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高考生物二轮复习难点精讲精练专题12 微生物的培养和应用（含解析）
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这是一份高考生物二轮复习难点精讲精练专题12 微生物的培养和应用（含解析），共30页。
2020届高考生物难点及易错题精讲精练
专题12 微生物的培养和应用
【难点精讲】
一、微生物的实验室培养和无菌技术
例题：(2018·全国Ⅱ，37)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：
(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具___________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是_____________________________________________________________________________。
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能_______________________。在照射前，适量喷洒________，可强化消毒效果。
(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是____________________。
【答案】 (1)可以 (2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少 (3)破坏DNA结构 消毒液 (4)氯气 (5)未将锅内冷空气排尽
【解析】 (1)干热灭菌是指将物品放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃条件下加热1～2 h。耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等，可采用干热灭菌的方法。(2)巴氏消毒法是在70～75 ℃条件下煮30 min或在80 ℃条件下煮15 min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养物质损失较少。(3)接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30 min，紫外线能破坏微生物的DNA结构，以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以强化消毒效果。(4)自来水通常是用氯气进行消毒的。(5)在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是锅内原有的冷空气没有排尽。
【难点突破】
无菌技术
(1)含义：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
(2)常用方法
大肠杆菌的纯化培养
(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
→→→→→
(2)纯化大肠杆菌的方法
①平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
②稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
(3)菌种的保存方法
①对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。
②对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。
变式训练：（2018·河北衡水中学七调）下列表格是某公司研发的一种培养大肠杆菌的培养基配方，请结合所学知识，回答下列相关问题。
成分
含量
蛋白胨
10.0 g
乳糖
5.0 g
蔗糖
5.0 g
K2HPO4
2.0 g
显色剂（伊红美蓝）
0.2 g
琼脂
12.0 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL
（1）根据用途划分，该培养基属于 培养基，若要分离能分解尿素的细菌，需对培养基做出的最关键的调整是 ，若还需鉴定分解尿素的细菌.需做出的调整是 。
（2）从培养基的成分上看，大肠杆菌的同化类型为 。该培养基能否用于分离筛选出大肠杆菌？为什么？_______________________________。
（3）在实验室培养微生物时，获得纯净培养物的关键是 ，紫外线可对空气进行灭菌的原因是_____________________________________________________。
（4）某同学尝试纯化大肠杆菌，其中一个平板的菌落分布如上图，推测该同学接种时可能的操作失误是__________________________________________。
【解析】 （1）伊红美蓝是鉴定大肠杆菌的试剂，因此该培养基从用途上分属于鉴别培养基；若要分离能分解尿素的细菌，则需要保证培养基中以尿素为唯一氮源，即将蛋白胨换成尿素；鉴定分解尿素的细菌，需要使用酚红指示剂。（2）大肠杆菌需要从培养基中获得碳源，因此其同化作用类型是异养型；由于表格中的培养基中的碳源种类很多，可供多种微生物生存，因此该培养基不能用于分离筛选出大肠杆菌。（3）微生物培养时，关键是防止外来杂菌的感染；空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能让蛋白质变性，同时还能破坏DNA的结构。
（4）由题图可知，接种时该同学采用的是稀释涂布平板法，但菌落比较集中，没有很好地分散开来，可能是涂布不均匀导致的。
