生物第2节 基因工程的基本操作程序学案

第2节　基因工程的基本操作程序（第2课时） 

学习目标

1.基于实例分析，掌握目的基因的导入和检测方法（科学思维）

2.结合聚合酶链式反应（PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定实验，掌握实验原理和操作（科学探究）

课前自主探究

一、将目的基因导入受体细胞（注意：只有该步骤没涉及到碱基互补配对现象）

1．转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内            和              的过程。

2．目的基因导入受体细胞的方法

(1)目的基因导入植物细胞

①                                法

Ⅰ.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入                            中。

Ⅱ.在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借花粉管通道进入                                           。

②农杆菌转化法

Ⅰ.农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染             植物和             植物；农杆菌的Ti质粒上的                       能够整合到所侵染细胞的                        上。

Ⅱ.转化方法：将目的基因插入农杆菌                        中，让农杆菌侵染植物细胞。

(2)目的基因导入动物细胞

①常用方法：                            法。

②常用受体细胞：                               。

(3)目的基因导入微生物细胞

①方法：用                     处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将基因表达载体导入其中。

②常用受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。

二、目的基因的检测与鉴定

1．分子水平的检测

(1)通过                             等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA。

(2)从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行                          杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。

2．个体生物学水平的鉴定

包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。

三．DNA片段的扩增及电泳鉴定

1.实验基础

①PCR原理：利用了                 原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。

②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷        的电极移动，这个过程就是电泳。

③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的                等有关。

2.PCR实验操作步骤

3.DNA的测定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为        _nm的紫外灯下被检测出来。

4.注意事项

(1)为             等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行          。

(2)PCR所用的           应分装成小份，并在         储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上             。

(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须              。所有成分都加入后，盖严离心管的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液            ，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液                    ，再放入           中进行反应。

易错易混辨析：

1．将基因表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。 (   )

2．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。   （   ）

3.应用PCR技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完成表达(　 　)

4.抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达(　 　)

5.为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体(　 　)

6.抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达( 　　)

7.检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术(　 　)

8.进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃储存(　 )

9.在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关(　 　)

10.为了节约资源，移液器上的枪头在实验过程中不必更换(　 　)

课堂合作探究

探究一.将目的基因导入受体细胞

【情境探究】欲通过基因工程按照人们的愿望获得需要的新的生物类型和生物产品，必须使目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内维持稳定和表达。植物的受精卵或体细胞、动物的受精卵、大肠杆菌或酵母菌都是基因工程中常用的受体细胞。受体细胞不同，采用的导入方法也不同。常见的方法有花粉管通道法、农杆菌转化法、显微注射法以及用Ca”处理等。请思考回答下列问题：

(1)农杆菌有什么特点？目的基因应该插入到T质粒的哪个位置？

提示：(1)农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。

目的基因应该插入到Ti质粒上的T-DNA片段中，以便T-DNA携带目的基因转移到受体细胞的染色体DNA上。

(2)农杆菌转化法中有几次拼接和导入过程？

提示：农杆菌转化法中有两次拼接和两次导入

第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。

(3)在农杆菌转化法中，受体植物不同，所用的具体转化方法有所区别，请举例分析说明。

(3)叶片：取下圆形小片与农杆菌共培养→筛选转化细胞→组织培养技术→植株；花序：直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间→农杆菌侵染受精卵→等待植株种子成熟→对种子进行筛选、鉴定。

(4)花粉管通道法与农杆菌转化法相比有什么优点？

提示：①操作简便；②直接将目的基因导入受精卵，无须组织培养即可获得植株。(答出一个即可，其他答案合理也可）

(5)植物的受精卵或体细胞都可以作为受体细胞，如果目的基因导入动物细胞，选用体细胞是否可行？

提示：动物体细胞分化程度高，全能性受到限制，因此一般采用受精卵作为受体细胞，受精卵导入目的基因后才能发育成为转基因动物。

(6)以大肠杆菌作为受体细胞时，一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，为什么？

提示：Ca2+处理可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入大肠杆菌细胞中。

(7)通过基因工程技术利用大肠杆菌或酵母菌都可以生产人胰岛素，请结合受体细胞的结构特点分析，二者生产的人胰岛素，其氨基酸序列是否相同？生物活性是否相同？　

提示：（7)氨基酸序列相同；但由于大肠杆菌是原核细胞，没有内质网和高尔基体，缺乏修饰加工，因此大肠杆菌生产的人胰岛素没有生物活性，需要后期加工。酵母菌属于真核细胞，生产的人胰岛素具有生物活性。

