2024届高三生物一轮复习基础夯实练62：基因工程的基本工具和基本操作程序

基础夯实练62  基因工程的基本工具和基本操作程序

一、选择题

1．(2023·江苏宿迁高三质检)如图表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相关的酶作用位点。下列叙述错误的是(　　)

A．甲、乙、丙都属于黏性末端

B．甲、乙片段可形成重组DNA分子，但甲、丙不能

C．DNA连接酶的作用位点在图乙中b处

D．切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子

2．T4 DNA连接酶可将任意2个具有相同黏性末端的DNA片段连接在一起。该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸(AMP)通过共价键与酶相连，随后AMP转移至DNA片段，进而完成连接反应。下列叙述正确的是(　　)

A．T4 DNA连接酶的底物种类较多，故其无专一性

B．T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分已改变

C．ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键

D．T4 DNA连接酶需保存于最适温度和pH条件下

3．(2023·安徽亳州高三检测)基因工程利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性内切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点分别如图所示。下列分析错误的是(　　)

A．构建重组DNA时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体

B．构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体

C．图乙中的P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有两个游离的磷酸基团

D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA

4．下列有关获取目的基因的叙述，错误的是(　　)

A．目的基因就是编码蛋白质的基因

B．筛选和获取目的基因是基因工程的第一步

C．来自苏云金杆菌的Bt基因可作为转基因抗虫棉的目的基因

D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会

5．(2023·河北石家庄高三模拟)如图是快速RT－PCR过程示意图，①和②为逆转录酶催化的逆转录过程，③是PCR过程。据图分析，下列叙述错误的是(　　)

A．逆转录酶具有DNA聚合酶的能力

B．③PCR过程只需要引物b

C．RT－PCR可检测基因表达水平

D．RT－PCR可检测新冠病毒等RNA病毒

6．(2022·山东，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　　)

A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解

B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀

C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色

D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质

7．(2023·江苏泰州高三调研)引物的设计是影响PCR扩增反应的效率和特异性的关键因素，下列相关叙述正确的是(　　)

A．引物的碱基数量越少则退火温度越低、目标DNA获得率越高

B．根据需要可在引物的5′端添加限制酶识别序列、点突变序列等

C．两种引物的退火温度差异较大，可减少引物与模板的非特异性结合

D．引物的GC含量越高，结合特异性越强，越利于目标DNA的扩增

8．DNA琼脂糖凝胶电泳是指利用在溶液中带负电荷的DNA分子在电场中向正极移动的原理，分离、纯化或分析PCR扩增后的待检DNA片段的生物化学技术。下列说法错误的是(　　)

A．DNA片段相对分子质量越大，迁移就越慢

B．凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA片段的检测

C．拟回收的DNA区带融化后可先用DNA抽取剂抽提，再用70%的冷酒精沉淀抽提DNA片段，从而提高回收率

D．新冠病毒核酸检测出现假阳性的原因可能是阳性对照中模板核酸与样品交叉污染

9．(2023·江苏扬州高三质检)实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法不正确的是(　　)

A．做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针

B．RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增

C．若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒

D．病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体，其原理都是抗原—抗体杂交

10．(2023·江西南昌高三模拟)下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述错误的是(　　)

注：AmpR：氨苄青霉素抗性基因；TetR：四环素抗性基因。

A．应选择的限制酶组合是酶F和酶G

B．所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因

C．用含氨苄青霉素的培养基筛选出的是含重组质粒的受体菌

D．同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到4个条带

11．(2023·江苏南京师大附中高三调研)载体是基因工程中携带外源 DNA 片段(目的基因)进入受体细胞的重要运载工具，常见的载体类型主要有基因克隆载体和基因表达载体。如图是利用细菌生产人胰岛素的基本流程示意图，下列相关叙述错误的是(　　)

A．重组载体A、重组载体B分别是基因克隆载体和基因表达载体

B．载体A和载体 B都必须含有限制酶切割位点、复制原点和标记基因

C．必须把目的基因插入重组载体A 的启动子和终止子之间

D．培养细菌A和细菌B的培养基在营养成分和功能上有明显差异

二、非选择题

12．如图pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素(一种抗生素)抗性基因；mel为黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而三种限制酶SacⅠ、SphⅠ、BglⅡ在pIJ702上分别只有一处识别序列。回答下列问题：

表1

注：“＋”表示生长；“－”表示不生长。

表2

(1)限制酶可以识别双链DNA中特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的________________断裂，切割形成的末端有______________________两种。