【答案】 （1）鉴别 将蛋白胨换成尿素 将伊红美蓝换成酚红指示剂 （2）异养型 不能，原因是培养基中的碳源种类很多，可供多种微生物生存 （3）防止外来杂菌的感染 紫外线能使蛋白质变性，还能破坏DNA的结构 （4）涂布不均匀
二、 目标微生物的筛选与鉴定
例题：（2017·全国卷Ⅰ，37）某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：
（1）有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生 。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是________________________________，但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是______________（答出两点即可）。
（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择 （填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”）作为氮源，不选择其他两组的原因是
________________________________________________________________。
（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有
_________________________________________________（答出两点即可）。
【答案】 （1）脲酶 分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物 为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料 （2）尿素 其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用 （3）为细菌生长提供无机盐离子，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
【解析】 （1）只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。能分解尿素的细菌是一种分解者，属于异养型生物，不能以尿素的分解产物CO2作为碳源。能分解尿素的细菌可以以葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是：一方面可氧化分解为细胞生命活动提供能量，另一方面其代谢中间产物可为多种有机物的合成提供原料。
（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择以尿素作为唯一氮源的选择培养基，而其他两组都含有含氮物质NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3不能起到筛选作用。
（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用：KH2PO4和Na2HPO4构成缓冲液，可维持培养基的pH相对稳定；KH2PO4和Na2HPO4能为微生物生长提供无机盐离子。
【难点突破】
分离微生物的原理与措施
（1）原理：自然环境中的微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物应首先采用的方法是将单个的微生物与其他微生物分离，再给该微生物提供合适的营养和条件，使其生长成为可见的群体。
（2）常用措施
①接种过程中尽量使微生物分散开来，如平板划线法、稀释涂布平板法。
②运用选择培养基的作用特点，在培养基中添加某种特定的物质，抑制不需要的微生物的生长，促进所需微生物的生长。
选择培养基四种常见制备方法或实例
变式训练：(2018·山东、湖北部分重点中学高考冲刺模拟)从土壤中分离尿素分解菌和纤维素分解菌，具有下列类似的操作过程：
(1)在过程④的选择培养基是________培养基(填“固体”或“液体”)，过程⑧的选择培养基是________培养基(填“固体”或“液体”)。④的具体操作是________________；⑧的具体操作是________________________________________________________________________。
(2)在过程③样品梯度稀释后，一般只将稀释度为104～106倍的菌液分别接种到3个平板培养基上。接种的常用方法为____________________________。
(3)过程⑩采用______________________的鉴别方法较简单。周围出现透明圈但不能100%确定为纤维素分解菌的菌落，原因是_________________________________________。
【答案】 (1)固体 液体 以尿素为唯一氮源 以纤维素为唯一碳源 (2)稀释涂布平板(或平板划线)法 (3)倒平板时加入刚果红染液 不分解纤维素(如分解刚果红)的微生物菌落也可能出现透明圈
【解析】 (1)将微生物接种在固体培养基上培养，才能形成菌落，可见，过程④的选择培养基是固体培养基。进行梯度稀释并接种前要进行过程⑧所示的选择培养，因此过程⑧的选择培养基是液体培养基。④选择培养的目的是筛选尿素分解菌，所以具体的操作是以尿素为唯一氮源；⑧选择培养的目的是筛选纤维素分解菌，所以⑧的具体操作是以纤维素为唯一碳源。(2)常采用稀释涂布平板(或平板划线)法，将稀释度为104～106倍的菌液分别接种到3个平板培养基上。(3)刚果红可与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维素水解后的纤维二糖和葡萄糖发生颜色反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。可见，过程⑩采用倒平板时加入刚果红染液的鉴别方法较简单。由于不分解纤维素(如分解刚果红)的微生物菌落也可能出现透明圈，所以周围出现透明圈的菌落，不能100%确定为纤维素分解菌的菌落。
