2024届苏教版高考生物一轮复习基因工程的基本工具和基本操作程序学案

这是一份2024届苏教版高考生物一轮复习基因工程的基本工具和基本操作程序学案，共29页。学案主要包含了易错辨析，填空默写，非选择题等内容，欢迎下载使用。
第6课时　基因工程的基本工具和基本操作程序
课标要求　1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。3.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
考点一　基因工程的基本操作工具

1．基本工程的概念
(1)供体：提供外源目的基因。
(2)操作环境：体外。
(3)操作水平：分子水平。
(4)原理：基因重组。
(5)受体：表达目的基因。
(6)本质：性状在受体体内的表达。
拓展　基因工程的理论基础

2．重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)

(2)DNA连接酶

(3)载体

延伸应用　图解限制酶的选择原则

(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。

考向　基因工程的基本工具
1．下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断，下列说法错误的是(　　)
限制酶名称
识别序列和切割位点
限制酶名称
识别序列和切割位点
BamH Ⅰ
G↓GATCC
KpnⅠ
GGTAC↓C
EcoR Ⅰ
C↓AATTC
Sau3AⅠ
↓GATC
Hind Ⅱ
GTY↓RAC
SmaⅠ
CCC↓GGG

注：Y为C或T，R为A或G。
A．HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
答案　D
解析　HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶沿着中轴线切口切开，切割后形成平末端，A正确；Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B正确；BamHⅠ限制酶识别GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C正确；HindⅡ能识别GTCAAC，也能识别GTTAAC，D错误。
2．(多选)第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是(　　)

A．构建DNA疫苗时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒
B．图乙中只用EcoRⅠ切割后的质粒，含有1个游离的磷酸基团
C．用EcoRⅠ切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶连接，只产生1种连接产物
D．抗原基因在体内表达时不需要解旋酶
答案　BC
解析　从图甲看出，用EcoRⅠ切割目的基因后两端各有一个切口，与图乙中EcoRⅠ切口对接时，可有两种可能，即可产生两种重组DNA，C项错误；基因表达包括转录和翻译，转录时不需要解旋酶，在RNA聚合酶的作用下，DNA即可解旋，D项正确。
3．下列有关基因工程中载体的说法，正确的是(　　)
A．在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒都是天然质粒
B．所有的质粒都可以作为基因工程中的载体
C．质粒是一种独立于细菌染色体外的链状DNA分子
D．作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因
答案　D
解析　在进行基因工程操作中，被用作载体的质粒是在天然质粒的基础上进行过人工改造的，A错误；具有一至多个限制酶切点、具有标记基因的质粒才可以作为基因工程中的载体，B错误；质粒是一种独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的环状DNA分子，C错误；作为载体的质粒DNA分子上应有对重组DNA进行鉴定和选择的标记基因，而且能在受体细胞中复制并稳定保存，D正确。
考点二　基因工程的基本操作程序

1．目的基因的获取
(1)化学合成法直接人工合成目的基因：一般为比较小的目的基因。
(2)基因文库获取目的基因：来源可分为基因组文库和cDNA文库。
①基因组文库：指含有某种生物体全部基因片段的重组DNA的克隆群体。从基因组文库中筛选某种目的基因，一般采用核酸探针杂交法。
②cDNA文库：从组织细胞中提取mRNA，逆转录成cDNA，与适当载体连接后转化宿主，包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
2．基因表达载体的构建
(1)目的：使目的基因进入受体细胞并有效表达，而且要能稳定存在且遗传给后代。
(2)基因表达载体的组成及作用




(3)构建过程

易错提醒　启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
项目
启动子
终止子
起始密码子
终止密码子
本质
DNA
DNA
mRNA
mRNA
位置
目的基因上游
目的基因下游
mRNA首端
mRNA尾端
功能
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
使转录在所需要的地方停下来
翻译的起始信号(编码氨基酸)
翻译的结束信号(不编码氨基酸)

3．将目的基因导入受体细胞
生物种类
植物
哺乳动物
微生物
常用方法
农杆菌转化法
显微注射法
Ca2＋处理法
受体细胞
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达
取卵→将含有目的基因的表达载体注入→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→细胞处于一种容易接受外来DNA的生理状态→基因表达载体导入