(2)以SacⅠ和SphⅠ切取目的基因，与质粒pIJ702上长度为0.4 kb的SacⅠ/SphⅠ片段进行置换，构建重组质粒pZHZ8。上述两种质粒经限制酶BglⅡ酶切后所得片段长度见表1。由此判断目的基因的片段长度为____________kb，判定目的基因中含有一个BglⅡ切割位点的理由是________________________________________________________________________

________________________________________________________________________。

(3)导入目的基因时，首先用Ca2＋处理链霉菌使其成为感受态(能吸收周围环境中DNA分子的生理状态)细胞，再将重组质粒pZHZ8溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下可以促进链霉菌完成________________过程。

(4)不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素的固体培养基上生长状况如表2所示。若要筛选导入pZHZ8的链霉菌细胞，所需硫链丝菌素浓度至少应在________μg/mL以上，挑选成功导入pZHZ8的链霉菌的具体方法是_____________________________________________________

_______________________________________________________________________________。若要检测整合到染色体DNA上的目的基因是否发挥功能作用，第一步需检测受体细胞的______(填“DNA”或“RNA”)。

13．(2021·江苏，23)某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：

(1)目的基因的扩增

①提取真菌细胞__________________，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。

②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致__________________。

③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除Taq DNA聚合酶以外的各成分混合后，加热到80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增。下列叙述正确的有________。

A．TaqDNA聚合酶最适催化温度范围为50～60 ℃

B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物

C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸

D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了TaqDNA聚合酶的特异性

(2)重组质粒的构建

①将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进____________________，形成A－m结合体。将A－m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及________酶等，完成质粒的环化。

②若正确构建的重组质粒A－m仍能被SmaⅠ切开，则SmaⅠ的酶切位点可能在_________

_______________________________________________________________________________。

(3)融合蛋白的表达

①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A－m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是________________________

_______________________________________________________________________________。

②若通过抗原－抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明______________________，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。

14．如图是利用工程菌(大肠杆菌)生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和Hind Ⅲ的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：

(1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有________的因子。过程①所用到的组织细胞是_____________________________________________________，③过程的目的是

________________________，⑤过程常用_______________________________处理大肠杆菌。

(2)如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ对图中质粒进行切割，形成的DNA片段种类有________种，这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有______种和______种。

(3)如果只用限制酶PstⅠ切割目的基因和质粒，完成过程④、⑤后(受体大肠杆菌不含AmpR、TetR)，将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取甲培养基上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选______________________的大肠杆菌；接种到乙培养基上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的是_______________________。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是_____________________________

_______________________________________________________________________________。

参考答案

1．C

2．C　[T4 DNA连接酶有专一性，A错误；酶在催化反应前后性质不变，故T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分不变，B错误；ATP水解产生AMP需要打开两个特殊的化学键，结合题干信息“该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸(AMP)通过共价键与酶相连”可推测，ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键，C正确；T4 DNA连接酶需在低温和最适pH条件下保存，D错误。]

3．D　[P1噬菌体载体为环状DNA，其上只含有一个EcoRⅠ的酶切位点，因此用EcoRⅠ切割后，该环状DNA分子变为双链DNA分子，因每条链各含有一个游离的磷酸基团，故切割后含有两个游离的磷酸基团，C正确；由图甲可知，用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体后形成的黏性末端相同，可任意连接，不止产生一种重组DNA，D错误。]

4．A　[目的基因主要是指编码蛋白质的基因，A错误；目的基因的筛选与获取是实施基因工程的第一步，B正确；来自苏云金杆菌的Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，C正确；随着测序技术的发展，以及序列数据库和序列比对工具等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能，D正确。]

5．B　[③PCR过程需要引物a、b，因为后续的模板链序列既有与靶RNA一致的，也有与cDNA一致的，B错误。]

6．B

7．B　[退火温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，引物的碱基数量越少，变性时破开的氢键越少，则退火温度越低，但能与引物发生配对的片段就越多，目标DNA获得率越低，A错误；根据需要可在引物的5′端添加限制酶识别序列、点突变序列等，以便更加准确地获得目的基因，B正确；两种引物的退火温度差异较大，导致不能同时退火，甚至一条链在延伸，一条链在退火，可增加引物与模板的非特异性结合，C错误；引物的GC含量越高，结合特异性越强，但GC含量过高，氢键越多，不利于退火 ，从而阻碍目标DNA的扩增，D错误。 ]

8．C　[拟回收的DNA区带融化后可先用DNA抽取剂抽提，再体积分数为用95%的冷酒精沉淀抽提DNA片段，从而提高回收率，C错误。]

9．C　[PCR扩增必须以DNA为模板，RNA不能作为PCR扩增的模板，所以需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增，B正确；若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者极有可能感染了病毒，C错误。]