【真题回顾】
一、单选题
1．（2019·北京高考真题）筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解淀粉，培养平板经稀碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈（如图），实验结果见下表。
菌种
菌落直径：C（mm）
透明圈直径：H（mm）
H/C
细菌Ⅰ
5.1
11.2
2.2
细菌Ⅱ
8.1
13.0
1.6
有关本实验的叙述，错误的是
A．培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质
B．筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布
C．以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外
D．H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异
【答案】C
【解析】
培养基一般含有碳源、氮源、水、无机盐和生长因子等成分，A正确；筛选淀粉分解菌时，需要对菌液进行一系列的梯度稀释，再将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基上进行培养，B正确；由题意可知，以上两种菌均会产生透明圈，说明两种菌均可以产生淀粉酶并分泌到细胞外分解淀粉，C错误；淀粉分解菌的H/C越大，说明其产生的淀粉酶分解的淀粉相对越多，可说明该淀粉分解菌分解淀粉的能力越强，D正确。因此，本题答案选C。
2．（2019·江苏省高考真题）下列关于产纤维素酶菌分离及运用的叙述，不合理的是
A．筛选培养基中应含有大量的葡萄糖或蔗糖提供生长营养
B．可从富含腐殖质的林下土壤中筛选产纤维素酶菌
C．在分离平板上长出的菌落需进一步确定其产纤维素酶的能力
D．用产纤维素酶菌发酵处理农作物秸秆可提高其饲用价值
【答案】A
【解析】
应该用以纤维素为唯一碳源的培养基筛选纤维素分解菌，只有纤维素分解菌能够存活，A错误；木材、秸秆中富含纤维素，故可以从富含腐殖质的林下土壤中筛选产纤维素酶菌，B正确；用以纤维素为唯一碳源的培养基筛选纤维素分解菌后，为了确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，C正确；用产纤维素酶菌发酵处理农作物秸秆，可以把纤维素分解成葡萄糖，提高饲用价值，D正确。故选A。
3．（2019·江苏省高考真题）下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是
A．培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌
B．接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧
C．接种后的培养皿要倒置，以防培养污染
D．菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基
【答案】A
【解析】
接种室、接种箱等常用紫外线消毒法处理，接种环等常用灼烧灭菌法处理，吸管、培养皿等常用干热灭菌法处理，培养基及多种器材用高压蒸汽灭菌法处理，A错误；为了防止杂菌污染，每次接种前后，接种环都要进行灼烧灭菌，B正确；接种后，培养皿需要倒置，以防皿盖上水珠落入培养基造成污染，C正确；分离菌种可以用平板划线法和稀释涂布平板法，后者还可以用于微生物的计数，所用培养基为固体培养基，D正确。故选A。
二、综合题
4．（2019·全国高考真题）已知一种有机物X（仅含有C、H两种元素）不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌（目标菌）。
Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X（5g/L）。
Ⅱ号培养基：氯化钠（5g/L），硝酸铵（3g/L），其他无机盐（适量），X（15g/L）。
Ⅲ号培养基：氯化钠（5g/L），硝酸铵（3g/L），其他无机盐（适量）。X（45g/L）。
回答下列问题。
（1）在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是___________。Ⅱ、Ⅲ号培养基为微生物提供碳源的有机物是_________。
（2）若将土壤悬浮液种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会_________，其原因是_________。
（3）Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是______________。
（4）假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供_________和_________。
【答案】牛肉膏、蛋白胨 X 下降 不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖 稀释涂布平板法 能量 合成其他物质的原料
【解析】
（1）氮源是微生物生长需要的一类营养物质，是含氮化合物，可为微生物的生长提供氮元素，牛肉膏、蛋白胨来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质，因此在1号培养基中，可为微生物提供氮源的是牛肉膏、蛋白胨。碳源也是微生物生长所需要的一类营养物质，可为微生物的生长提供碳元素，而有机物均含碳元素，II、III号培养基均含有有机物X，因此，II、III号培养基为微生物的生长提供碳源的均为有机物X。