辨析　(1)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
(2)农杆菌特点
①能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。
②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。

4．目的基因及其表达产物的检测鉴定


考向　基因工程的基本操作程序
4．戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2基因编码的结构蛋白(pORF2)位于病毒表面，构成病毒的衣売。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程如图。下列关于该疫苗的叙述，正确的是(　　)

A．过程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、C
B．重组基因表达载体上的启动子需来源于戊型肝炎病毒
C．过程⑤需要用聚乙二醇处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
D．过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定
答案　D
解析　戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，过程①是以病毒RNA为模板合成DNA，获取目的基因的过程，需要的酶是逆转录酶，原料是四种脱氧核苷酸，A项错误；启动子是一段有特殊结构的DNA片段，其作用是供RNA聚合酶识别结合以驱动目的基因的转录，启动子具有物种或组织特异性，构建在大肠杆菌细胞内特异表达pORF2蛋白的载体时，需要选择大肠杆菌细胞的启动子，而不能选择其他物种和组织细胞的启动子，B项错误；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2＋处理法，需要用Ca2＋处理大肠杆菌，细胞质膜对DNA的通透性会发生改变，使其处于一种容易接受外来DNA的生理状态，C项错误。
5．下列有关基因表达载体的叙述，不正确的是(　　)
A．具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增
B．具有启动子，作为多肽链合成的起始信号
C．具有标记基因，有利于目的基因的初步检测
D．具有目的基因，以获得特定的基因表达产物
答案　B
解析　基因表达载体必须使目的基因能够在受体细胞内进行表达，具有启动子(启动转录)，作为RNA合成的起始信号，B错误。
6．(2021·全国乙，38)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。

回答下列问题：
(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，上图中____________酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接，上图中__________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能______________；质粒DNA分子上有_______________________，
便于外源DNA的插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是____________________________________
________________________________________________________________________。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指________________________________________
________________________________________________________________________。
答案　(1)EcoRⅠ、PstⅠ　EcoRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcoRⅤ　(2)磷酸二酯键　(3)自我复制　一至多个限制酶切割位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞　(4)位于基因上游的一段DNA片段，是RNA聚合酶识别、结合的部位，能驱动转录过程
解析　(1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4 DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoRⅠ和PstⅠ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4 DNA连接酶连接。(3)质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。
考点三　PCR技术、电泳鉴定及DNA的粗提取和鉴定

1．PCR技术
(1)过程
变性：94 ℃条件下受热变性后解链为单链
↓
退火：55 ℃条件下，引物与单链相应互补序列结合
↓
延伸：72 ℃条件下在Taq酶作用下合成子链
思考分析　
①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。
③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
④PCR扩增过程中的循环图示与规律

循环次数
1
2
3
n
DNA分子数
2
4
8
2n
含引物A(或B)的DNA分子数
1
3
7
2n－1
同时含引物A、B的DNA分子数
0＝21－2
2＝22－2
6＝23－2
2n－2
共消耗的引物数量
2＝21＋1－2
6＝22＋1－2
14＝23＋1－2
2n＋1－2

(2)PCR技术和DNA复制的比较

(3)DNA的电泳鉴定

2．DNA的粗提取和鉴定
(1)基本原理
①原理：利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
②DNA的性质：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA能溶于2 mol·L－1的NaCl溶液。
③DNA的鉴定：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。


(2)过程


考向一　PCR技术及电泳鉴定
7．(多选)(2023·江苏南京高三模拟)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述错误的是(　　)