10．C　[为避免切割后DNA片段的自身环化，又保留质粒上的标记基因，切割时应选择的限制酶组合是酶F和酶G，A正确；所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因，以便于对含有目的基因的受体菌进行选择，B正确；用含氨苄青霉素的培养基筛选出的有导入重组质粒的受体菌和导入原质粒的受体菌，C错误；据题图分析可知，同时用三种限制酶处理图中质粒，因酶E有两个作用位点，故将质粒切割成了4个DNA片段，电泳后可得到4个条带，D正确。]

11．C　[培养细菌A的目的是扩增目的基因，不需要获得表达产物，因此目的基因不一定要插入重组载体A 的启动子和终止子之间，C错误；培养细菌A的目的是扩增目的基因，培养细菌B的目的是获得胰岛素，因此培养两者的培养基在营养成分和功能上有明显差异，D正确。]

12．(1)磷酸二酯键　黏性末端和平末端　(2)1.4　pIJ702上的原有BglⅡ切割位点被目的基因置换得到的环状pZHZ8，仍能被BglⅡ切割成一条线段　(3)转化　(4)5　根据导入pIJ702的链霉菌菌落呈黑色、导入pZHZ8的链霉菌菌落呈白色的特点，通过观察菌落的颜色进行挑选　RNA

解析　(2)质粒pIJ702的长度为5.7 kb，而重组质粒pZHZ8的长度为6.7 kb，又已知构建基因表达载体时，目的基因置换了pIJ702上0.4 kb的片段，由此判断目的基因的片段长度为6.7－5.7＋0.4＝1.4 (kb)。(4)从不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素固体培养基上的生长状况表格可以看出，硫链丝菌素浓度低于5 μg/mL时，链霉菌能够生长，因此所需的硫链丝菌素最小浓度应为5 μg/mL。检测目的基因是否发挥功能作用的第一步是目的基因是否能转录形成mRNA。

13．(1)①RNA　②蛋白M上不含tag标签　③BC　(2)①黏性末端碱基互补配对　DNA连接　②基因m的连接处、基因m的内部　(3)①受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因，可以长成菌落　②融合基因表达(或重组质粒A－m构建成功)

解析　(1)①以逆转录获得cDNA的方式，要先从真菌细胞中提取基因m转录出来的mRNA。②从构建好的重组质粒上看，tag序列位于目的基因下游，若基因m的转录产物mRNA上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，则不会对tag序列的转录产物继续进行翻译，蛋白M上就不含tag标签。③从题干信息可知，“80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增”，故TaqDNA聚合酶最适催化温度范围为94 ℃左右，A错误；PCR 反应的最初加热过程中，样品温度上升到70 ℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在Taq DNA聚合酶的作用下延伸，结果会导致引物错配形成的产物的扩增，影响反应的特异性，热启动可减少引物错配形成的产物的扩增，提高反应的特异性，B正确；DNA分子复制具有方向性，都是从5′端向3′端延伸，C正确；TaqDNA聚合酶没有特异性，与普通的DNA聚合酶相比，TaqDNA聚合酶更耐高温，D错误。故选BC。(2)①从图上看，载体A只有一个SmaⅠ的酶切位点，故被SmaⅠ切开后，载体由环状变为链状DNA，将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载体A与添加同源序列的m的黏性末端碱基互补配对。将A－m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。②重组质粒中，载体A被Sma Ⅰ切开的位置已经与基因m相连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的重组质粒A－m仍能被Sma Ⅰ切开，则Sma Ⅰ的酶切位点可能在基因m的连接处或基因m内部。(3)①筛选目的菌株的机理：导入了质粒A－m的目的菌株由于含有URA3基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而URA3基因缺失型酵母则不能存活。②若通过抗原－抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，位于tag标签上游的基因m应该正常表达，说明融合基因表达(或重组质粒A－m构建成功)。

14．(1)调控作用　人垂体组织细胞　将平末端处理为黏性末端　Ca2＋　(2)9　3　3　(3)含四环素抗性基因　完整的pBR322质粒(或含有AmpR、TetR的质粒)　在丙中能存活，在乙中不能存活

解析　(2)假设PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ三种酶的切点分别用1、2、3表示(后面的→均按照顺时针方向)。一种酶分别酶切时，一共可以得到3种片段1→1、2→2、3→3；任意两种酶分别同时酶切时，可得到1→2、2→1、2→3、3→2、1→3、3→1六种片段；三种酶同时酶切时，可得到1→2、2→3、3→1三种片段。综上所述，共计9种不同的片段(1→1、1→2、1→3、2→1、2→2、2→3、3→1、3→2、3→3)。其中片段3→2、2→2、3→3共3种含有完整氨苄青霉素抗性基因，片段2→1、2→2、1→1共3种含有完整四环素抗性基因。