（2）由于II号培养基含有的碳源只有有机物X，因此若将土壤悬浮液接种在II号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌由于无法获得碳源而无法增殖导致其比例减少。
（3）微生物的接种方法很多，最常用的有平板划线法与稀释涂布平板法，由于稀释涂布平板法中，稀释度足够高的菌液经涂布培养后，在培养基表面形成的一个菌落是由菌液中的一个活菌繁殖而来，所以常用来进行微生物的计数。
（4）丙酮酸参与有氧呼吸的第二阶段，能被分解产生能量，且丙酮酸可作为许多物质合成的中间产物，因此其可为微生物的生长提供能量和合成其他物质的原料。
5．（2018·全国高考真题）将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。
回答下列问题：
（1）M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制___________的生长，加入了链霉素的培养基属于___________培养基。
（2）M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有___________（答出两点即可）。氮源进入细菌后，可参与合成的生物大分子有___________（答出两点即可）。
（3）若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产生淀粉酶的微生物，加入的显色剂是___________，该方法能筛选出产生淀粉酶微生物的原理___________。
（4）甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：
甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133。
乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。
有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是：_____________________。
【答案】细菌 选择 碳源、无机盐 蛋白质、DNA、RNA 碘液 淀粉遇碘显蓝色，产淀粉酶菌落周围淀粉被水解，形成透明圈 乙同学的结果中，1个平板的计数与另2个相差悬殊，结果的重复性差
【解析】
（1）M培养基若用于真菌的筛选，说明M培养基能满足真菌的生长，而能抑制其它微生物的生长，链霉素是一种抗生素，可以抑制细菌的生长。加入了链霉素的培养基能筛选出真菌，该培养基属于选择培养基。
（2）微生物生长需要多种营养物质除氮源外，还需要碳源、无机盐、水以及特殊营养物质等。氮元素是蛋白质和核酸等生物大分子的组成元素，因此氮源进入细胞后,可参与合成的生物大分子有蛋白质和核酸（DNA、RNA）。
（3）淀粉与碘液会变成蓝色，筛选产淀粉酶的微生物，依据淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈，再根据透明圈，来筛选产淀粉酶的微生物。
（4）乙同学结果不合理，因为1个平板的计数结果与另2个相差悬殊较大，结果的重复性差，不能简单的用其平均数作为最终结果。
6．（2018·全国高考真题）回答下列与酵母菌有关的问题：
（1）分离培养酵母菌通常使用____________（填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”）培养基，该培养基应采用________灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后会观察到菌落，菌落的含义是_______________。
（2）酵母菌液体培养时，若通入氧气，可促进______________（填“菌体快速增殖”、“乙醇产生”或“乳酸产生”）；若进行厌氧培养，可促进_________（填“菌体快速增殖”、“乙醇产生”或“乳酸产生”）。
（3）制作面包时，为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松软的原因是______________________。
【答案】麦芽汁琼脂 高压蒸汽 由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体 菌体快速增殖 乙醇产生 酵母菌分解葡萄糖会产生CO2，CO2使面包松软
【解析】
（1）麦芽汁琼脂培养基的碳氮比较高，而且含糖量高，更适合酵母菌；该培养基应采用高压蒸汽灭菌法灭菌；若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后可观察到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。
（2）酵母菌液体培养时，若通入氧气，进行有氧呼吸产生H2O和CO2，释放能量多，细胞增殖快；若进行无氧培养，进行无氧呼吸，产生酒精和CO2，释放能量少，增殖慢。
（3）制作面包时，在面粉中添加一定量的酵母菌，因酵母菌可以分解面粉中的葡萄糖，产生二氧化碳，二氧化碳是气体，遇热膨胀而形成小孔，使得面包松软多孔。
7．（2019·全国高考真题）回答下列与细菌培养相关的问题。
（1）在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是_____________（填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”）。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是________。硝化细菌在没有碳源的培养基上______（填“能够”或“不能”）生长，原因是____________。