A．PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状，需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译
B．单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因重组
C．第二轮PCR所用的引物都是第一轮PCR产物DNA的两条链
D．利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程
答案　BC
解析　单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变，B错误；除了第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误；蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程，D正确。
8．利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，下列有关“利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定”实验的相关叙述，错误的是(　　)
A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理
B．PCR利用了DNA的热变性原理
C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
答案　C
解析　PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，这样才能不破坏缓冲液中稳定性较差的成分，同样保护酶的活性不被破坏，C错误。
考向二　DNA的粗提取和鉴定
9．下列有关“DNA粗提取和鉴定”实验的叙述，正确的是(　　)
A．新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取
B．选用洋葱作为实验材料时可以使用吸水涨破法破坏细胞
C．DNA可溶于蒸馏水，也可溶于2 mol/L的NaCl溶液
D．溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后，颜色呈紫色
答案　C
解析　猪是哺乳动物，其红细胞没有细胞核，所以猪血不能用于DNA的粗提取，A错误；植物材料不能使用吸水涨破法破坏细胞，B错误；DNA不溶于95%的冷酒精，可溶于蒸馏水，也可溶于2 mol/L的NaCl溶液，C正确；溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，需沸水浴加热后冷却，再观察颜色(呈蓝色)，D错误。

1．(2019·江苏，10)下列关于DNA粗提取和鉴定的叙述，错误的是(　　)
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的酒精可用来进一步纯化粗提的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
答案　A
解析　哺乳动物(如兔)成熟的红细胞中无细胞核和众多细胞器，不能提取到DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A错误；为防止DNA断裂，在DNA析出过程中搅拌操作要轻柔且沿着一个方向，B正确；DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精溶液，预冷的酒精溶液可用来进一步纯化粗提的DNA，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色，因此，用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行沸水浴加热，D正确。
2．(2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是(　　)

A．①＋③ B．①＋②
C．③＋② D．③＋④
答案　B
解析　引物①扩增的片段含有启动子和HMA3基因，引物③扩增的片段不含启动子，引物②扩增的片段既含有启动子，又含有HMA3基因序列。图示中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①＋②，B正确。
3．(2020·浙江7月选考，24)下列关于基因工程的叙述，正确的是(　　)
A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D．已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带，用某种限制性内切核酸酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
答案　D
解析　基因工程中，若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶(简称限制酶)，重组质粒进入大肠杆菌体内后，该限制酶可以切割重组质粒，使重组质粒不能保持结构稳定，A项错误；将抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐，若抗除草剂基因转入到抗盐基因的编码区，破坏了抗盐基因，则会出现由抗盐到不抗盐的改变，可说明抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入有关，B项错误；抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂，则前者应表达了抗性蛋白，而后者可能表达了抗性基因RNA但不能进行翻译过程，也可能没有表达出抗性基因RNA，C项错误；已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带，用某种限制性内切核酸酶完全酶切环状质粒后，出现几条带则表明该质粒上一定至少有几个被酶切开的位置，注意若完全酶切链状DNA后，出现3条带，则表明该DNA上一定至少有3个被酶切开的位置，D项正确。
4．(2020·江苏，33)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图(以EcoR Ⅰ酶切为例)：

请据图回答问题：
(1)步骤 Ⅰ 用的EcoRⅠ是一种______________酶，它通过识别特定的______________切割特定位点。
(2)步骤 Ⅱ 用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成________________；PCR循环中，升温到94 ℃是为了获得________________；Taq酶的作用是催化________________。
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。

DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列

PCR引物
①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′
②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′
③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′
④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′

(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是________。
A．5′－AACTATGCG……AGCCCTT－3′
B．5′－AATTCCATG……CTGAATT－3′
C．5′－GCAATGCGT……TCGGGAA－3′
D．5′－TTGATACGC……CGAGTAC－3′
答案　(1)限制性内切核酸(或限制)　核苷酸序列　(2)磷酸二酯键　DNA单链　以DNA为模板的DNA链的延伸　(3)②④　(4)B
解析　(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种限制性内切核酸酶，它通过识别特定的核苷酸序列来进行切割。(2)步骤Ⅱ中用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升温到94 ℃是为了解开DNA双链获得DNA单链，Taq酶的作用是催化以DNA为模板延伸形成子链的过程。(3)PCR过程中，根据已知的DNA序列合成两个引物，要注意模板链和引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能够和相应模板的核苷酸序列发生碱基互补配对，环状DNA图中显示PCR过程是从已知DNA序列的两端分别向相反方向形成子链，一个引物是与已知DNA序列的第一条链的左端互补结合，向右侧方向延伸形成子链，该引物是④，另一个引物是与已知DNA序列的第二条链的右端互补结合，向左侧方向延伸形成子链，该引物是②。(4)图中由片段F形成的环状DNA的未知序列中有一个EcoR Ⅰ限制酶的切割位点，而EcoRⅠ识别的位点是，因此片段F的单链中的一端应含有“AATTC……”序列，另一端应含有“TTAAG……”序列，只有B项符合题意。
5. (2022·江苏，24)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题：
(1)纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞质膜延伸形成的纤毛膜主要由________________组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是____________________________
________________________________________________________________________。

