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有 个。

(2)在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列，确保等比例表达A、B肽链。下列有关分析正确的是 (多选)。
A．引入短肽编码序列不能含终止子序列
B．引入短肽编码序列不能含终止密码子编码序列
C．引入短肽不能改变A链氨基酸序列
D．引入短肽不能改变原人胰岛素抗原性
(3)在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶仅有图示的酶切位点。用这两种酶充分酶切重组表达载体，可形成 种DNA片段。
(4)检测转化的乳酸菌发现，信号肽－重组人胰岛素分布在细胞壁上。由此推测，信号肽的合成和运输所经历的细胞结构依次是 。
(5)用转化的乳酸菌饲喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段时间后，小鼠体内出现人胰岛素抗原，能够特异性识别它的免疫细胞有 (多选)。
A．B细胞 B．T细胞 C．吞噬细胞 D．浆细胞
答案　(1)6　(2)ABCD　(3)3　(4)核糖体、细胞质基质、细胞膜、细胞壁　(5)AB
解析　(1)据图分析，人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列改造后，第6、15、16、18、21、24、30位的核苷酸与改造前不同，则转录产生的密码子中第2、5、6、7、8、10个密码子发生了碱基的替换。(2)在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列，以确保等比例表达A、B肽链。若引入的短肽编码序列含有终止子序列，则会使控制合成胰岛素的基因在表达时提前终止转录过程，引起构成胰岛素的肽链变短；若引入的短肽编码序列含有终止密码子编码序列，则会使控制合成胰岛素的基因在表达时提前终止翻译过程，引起构成胰岛素的肽链变短；引入的短肽编码序列应当位于A链和B链之间，不能改变A、B链的氨基酸序列，也不能改变原人胰岛素抗原性，新产生的胰岛素具备原有的抗原性才能在被小肠黏膜吸收后，诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱，从而缓解症状，因此A、B、C、D四个选项均正确。(3)在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶的酶切位点共有3个，则用这两种限制酶充分酶切后，能够将环状的重组表达载体切成3种不同长度的链状DNA片段。(4)该信号肽－重组人胰岛素是在乳酸菌的核糖体上合成的，分布在细胞壁上，则其合成和运输过程是在核糖体上合成，经过细胞质基质、细胞膜运输，最后到达细胞壁。(5)用转化的乳酸菌饲喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段时间后，小鼠体内出现的人胰岛素抗原会引起小鼠机体发生特异性免疫反应，该过程中能够特异性识别抗原的细胞包括B细胞、T细胞、效应T细胞和记忆细胞。吞噬细胞对抗原的识别不具有特异性，浆细胞不能识别抗原。
课时精练
1．蓝藻兼具微生物和植物的优点，是一种独特的基因工程受体系统。很多蓝藻含有质粒，但其质粒不能直接作为载体，需要构建成穿梭质粒表达载体，才能使目的基因在蓝藻中有效的复制和表达。回答下列问题：

(1)据图1推测，与普通基因表达载体相比，穿梭质粒表达载体既能在 中复制，也能在 中复制。为了筛选转入了穿梭质粒表达载体的蓝藻，应在选择培养基中添加 。
(2)选大肠杆菌作为受体细胞时，应选用 处理，使其成为感受态细胞。采用基因枪法将目的基因导入蓝藻前，可使用 (填“纤维素酶和果胶酶”“溶菌酶”或“胶原蛋白酶”)去除蓝藻的细胞壁。
(3)已知DNA复制时，子链的延伸方向是5′→3′。使用PCR技术检测转基因蓝藻中是否存在人胸腺素基因，可选择图2中1、2、3、4四种单链DNA片段中的 作为引物，此过程还需要 酶。
答案　(1)大肠杆菌　蓝藻　卡那霉素　(2)Ca2＋　溶菌酶　(3)2和3　热稳定DNA聚合(或Taq)
解析　(1)据图1可知，该穿梭质粒表达载体中存在大肠杆菌质粒复制原点，也存在蓝藻质粒复制原点，推断该穿梭质粒表达载体既能在大肠杆菌中复制，也能在蓝藻中复制。该穿梭质粒表达载体上有卡那霉素抗性基因，因此应在选择培养基中添加卡那霉素进行筛选。(2)大肠杆菌作为受体细胞时，需用Ca2＋处理，使其成为感受态细胞。蓝藻细胞壁的主要成分为肽聚糖，可选择溶菌酶去除蓝藻的细胞壁。
2．如图表示从苏云金芽孢杆菌分离出来的杀虫晶体蛋白质基因及形成转基因抗虫棉的图解。请据图回答下面的问题：