(8).农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？说明原因。

提示：能，可从双子叶植物中提取该化学物质，再用该化学物质处理单子叶植物细胞，然后就可用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细胞。

(9).将目的基因导入动物细胞的受体细胞，除了受精卵外，还可以选择什么细胞？

提示：还可以将目的基因导入胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物个体。

【归纳总结】．1.目的基因导入受体细胞的方法

2.农杆菌转化法分析

(1)构建携带目的基因的表达载体，需要两种工具酶：               和                  。

(2)基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用           处理农杆菌细胞，使其处于感受态，利于重组质粒的导入。

(3)由导入目的基因的受体细胞培育到完整的植株要用到                技术。

 【归纳总结】

1.在将目的基因导入受体细胞之前，必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。

2.对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞一般具有且容易表现全能性。

3.对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵表现全能性相对容易，而高度分化的动物体细胞的全能性不易表现。

4.大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞（具有多种细胞器）,所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。

【归纳总结】目的基因的检测与鉴定

【拓展】基因探针

(1)定义：是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列（DNA或RNA)。

(2)特点：①应是单链，若为双链，必须先行变性处理

②应带有容易被检测的标记。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转而来的RNA。

(3)核酸杂交：互补的两条核酸单链通过复性形成双的过程。可以用于检测目的基因；将待测DNA与目的基因针混合，如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。

课前自主探究答案

一.1. 维持稳定  表达  

2. （1）花粉管通道  子房  胚囊  双子叶  裸子   T­DNA    染色体DNA 
Ti质粒的T­DNA  （2）显微注射  受精卵  （3）Ca2＋

二、 1. （1）PCR  （2）抗原——抗体

三．1.① DNA的热变性 ② 相反 ③ 大小和构象

2.PCR实验操作步骤

3. 300

4.(1)避免外源DNA   高压灭菌  (2)缓冲液和酶    -20℃     缓慢融化

(3)更换  混合均匀   集中在离心管底部   PCR仪

易错易混辨析：

 √××√×     √√×××  

课堂合作探究

探究一.(1)农杆菌有什么特点？目的基因应该插入到T质粒的哪个位置？

提示：(1)农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。

目的基因应该插入到Ti质粒上的T-DNA片段中，以便T-DNA携带目的基因转移到受体细胞的染色体DNA上。

(2)农杆菌转化法中有几次拼接和导入过程？

提示：农杆菌转化法中有两次拼接和两次导入

第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。

(3)在农杆菌转化法中，受体植物不同，所用的具体转化方法有所区别，请举例分析说明。

(3)叶片：取下圆形小片与农杆菌共培养→筛选转化细胞→组织培养技术→植株；花序：直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间→农杆菌侵染受精卵→等待植株种子成熟→对种子进行筛选、鉴定。

(4)花粉管通道法与农杆菌转化法相比有什么优点？

提示：①操作简便；②直接将目的基因导入受精卵，无须组织培养即可获得植株。(答出一个即可，其他答案合理也可）

(5)植物的受精卵或体细胞都可以作为受体细胞，如果目的基因导入动物细胞，选用体细胞是否可行？

提示：动物体细胞分化程度高，全能性受到限制，因此一般采用受精卵作为受体细胞，受精卵导入目的基因后才能发育成为转基因动物。

(6)以大肠杆菌作为受体细胞时，一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，为什么？

提示：Ca2+处理可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入大肠杆菌细胞中。

(7)通过基因工程技术利用大肠杆菌或酵母菌都可以生产人胰岛素，请结合受体细胞的结构特点分析，二者生产的人胰岛素，其氨基酸序列是否相同？生物活性是否相同？　

提示：（7)氨基酸序列相同；但由于大肠杆菌是原核细胞，没有内质网和高尔基体，缺乏修饰加工，因此大肠杆菌生产的人胰岛素没有生物活性，需要后期加工。酵母菌属于真核细胞，生产的人胰岛素具有生物活性。

(8).农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？说明原因。

提示：能，可从双子叶植物中提取该化学物质，再用该化学物质处理单子叶植物细胞，然后就可用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细胞。

(9).将目的基因导入动物细胞的受体细胞，除了受精卵外，还可以选择什么细胞？

提示：还可以将目的基因导入胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物个体。

2.（1）限制酶  DNA连接酶   （2）Ca2＋     （3）植物组织培养