（2）用平板培养细菌时一般需要将平板____________（填“倒置”或“正置”）。
（3）单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是____________。
（4）有些使用后的培养基在丢弃前需要经过____________处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
【答案】蛋白胨 不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同 能够 硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源 倒置 在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征 灭菌
【解析】
（1）葡萄糖只能为细菌提供碳源，硝酸钠为细菌提供无机盐，而蛋白胨既可以为细菌碳源，也可以为细菌提供氮源；由于不同的细菌生长繁殖的最适宜pH是不同的，因此制备培养基时要根据所培养的细菌的不同来调节培养基的pH；硝化细菌属于化能自养型微生物，其可以利用氨氧化释放的能量将空气中的二氧化碳固定为有机物，因此硝化细菌可以在无碳培养基中生长。
（2）用平板培养细菌时，一般需要将平板倒置培养，以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
（3）由于每一大类微生物都有其独特的细胞形态，因而其菌落形态特征也各异，因此根据菌落的形态、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物。
（4）有些使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
三、实验题
8．（2019·全国高考真题）物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌（目标菌）。回答下列问题。
（1）要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是_________。
（2）在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落（如图所示）。如果要得到目标菌，应该选择________菌落进一步纯化，选择的依据是________。
（3）土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即_______。
（4）该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶（酶E）。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加_________，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明___________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明___________。
【答案】W 乙 乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W 将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源 缓冲液 缓冲液不能降解W 酶E与天然酶降解W的能力相近
【解析】
（1）该研究小组的目标菌是能够降解物质W的细菌，而物质W是一种含氮有机物，故可作筛选培养基中的氮源。
（2）研究小组的目标菌，是能够降解物质W的细菌，培养基中乙菌落的周围出现透明圈，说明乙菌落能够降解物质W，故乙菌落为该小组的目标细菌。
（3）目标菌能够利用空气中的氮气作为氮源，故选用的筛选培养基不添加氮源，能够在无氮源的培养基上生存的细菌便是目的细菌，故实验操作为：将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。
（4）①C处作为空白对照，要排除作为溶剂的缓冲液对实验可能造成的影响，故需要在C处滴加缓冲液，且保持滴加量相同；②培养基中的透明圈表示物质W被降解的情况，若C处不出现透明圈，则说明缓冲液不能降解物质W；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明物质W被降解的程度相近，即酶E与天然酶降解物质W的能力相近。
9．（2018·全国高考真题）在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：
（1）在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________（填“可以”或“不可以”）放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
（2）牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是________。
（3）密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能________，在照射前，适量喷洒_________，可强化消毒效果。
（4）水厂供应的自来水通常是经过________（填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”）消毒的。
（5）某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是__________________________。