(1)图中a过程要用到的酶是 。
(2)在进行图中b过程时，由我国科学家独创的十分简便经济的方法是 ，此外，也经常采用 法。若要培育转基因绵羊，则此过程要用 的方法。
(3)为确定抗虫棉是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交测试，又要在个体水平上鉴定，后者具体过程是 。
(4)活化的毒性物质应是一种 分子，可以全部或部分嵌合于昆虫的细胞膜上，使细胞膜产生孔道，导致细胞由于渗透平衡的破坏而破裂。
答案　(1)限制性核酸内切酶　(2)花粉管通道法　农杆菌转化　显微注射　(3)杀虫晶体蛋白质基因(或目的基因)　让害虫吞食抗虫棉叶子，观察害虫的存活状态(其他答案合理也可)　(4)多肽
解析　(1)图中a过程是提取目的基因，用到的酶是限制酶(限制性核酸内切酶)。(2)b过程是将目的基因导入受体细胞。花粉管通道法是我国科学家所创，此外农杆菌转化法、基因枪法也可将目的基因导入植物细胞，最常用的是农杆菌转化法。若以动物受精卵为受体细胞，则常用显微注射技术。(3)检测目的基因是否成功表达，可在分子水平检测，用杀虫晶体蛋白质基因(或目的基因)作探针，进行分子杂交。在个体水平上进行鉴定时，可以让害虫吞食抗虫棉叶子，观察害虫的存活状态。(4)活化的毒性物质是晶体蛋白在蛋白酶的作用下得到的，应该是多肽。
3．如图是将乙肝病毒表面主蛋白基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程图。巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母，能将甲醇作为其唯一碳源。该酵母菌体内无天然质粒，科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，将目的基因整合于染色体中以实现表达。已知当甲醇作为唯一碳源时，该酵母菌中AOX1基因受到诱导而表达[5′AOX1和3′AOX1(TT)分别是基因AOX1的启动子和终止子]。请分析回答下列问题：

(1)为实现HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该选择 切割质粒，并在HBsAg基因两侧的A和B位置接上 ，这样设计的优点是 。
(2)酶切获取HBsAg基因后，需用 将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取 。
(3)步骤3中应选用限制酶 来切割重组质粒以获得重组DNA，然后再将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。
(4)为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入 以便筛选；若要检测转化后的细胞中是否含有HBsAg基因转录产物，可以用 方法进行检测。
(5)转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入 以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
答案　(1)SnaBⅠ和AvrⅡ　相应的限制酶识别序列　确保定向连接(或避免质粒和目的基因自身环化及反向连接)　(2)DNA连接酶　大量重组质粒　(3)BglⅡ　(4)卡拉霉素　分子杂交　(5)甲醇
解析　(1)图中质粒含有SnaBⅠ、AvrⅡ、BglⅡ、SacⅠ 4种限制酶切割位点，其中SacⅠ位于启动子上，BglⅡ位于终止子上。如果将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，只能用限制酶SnaBⅠ和AvrⅡ切割质粒，所以应在HBsAg基因两侧的A和B位置接上SnaBⅠ、AvrⅡ限制酶的识别序列。这两种限制酶切割产生的黏性末端不同，这样可以避免质粒和目的基因自身环化，还可以防止目的基因和质粒反向连接。(2)获取目的基因后，需要用DNA连接酶将目的基因和载体连接形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取大量重组质粒。(3)步骤3是要获取含有5′AOX1－3′AOX1段基因，应选用限制酶BglⅡ来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。(4)5′AOX1－3′AOX1段基因含有卡拉霉素抗性基因，因此在培养基中加入卡拉霉素以便筛选导入重组质粒的目的菌。检测目的基因是否转录应该用分子杂交技术。(5)巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，同时甲醇能诱导AOX1基因表达。所以转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
4．(2021·大庆质检)镰刀型细胞贫血症是一种单基因遗传病，患者的血红蛋白分子β-肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常。回答下列问题：
(1)异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的 序列发生改变。
(2)将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的。此操作 (填“属于”或“不属于”)蛋白质工程，理由是该操作
。
(3)用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的 ，以其作为模板，在 酶的作用下反(逆)转录合成cDNA，cDNA与载体需在限制酶和 酶的作用下，构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。
(4)检测受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取 ，用相应的抗体进行 杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。
答案　(1)碱基对(或脱氧核苷酸)　(2)不属于　没有对现有的蛋白质进行改造(或没有对基因进行修饰)　(3)mRNA(或RNA)　逆转录　DNA连接　(4)蛋白质　抗原—抗体
解析　(1)编码血红蛋白的基因中碱基对的替换导致编码的氨基酸种类改变。(2)蛋白质工程通过基因修饰或基因合成，实现对现有蛋白质的改造或制造新蛋白质，由于该操作中没有对蛋白质或基因进行改造或修饰，因此不属于蛋白质工程。(3)因血红蛋白基因只在早期红细胞中表达，所以可从其中提取mRNA，以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，反(逆)转录合成cDNA。构建基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶。(4)目的基因是否表达可以通过从受体菌中提取蛋白质，进行抗原—抗体杂交实验加以判断。
5．已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中第158位的丝氨酸变成亮氨酸，第240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的 进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰 基因或合成 基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括 的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即： 。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过____________________和 ，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物 进行鉴定。
答案　(1)氨基酸序列(或结构)(其他合理答案也可)
(2)P　P1　DNA和RNA(或遗传物质)　DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、反(逆)转录、翻译)
(3)设计蛋白质的结构　推测氨基酸序列　功能
解析　(1)从题中所述资料可知，将P分子中第158位的丝氨酸变成亮氨酸，第240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸的排列顺序进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。中心法则的内容如图所示：