(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是___________________。
PCR扩增时，需在______________催化下，在引物__________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X－GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y－M重组质粒(在EcoRV位点插入片段)。请完成下表。


分步实验目标
简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y－M(图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向)
①选择图Ⅱ引物__________；
②PCR目的产物约为__________bp
确保M及连接处序列正确，Y－M的连接处上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的识别序列
③质粒测序，图Ⅲ中正确的是__________(选填序列编号)
检测融合蛋白定位
④对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明__________________________
____________________________________

(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经____________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的__________倍。
答案　(1)磷脂、蛋白质　发出星射线，形成纺锤体　(2)溶解DNA　热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)　3′　(3)a、b　1 100　Q3　X蛋白参与中心体的形成　(4)逆转录　32
解析　(2)从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，DNA在2.0 mol/L的NaCl溶液中的溶解最大，高于或低于这一浓度，DNA的溶解度均会下降，因此实验过程中添加NaCl至2.0 mol/L的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在Taq酶的催化下，在引物的3′端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。(3)PCR扩增目的DNA片段时，在引物的3′端进行DNA链的延伸，据图可知，应选择图Ⅱ中的引物a和引物b，PCR目的产物约为300＋800＝1 100(bp)。为确保M及连接处序列正确，Y－M的连接处上游含有Hind Ⅲ＋EcoR V的识别序列，下游含有EcoR V＋BamH Ⅰ的识别序列，根据题干信息构建Y－M重组质粒(在EcoRV位点插入片段)，Y－M的连接处测序后部分序列应含有Hind Ⅲ和BamH Ⅰ识别位点，根据各限制酶识别位点，应选择序列Q3。对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X参与中心体的组成。(4)研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)，说明病人基因Z表达较弱，设健康人Z基因的cDNA数为x，病人Z基因的cDNA数为y，则有x×215＝y×220，从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的25＝32(倍)。

一、易错辨析
1．限制酶也可以识别和切割RNA(　×　)
2．DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来(　×　)
3．E.coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(　×　)
4．用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物(　√　)
5．DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精(　√　)
6．在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关(　×　)
二、填空默写
1．(选择性必修3 P87)基因工程：又称DNA重组技术，指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA，然后导入受体细胞，并使其在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。
2．(选择性必修3 P87)限制酶的特异性很强，能识别DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
3．(选择性必修3 P89)E.coli DNA连接酶，可以用于连接具有黏性末端的DNA分子；T4 DNA连接酶，可以用于连接具有黏性末端或平末端的DNA分子。
4．(选择性必修3 P90)PCR反应需要在一定的缓冲液中才能进行，需提供DNA模板、引物对、4种dNTP和热稳定的DNA聚合酶。
5．(选择性必修3 P97)基因表达载体除目的基因外，还应该包括复制原点、启动子、终止子和标记基因等。
6．(选择性必修3 P98)农杆菌转化法是将目的基因插到农杆菌Ti质粒的T－DNA特定区段上，再通过T－DNA将其插入受体细胞染色体的DNA上，使目的基因得到稳定的遗传和表达。
课时精练
一、单项选择题
1．目前研究混杂DNA群体中的特异DNA序列，一般基于两种不同的方法，即DNA克隆和DNA分子杂交，如图所示。下列有关叙述错误的是(　　)