【答案】可以 在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少 破坏DNA结构 消毒液 氯气 未将锅内冷空气排尽
【解析】
（1）能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
（2）煮沸消毒法即在100℃煮沸5～6 min可以杀死微生物细胞和一部分芽孢；巴氏消毒法即在70～75℃煮30 min或在80℃煮15min，可以杀死微生物，并且保证营养物质不被破坏。因此，与煮沸消毒法相比，牛奶消毒常采用的巴氏消毒法或高温瞬时消毒法的优点是在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。
（3）因紫外线能破坏DNA结构，所以密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒。在照射前，适量喷洒消毒液，可强化消毒效果。
（4）通常乙醇消毒是75%的酒精，有气味，影响水质，不适宜消毒自来水；高锰酸钾本身有颜色，消毒后溶液呈紫红色，无法使用；因此水厂供应的自来水通常是经过氯气消毒的。
（5）采用高压蒸汽灭菌时，锅内的水加热煮沸，将其中原有的冷空气彻底排除后才能将锅密闭。如果未将锅内冷空气排尽，则会出现压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度的现象。
10．（2018·江苏省高考真题）酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废中醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。下图所示为操作流程，请回答下列问题:
（1）配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的_________，及时对培养基进行分装，并进行_________灭菌。
（2）取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约_________（在25℃、50℃或80℃中选择）的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。
（3）挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④进行划线。下列叙述合理的有_________。（多选）
a.为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌
b.划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落
c.挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量
d.可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株
（4）分离培养酵母菌通常使用_________（填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”）培养基，步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和_________供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1 000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型（1mm×lmm×O.1mm）血细胞计数板计数5个中格中的细胞数，理论上_________色细胞的个数应不少于_________，才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。
【答案】 pH 高压蒸汽 50℃ a、b、d 麦芽汁琼脂 氧气 无 30
【解析】
（1）配制培养基的操作步骤为称量→溶化→定容→调pH→培养基的分装→包扎→灭菌，因此微生物的培养基配制好后应该先调节pH，再分装。常见的灭菌方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、灼烧灭菌。培养基适宜用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。
（2）在步骤③中，待培养基冷却至50℃左右时进行倒平板。
（3）在划线过程中，接种针、接种环使用前都必须灭菌，以防止杂菌污染，a正确；划线时应避免划破培养基表面，否则将不能形成正常菌落，b正确；该实验的目的是获得利用工业废甲醇作为碳源的酵母菌，不需要测定酵母菌中的甲醇含量，c错误；培养基中的甲醇浓度越高，此种培养基中得以生存的酵母菌利用甲醇的能力越强，因此可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株，d正确。
（4）酵母菌通过有氧呼吸大量繁殖，因此为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和氧气供应；台盼蓝是大分子物质，不能将活细胞染色，再根据25×16型的血球计数板：1毫升悬液中待测标本（菌体）总数=80小方格内菌体数/80×400×104×稀释倍数。而台盼蓝与菌液等体积加入，因此要达到每毫升3×109个活细胞的预期密度，理论上无色细胞数应该不少于（3×109）÷（1000×2×104×400÷80）=30个。
【新题精练】
一、单选题
1．（2020·山东省济南外国语学校高三其他）用纸片扩散法测定某病原菌对各种抗生素敏感性的实验，是在某病原菌均匀分布的平板上，铺设含有不同种抗生素的纸片后进行培养。图示为培养的结果，其中抑菌圈是在纸片周围出现的透明区域。下列分析正确的是
