2023届高三二轮复习生物：PCR技术1-重叠PCR技术课件

这是一份2023届高三二轮复习生物：PCR技术1-重叠PCR技术课件，共19页。PPT课件主要包含了致敬凯利·穆利斯，一PCR技术，DNA，引物A，引物B，二重叠PCR技术，1构建融合基因，基因M，基因N，设计引物等内容，欢迎下载使用。
凯利·穆利斯（Kary Banks Mullis，1944年12月-2019年8月7日），美国著名化学家，因发明高效复制 DNA片段的“聚合酶链式反应（PCR）”方法而获得1993年诺贝尔化学奖。
PCR（Plymerase Chain Reactin）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，体系中加入dNTP、Mg2+以及延伸因子、扩增增强因子，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
DNA聚合酶： ①具有5’→3’聚合酶活性，这就决定了DNA只能沿着5’→3’方向合成； ②需要引物，DNA聚合酶不能催化DNA新链从头合成，只能催化dNTP加入核苷酸链的3'-OH末端。因而复制之初需要一段DNA引物的3’一OH端为起点，合成5’→3’方向的新链。
1.重叠PCR技术的定义
重叠延伸PCR技术 (gene splicing by verlap extensin PCR，SOE PCR)，是采用具有互补末端的引物，使 PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。这项技术目前主要有两个应用方向：构建融合基因；基因定点突变。
设计：不同基因的引物互补序列
2.重叠PCR技术的应用
将基因M和基因N链接起来的方法，我们可以用同尾酶切割，再用DNA链接酶将他们连在一起。但有时我们并不一定能够找到合适的酶切位点，或者说我们找到了酶切位点，但这种酶的特殊性（价格，保存），因此使用限制酶和DNA连接酶很难得到产物。
重叠PCR技术可以将基因M和基因N链接起来。其过程为：
D’与引物D互补配对A’与引物A互补配对
PCR只扩增两个引物之间的DNA片段，因此我们只分析其构建的两个引物（D’-A引物，A’-D引物）的与之结合的DNA链的复制。因为设计的这两个因为碱基互补配对，所以基因M,基因N要单独进行PCR扩增。
③回收两端片段 并进行④两端片段退火延伸
为了方便理解，我们把这4条链编上序号：1、2、3、4，退火后的结果为：
基因M和基因N重叠区域
DNA聚合酶：具有5’→3’聚合酶活性，这就决定了DNA只能沿着5’→3’方向合成；
DNA聚合酶会结合在该DAN分子上，继续完成该DNA的合成，进而将基因M,基因N链接在一起
设计四种引物，用第一对引物（a、b）扩增含有突变位点及其上游序列的 DNA 片段，第二对引物（c、d）被用来扩增含突变位点及其下游序列的 DNA 片段，两个侧翼引物（a、d）含野生型序列，两个突变引物（b、c）含有希望引进的突变位点，如置换、插入或缺失的碱基（红点）。混合两次 PCR 的产物，由于两个突变引物有重叠区，重叠片段之间退火、延伸成异源双链，加入外侧引物进行第三次 PCR，即可得到目标突变体。
突变引物b和突变引物c碱基互补配对并含有用于替换、插入或缺失的碱基
例1.（北京•海淀•期中）萝卜的蛋白A具有广泛的抗植物病菌作用，而且对人体没有影响。我国科学家欲获得高效表达蛋白A的转基因大肠杆菌作为微生物农药，做了相关研究。（1）研究者用相同的 酶处理蛋白A基因和pET质粒，得到了重组质粒，再将重组质粒置于经 处理的大肠杆菌细胞悬浮液中，获得转基因大肠杆菌。
（2）检测发现，转入的蛋白A基因在大肠杆菌中表达效率很低，研究者推测不同生物对密码子具有不同的偏好。因而设计了与蛋白A基因结合的两对引物（引物B和C中都替换了一个碱基），并按图2方式依次进行4次PCR扩增，以获得新的蛋白A基因。
①这是一种定点 技术。②图2所示的4次PCR应该分别如何选择图1中所示的引物？请填写以下表格（若选用该引物划“√”，若选用该引物划“×”）
（3）研究者进一步将含有新蛋白A基因的重组质粒和 分别导入大肠杆菌，提取培养液中的蛋白质，用 方法检测并比较三组受体菌蛋白A的表达产物，判断蛋白A基因表达效率是否提高。为检测表达产物的生物活性。研究者将上述各组表达产物加入到长满了植物病菌的培养基上，培养一段时间后，比较 大小，以确定表达产物的生物活性大小。（4）作为微生物农药，使用时常喷洒蛋白A基因的发酵产物而不是转蛋白A基因的大肠杆菌，其优点是 。
含有蛋白A基因的重组质粒
空质粒（pET质粒）、
①对人、畜、农作物和自然环境安全；②不会造成基因污染；③有效成分纯度高
通过这道题，我们对PCR定点突变的应用有了更深一层的认识。如果还是有疑问可以查阅相关资料或者添加我的微信，我们一起探讨一下。PCR技术还有很多应用：如检测基因型、分子克隆、基因敲除等，被广泛应用于基础研究、疾病诊断、农业检测和法医调查等领域。