A．方法①需要限制酶和DNA连接酶
B．方法②需要解旋酶和DNA聚合酶
C．方法③需要对探针进行特殊标记
D．方法①②③都遵循碱基互补配对原则
答案　B
解析　方法①中将目的基因与载体切割和连接制成重组DNA，需要限制酶和DNA连接酶，A正确；方法②体外扩增技术中变性－退火－延伸，不需要解旋酶，B错误；方法③需要对探针进行特殊标记，这样才能特异性检测，C正确；方法①②③都遵循碱基互补配对原则，D正确。
2．(2023·江苏宿迁高三质检)如图表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相关的酶作用位点。下列叙述错误的是(　　)

A．甲、乙、丙都属于黏性末端
B．甲、乙片段可形成重组DNA分子，但甲、丙不能
C．DNA连接酶的作用位点在图乙中b处
D．切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子
答案　C
解析　甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子，但甲、丙的黏性末端不同，它们之间不能形成重组DNA分子，B正确；DNA连接酶将两个DNA片段连接为一个DNA分子，作用部位是磷酸二酯键，即图乙中a处，C错误；切割甲的限制酶的识别序列为GAATTC∥CTTAAG，而甲、乙片段形成的重组DNA分子序列为GAATTG∥CTTAAC，因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D正确。
3．(2023·江苏南通高三检测)基因工程利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性内切核酸酶BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点分别如图所示。下列分析错误的是(　　)

A．构建重组DNA时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
B．构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
C．图乙中的P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有两个游离的磷酸基团
D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA
答案　D
解析　P1噬菌体载体为环状DNA，其上只含有一个EcoRⅠ的酶切位点，因此用EcoRⅠ切割后，该环状DNA分子变为双链DNA分子，因每条链各含有一个游离的磷酸基团，故切割后含有两个游离的磷酸基团，C正确；由图甲可知，用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体后形成的黏性末端相同，可任意连接，不止产生一种重组DNA，D错误。
4．(2023·江苏泰州高三调研)引物的设计是影响PCR扩增反应的效率和特异性的关键因素，下列相关叙述正确的是(　　)
A．引物的碱基数量越少则退火温度越低、目标DNA获得率越高
B．根据需要可在引物的5′端添加限制酶识别序列、点突变序列等
C．两种引物的退火温度差异较大，可减少引物与模板的非特异性结合
D．引物的GC含量越高，结合特异性越强，越利于目标DNA的扩增
答案　B
解析　退火温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，引物的碱基数量越少，变性时破开的氢键越少，则退火温度越低，但能与引物发生配对的片段就越多，目标DNA获得率越低，A错误；根据需要可在引物的5′端添加限制酶识别序列、点突变序列等，以便更加准确地获得目的基因，B正确；两种引物的退火温度差异较大，导致不能同时退火，甚至一条链在延伸，一条链在退火，可增加引物与模板的非特异性结合，C错误；引物的GC含量越高，结合特异性越强，但GC含量过高，氢键越多，不利于退火 ，从而阻碍目标DNA的扩增，D错误。
5．利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列叙述错误的是(　　)

A．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列
B．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对而造成引物自连
C．退火温度过高可能导致PCR反应得不到任何扩增产物
D．第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为15/16
答案　D
解析　用PCR方法扩增目的基因时，要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成(两种)引物，但不必知道基因的全部序列，A正确；复性的目的是使两种引物通过碱基互补配对与两条DNA单链结合，因此退火温度过高可能引起两种引物不能与两条DNA单链结合，进而导致PCR反应得不到任何扩增产物，C正确；DNA复制为半保留复制，第四轮循环即DNA复制4次，共形成24＝16个DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子含有引物A或引物B，其余14个DNA分子均含有引物A和引物B，所以第四轮循环产物中同时含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例为14/16＝7/8，D错误。
6．在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，不正确的是(　　)

A．该载体最可能为环形DNA分子
B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C．限制酶R1与R2的切割位点最短相距200 bp
D．限制酶作用于该载体会导致氢键和肽键断裂
答案　D
解析　由题可知，当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；由题可知，当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的DNA片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；由题可知，两种限制酶同时切割时则产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点至少相距200 bp，C正确；限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点上两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。
7．(2023·江苏常州高三模拟)如图是快速RT－PCR过程示意图，①和②为逆转录酶催化的逆转录过程，③是PCR过程。据图分析，下列叙述错误的是(　　)