由图可知，中心法则的全部内容包括：DNA以自身为模板进行的复制，DNA通过转录将遗传信息传递给RNA，最后RNA通过翻译将遗传信息表达成蛋白质；在某些病毒中RNA可以自我复制(如烟草花叶病毒)，在某些病毒中能以RNA为模板反(逆)转录合成DNA(如HIV)，这是对中心法则的补充。(3)蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→合成DNA→表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。
6．(2020·沈阳模拟)青蒿素是最有效的抗疟疾药物，但野生黄花蒿青蒿素产量低，为缓解青蒿素供应不足的状况，科学家将tms基因和tmr基因导入黄花蒿的愈伤组织从而获得了黄花蒿的冠瘿组织，改造过程用到的部分结构如图所示。分析回答下列问题：

(1)科学家将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞的常用方法是 。
(2)图中结构P、T是基因成功转录的保证，其中结构P的作用是 。为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，并将含有目的基因的细胞筛选出来，图中还缺少的结构是 。
(3)在获得转基因的冠瘿组织过程中， 是核心步骤。
(4)T－DNA的作用是使 ，并插入到植物细胞中染色体的DNA上，要检测目的基因是否插入冠瘿组织细胞的染色体DNA上，可采用 技术。
(5)与愈伤组织相比，冠瘿组织的生长速度更快，原因可能是
。
答案　(1)农杆菌转化法　(2)RNA聚合酶识别和结合的部位　标记基因　(3)基因表达载体的构建　(4)目的基因进入植物细胞　DNA分子杂交　(5)tms和tmr基因编码产物控制合成了生长素和细胞分裂素，促进了冠瘿组织的生长
解析　(1)目的基因导入受体细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射技术、Ca2＋处理法，而导入植物细胞最常用农杆菌转化法。(2)图中结构P、T是基因成功转录的保证，其中结构P为启动子，其作用是RNA聚合酶识别和结合的部位。
7．下面为“DNA的粗提取与鉴定”实验的一些重要操作示意图，据图回答下列有关该实验的问题：


(1)正确的操作顺序是
(用图中字母和箭头表示)。
(2)上图C、E步骤都加入蒸馏水，但其目的不同，分别是 和
。
(3)图A步骤中所用酒精必须经过 才能使用，该步骤的目的是
。
(4)为鉴定A中所得到的丝状物的主要成分为DNA，可滴加 试剂，沸水浴加热5 min，如果出现 ，则该丝状物的主要成分为DNA。
答案　(1)C→B→E→D→A　(2)使鸡血细胞吸水涨破　降低NaCl溶液的浓度，使DNA析出　(3)充分冷却　提取含杂质少(或较纯净)的DNA　(4)二苯胺　蓝色