A．在图示固体培养基上可用平板划线法或涂布法接种病原菌
B．未出现抑菌圈可能是病原菌与抗生素接触后发生抗性变异
C．形成的抑菌圈较小的原因可能是微生物对药物较敏感
D．不同抗生素在平板上的扩散速度不同会对实验结果造成影响
【答案】D
【解析】
A、在图示固体培养基上用稀释涂布平板法进行接种病原菌，A错误；
B、病原菌发生抗性变异在接触之前，B错误；
C、微生物对药物较敏感形成的抑菌圈应较大，C错误；
D、纸片所含的药物吸取平板中的水分溶解后便不断向纸片周围区域扩散，不同抗生素在平板上的扩散速度不同会对实验结果造成影响，D正确。
故选D。
2．（2020·山东省高三二模）尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。下列有关土壤中尿素分解菌的分离和培养的叙述，正确的是（ ）
A．培养基中加入尿素作为唯一碳源，该培养基是鉴别培养基
B．测定土壤中分解尿素的细菌数量和测定土壤中其他细菌的数量可采用相同的稀释度
C．细菌合成的脲酶能将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高
D．利用稀释涂布平板法可以直接完成土壤中分解尿素的细菌的分离计数和纯化鉴定
【答案】C
【解析】
A、培养基中加入尿素作为唯一碳源，该培养基是选择培养基，A错误；
B、因为土壤中各类微生物的数量不同，故为获得不同类型的微生物，要按不同的稀释倍数进行分离，B错误；
C、细菌合成的脲酶能将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，可加入酚红指示剂进行检测，C正确；
D、鉴定分解尿素的细菌应该用加酚红的鉴别培养基，D错误。
故选C。
3．（2020·江苏省高三一模）下图表示培养和纯化X细菌的部分操作步骤。有关叙述正确的是（ ）
A．步骤①操作时，倒好平板后应立即将其倒置，防止冷凝水落在培养基上造成污染
B．步骤②接种环和试管口应先在火焰上灼烧，接种环冷却后再放入试管中蘸取菌液
C．步骤③沿多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后可根据出现的单个菌落计数
D．步骤④将培养皿放在恒温培养箱中培养，一段时间后所得到的都是X细菌菌落
【答案】B
【解析】
A、倒好平板后需待培养基凝固再倒置，A错误；
B、接种环和试管口的灼烧都属于无菌操作，接种环冷却后才能沾取菌液，B正确；
C、计数一般使用稀释涂布平板法，平板划线法不适合，C错误；
D、步骤④培养后得到的菌落可能还有杂菌，需要进一步纯化，D错误。
故选B。
4．（2020·江苏省高三其他）穿刺接种是用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。下列叙述错误的是（ ）
A．与平板划线法所用的培养基相比，穿刺接种所需的培养基添加的琼脂较少
B．穿刺接种可用于样品中活菌数量统计
C．穿刺接种可用于保藏厌氧菌种或研究微生物的运动
D．穿刺接种可用于鉴定微生物的呼吸作用类型
【答案】B
【解析】
A、由于是半固体培养基，因此与平板划线法所用的培养基相比，穿刺接种的培养基添加的琼脂较少，A正确；
B、穿刺接种不可用于样品中活菌数量统计，因为接种是不定量的，B错误；
C、由于是半固体培养基，所以穿刺接种可用于保藏厌氧菌种或研究微生物的运动，C正确；
D、由于穿刺接种后微生物可以分布于培养基的各个部位，因此可用于鉴定微生物的呼吸作用类型，D正确。
故选B。
二、综合题
（2020·上海高三二模）人类历史发展至今，已经历过数次微生物传染病的爆发流行，远者如1347～1353年间席卷欧洲的黑死病（鼠疫），近者如2020新年伊始由新型冠状病毒SARS-CoV2引发的COVID-19。
5．图1所示为鼠疫的传播过程。由图可知，鼠疫的传播途径是 。
A．空气传播 B．接触传播
C．媒介物传播 D．病媒传播
6．鼠疫杆菌的研究中常用到龙胆紫血液琼脂培养基，其配方如表所示：
成分
蛋白胨
牛肉粉
氯化钠
龙胆紫
琼脂
浓度（g/L)
10．0
3．0
5．0
0．01
15．0
注：（1）调节pH至70-7．2使用；（2）灭菌冷却后每1000mL培养基应加入lmL脱纤维兔血。
脱纤维兔血可刺激鼠疫杆菌的生长，而龙胆紫则抑制其他杂菌的生长。关于该培养基的说法，正确的是 。
A．此为液体培养基 B．此为通用培养基
C．调节pH应在灭菌前进行 D．灭菌的条件应设定为100℃，30min
7．在18～22℃条件下鼠疫噬菌体只裂解鼠疫杆菌而不裂解其他菌。某实验室拟用鼠疫噬菌体裂解试验对其分离到的疑似鼠疫杆菌菌株进行鉴定，所得结果如图2所示并由此确定该菌株为鼠疫杆菌。据此推测，鼠疫噬菌体裂解试验的步骤为：
（1）在酒精灯火焰附近使用___________（选填“平板划线法”或“涂布平板法”）接种待鉴定的菌株；
（2）在图2所示平板上___________（选填“A点”或“B点”）位置滴加含鼠疫噬菌体的溶液；
（3）将平板___________（选填“倒置”或“直立”）放置，置于20℃条件下培养24h。
（说明：“倒置”指平板与水平面平行，接种面朝下；“直立”指平板与水平面垂直）
[COVID-19和SARS-CoV2]
2020年3月4日，国家卫健委发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》在原有确诊标准（病毒核酸检测）上新增了血淸SARS-CoV2特异性IgM和IgG抗体作为病原学诊断标准。
8．关于IgM和IgG，下列说法正确的是 。
A．二者均存在于内环境中
B．浆细胞和记忆B细胞均可分泌
C．高尔基体是二者的合成场所
D．二者参与的特异性免疫称细胞免疫
9．如图所示为SARS-CoV2感染后发展示意图，下列说法正确的是 。
A．COVID-19易感人群的血清中检测不到SARS-CoV2特异性IgM和IgG
B．患者感染SARS-CoV2后体内产生IgM和IgG属于先天免疫