A．逆转录酶具有DNA聚合酶的能力
B．③PCR过程只需要引物b
C．RT－PCR可检测基因表达水平
D．RT－PCR可检测新冠病毒等RNA病毒
答案　B
解析　③PCR过程需要引物a、b，因为后续的模板链序列既有与靶RNA一致的，也有与cDNA一致的，B错误。
二、多项选择题
8．ROP蛋白可以参与调节根毛和花粉管的生长。科研人员采用含有GFP(绿色荧光蛋白)基因的载体构建了ROPGFP的质粒，并利用农杆菌转化法将其转入植物体内。下列有关叙述正确的是(　　)
A．外源基因在植物体中是否表达可通过绿色荧光来检测
B．GFP基因在植物体中表达说明生物体共用一套密码子表
C．ROPGFP质粒的构建需用到限制酶、DNA聚合酶和载体等工具
D．利用农杆菌转化法可以侵染大多数单子叶植物
答案　AB
解析　导入的载体含有GFP(绿色荧光蛋白)基因，可以指导绿色荧光蛋白合成，若在植物体中表达，则可以表现出绿色荧光，A正确；GFP基因在植物体中表达，GFP基因在受体中也能转录、翻译为绿色荧光蛋白，说明供体和受体都共用一套密码子表，B正确；ROPGFP质粒的构建需用到限制酶、DNA连接酶和载体等工具，C错误；由于农杆菌对大多数单子叶植物没有感染能力，因此将目的基因导入这类植物的时候，一般采用的方法有基因枪法和花粉管通道法，D错误。
9．(2023·江苏淮安高三模拟)下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息，将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述错误的是(　　)

注：AmpR：氨苄青霉素抗性基因；TetR：四环素抗性基因。
A．应选择的限制酶组合是酶F和酶G
B．所选用的受体菌含有AmpR和TetR基因
C．用含氨苄青霉素的培养基筛选出的是含重组质粒的受体菌
D．同时用三种限制酶处理图中质粒，电泳后可得到4个条带
答案　BC
解析　为避免切割后DNA片段的自身环化，又保留质粒上的标记基因，切割时应选择的限制酶组合是酶F和酶G，A正确；所选用的受体菌不能含有AmpR和TetR基因，以便于对含有目的基因的受体菌进行选择，B错误；用含氨苄青霉素的培养基筛选出的有导入重组质粒的受体菌和导入原质粒的受体菌，C错误；据题图分析可知，同时用三种限制酶处理图中质粒，因酶E有两个作用位点，故将质粒切割成了4个DNA片段，电泳后可得到4个条带，D正确。
10．某中学生物兴趣小组进行DNA的粗提取与鉴定时，选取如下实验材料：新鲜花椰菜、体积分数为95%的冷酒精、研磨液(含表面活性剂SDS、DNA酶抑制剂EDTA、适量的NaCl)、0.015 mol·L－1的NaCl溶液、二苯胺试剂、蒸馏水以及其他必要实验器材。下列有关选择实验材料的理由，叙述正确的是(　　)
A．新鲜的花椰菜DNA含量丰富，易获取
B．SDS具有瓦解植物细胞质膜的作用
C．DNA溶于冷酒精，而蛋白质等杂质不溶
D．EDTA可减少提取过程DNA的降解
答案　ABD
三、非选择题
11．(2021·江苏，23)某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：

(1)目的基因的扩增
①提取真菌细胞__________________，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。
②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致__________________。
③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除Taq酶以外的各成分混合后，加热到80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增。下列叙述正确的有____________。
A．Taq酶最适催化温度范围为50～60 ℃
B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸
D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性
(2)重组质粒的构建
①将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进____________________，形成A－m结合体。将A－m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及________酶等，完成质粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A－m仍能被SmaⅠ切开，则SmaⅠ的酶切位点可能在________________________________________________________________________。
(3)融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A－m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是________________
________________________________________________________________________。
②若通过抗原－抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明_________________，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。
答案　(1)①RNA　②蛋白M上不含tag标签　③BC　(2)①黏性末端碱基互补配对　DNA连接　②基因m的连接处、基因m的内部　(3)①受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因，可以长成菌落　②融合基因表达(或重组质粒A－m构建成功)
解析　(1)①以逆转录获得cDNA的方式，要先从真菌细胞中提取基因m转录出来的mRNA。②从构建好的重组质粒上看，tag序列位于目的基因下游，若基因m的转录产物mRNA上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，则不会对tag序列的转录产物继续进行翻译，蛋白M上就不含tag标签。③从题干信息可知，“80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增”，故Taq酶最适催化温度范围为94 ℃左右，A错误；PCR 反应的最初加热过程中，样品温度上升到70 ℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在Taq酶的作用下延伸，结果会导致引物错配形成的产物的扩增，影响反应的特异性，热启动可减少引物错配形成的产物的扩增，提高反应的特异性，B正确；DNA分子复制具有方向性，都是从5′端向3′端延伸，C正确；Taq酶没有特异性，与普通的DNA聚合酶相比，Taq酶更耐高温，D错误。故选BC。(2)①从图上看，载体A只有一个SmaⅠ的酶切位点，故被SmaⅠ切开后，载体由环状变为链状DNA，将SmaⅠ切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载体A与添加同源序列的m的黏性末端碱基互补配对。将A－m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。②重组质粒中，载体A被Sma Ⅰ切开的位置已经与基因m相连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的重组质粒A－m仍能被Sma Ⅰ切开，则Sma Ⅰ的酶切位点可能在基因m的连接处或基因m内部。
(3)①筛选目的菌株的机理：导入了质粒A－m的目的菌株由于含有URA3基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而URA3基因缺失型酵母则不能存活。②若通过抗原－抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，位于tag标签上游的基因m应该正常表达，说明融合基因表达(或重组质粒A－m构建成功)。
12．下图是利用工程菌(大肠杆菌)生产人生长激素的实验流程。所用的pBR322质粒含有限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和Hind Ⅲ的切点各一个，且三种酶切割形成的末端各不相同，而AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。请回答以下相关问题：

(1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有________的因子。过程①所用到的组织细胞是________________，③过程的目的是________________________，⑤过程常用________处理大肠杆菌。
(2)如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ对图中质粒进行切割，形成的DNA片段种类有________种，这些种类的DNA片段中含有完整氨苄青霉素抗性基因的DNA片段和四环素抗性基因的DNA片段分别有______种和_______种。
(3)如果只用限制酶PstⅠ切割目的基因和质粒，完成过程④、⑤后(受体大肠杆菌不含AmpR、TetR)，将三角瓶内的大肠杆菌先接种到甲培养基上，形成菌落后用无菌牙签挑取甲培养基上的单个菌落，分别接种到乙和丙两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图乙、丙所示。接种到甲培养基上的目的是筛选____________________的大肠杆菌；接种到乙培养基上的大肠杆菌菌落，能存活的大肠杆菌体内导入的是____________________。含有目的基因的大肠杆菌在培养基乙和丙上的生存情况是__________________________。
答案　(1)调控作用　人垂体组织细胞　将平末端处理为黏性末端　Ca2＋　(2)9　3　3　
(3)含四环素抗性基因　完整的pBR322质粒(或含有AmpR、TetR的质粒)　在丙中能存活，在乙中不能存活
解析　(2)(后面的→均按照顺时针方向)假设PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ三种酶的切点分别用1、2、3表示。一种酶分别酶切时，一共可以得到3种片段1→1、2→2、3→3；任意两种酶分别同时酶切时，可得到1→2、2→1、2→3、3→2、1→3、3→1六种片段；三种酶同时酶切时，可得到1→2、2→3、3→1三种片段。综上所述，共计9种不同的片段(1→1、1→2、1→3、2→1、2→2、2→3、3→1、3→2、3→3)。其中片段3→2、2→2、3→3共3种含有完整氨苄青霉素抗性基因，片段2→1、2→2、1→1共3种含有完整四环素抗性基因。