C．隐性感染者体内也会产生SARS-COV2特异性IgM和IgG
D．IgG抗体的产生晚于IgM抗体，但在体内的持续存在时间长于IgM抗体
E.IgG抗体阳性可提示近期感染，而IgM抗体阳性可提示感染时间较长的既往感染
【答案】
5．D
6．C
7． 平板划线法 A点 直立
8．A
9．ACD
【解析】
1、一些生物能携带病原体，并将其直接或间接地传播给人，使人得传染病，这类生物被称作病媒生物，这种传播传染病的途径被称为病媒传播。常见的可以被病媒生物传播的传染病很多，如鼠疫、流行性出血热、流行性乙型脑炎（乙脑）、人粒细胞无形体病等。
2、常用的微生物接种方法为：平板划线法和稀释涂布平板法。
5．由图可知，鼠疫的传播是由于跳蚤叮咬鼠时携带了鼠疫杆菌，并在叮咬人的过程中将鼠疫杆菌传播给人，所以鼠疫的传播途径是病媒传播，即D正确，ABC错误。
故选D。
6．A、此培养基含有琼脂，为固体培养基，A错误；
B、此培养基中的脱纤维兔血可刺激鼠疫杆菌的生长，而龙胆紫则抑制其他杂菌的生长，故此培养基为选择培养基，不是通用培养基，B错误；
C、培养基制备过程中调节pH应在灭菌前进行，C正确；
D、该培养基的灭菌应为高压蒸汽灭菌，灭菌的条件应设定为121℃，15min，D错误。
故选C。
7．（1）根据图2可知，微生物的接种方法为平板划线法。
（2）（3）根据在18～22℃条件下鼠疫噬菌体只裂解鼠疫杆菌而不裂解其他菌可知，在图2所示平板上A点位置滴加含鼠疫噬菌体的溶液；将平板直立放置，使含鼠疫噬菌体的溶液沿着垂直方向向下渗透，置于20℃条件下培养24h，可出现图示中的平板中间不含鼠疫杆菌的结果。
8．A、抗体主要存在于血浆、组织液等内环境中，A正确；
B、只有浆细胞能产生抗体，记忆B细胞不能产生抗体，B错误；
C、抗体的本质是蛋白质，合成场所是核糖体，C错误；
D、抗体参与的特异性免疫称体液免疫，D错误。
故选A。
9．A、由图可知，潜伏期的2周内血清中没有抗体，所以COVID-19易感人群的血清中可能检测不到SARS-CoV2特异性IgM和IgG，A正确；
B、患者感染SARS-CoV2后体内产生IgM和IgG属于后天产生的特异性免疫，B错误；
C、由图可知，隐性感染者体内也会产生SARS-COV2特异性IgM和IgG，C正确；
D、由图可知，IgG抗体的产生晚于IgM抗体，但在体内的持续存在时间长于IgM抗体，D正确；
E、根据IgG抗体的产生晚于IgM抗体，但在体内的持续存在时间长于IgM抗体，可知IgM抗体阳性可提示近期感染，而IgG抗体阳性可提示感染时间较长的既往感染，E错误。
故选ACD。
10．（2020·湖北省高三二模）随着人们生活质量的提高，餐饮含油脂废水的排放量大量增加，合理处置油脂废水也成为新的课题。已知芽孢杆菌中有多种分解油脂产酸的菌种，科研人员欲采用下列流程筛选出能高效分解油脂的微生物。
菌种取样→分离培养→菌株的筛选→形态特征观察和生理生化反应鉴定回答下列问题：
（1）选取饭店附近排污渠的含油脂废水作为样本，采样约10g，立即装于试管内，此试管使用前需要经过________处理。
（2）样品分离培养前，一般需要将菌液进行________处理，然后吸取0．2ml菌液涂布到营养琼脂培养基平板上，置于37℃恒温培养箱内培养24h，记录菌落总数。将分离出的菌株按照菌落________等表观特征初步分类。
（3）上述步骤筛选出的菌株分别接种到含“花生油”的琼脂培养基平板上，37℃恒温培养箱中培养24h，筛选出油脂降解菌，培养基中“花生油”为菌种繁殖提供________。在该培养基还需要加入中性红染料（中性红为脂溶性染料，遇酸为红色，遇碱为黄色），挑选菌株要挑选显________降解圈的菌株，并且选颜色较________（填“深或浅”）的为宜。
（4）实际操作中，由于油脂易聚集成液滴，常在培养基中加入2-3滴乳化剂使油脂分散均匀，鉴定效果更好，试分析原因________________。
【答案】灭菌 稀释 形状、大小、隆起程度和颜色 碳源和能源 红色 深 油脂乳化后均匀分散在培养基表面，分解油脂的微生物产生的降解圈更为明显，便于快速分离和鉴定
【解析】
（1）微生物实验需要无菌操作，所以试管使用前需要经过灭菌处理。
（2）菌液一般需要先经过稀释处理，再进行涂布。不同微生物菌落的形状、大小、隆起程度和颜色不同，所以可以根据菌落的特征初步分类。
（3）花生油的主要成分是脂肪，所以为菌种提供碳源和能源。脂肪可以被分解为甘油和脂肪酸，使培养基呈酸性，所以选择红色降解圈的菌株，并且颜色较深的脂肪酸含量越高，说明分解能力越强。
（4）油脂乳化后均匀分散在培养基表面，分解油脂的微生物产生的降解圈更为明显，便于快速分离和鉴定摸索与可以在培养基中加入2-3滴乳化剂。
11．（2020·辽宁省高三其他）大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一类细菌，含有2000种以上的蛋白质；大肠杆菌的数量是检测自来水是否受粪便污染的最直接的指标。回答下列问题：
（1）利用凝胶色谱法分离提取到的部分大肠杆菌蛋白质时，等样品完全进入凝胶层后，加入pH为7.0、浓度为20mmol/L的___________ 到适当高度进行洗脱，结果甲蛋白质先洗脱出来，乙蛋白质后洗脱出来，则相对分子质量较大的是_____蛋白质。
（2）通过滤膜法可以测定自来水中大肠杆菌的数目：一定体积的自来水样过滤后，将滤膜放在伊红-美蓝培养基（主要成分包括：蛋白胨、NaCl、琼脂、乳糖、伊红和美蓝水溶液）上培养，大肠杆菌的代谢产物能与伊红-美蓝反应，使菌落呈黑色。根据培养基上菌落的数目，计算出大肠杆菌的数量。
①伊红-美蓝培养基属于____（填“选择”或“鉴别”）培养基，蛋白胨的作用有 _________。
②在微生物培养过程中，常用的灭菌方法有灼烧灭菌、________和高压蒸汽灭菌。配制伊红-美蓝培养基时，乳糖需要单独在压力为70kPa，温度为115℃灭菌20min，原因是__________。接种前通常需要检测固体培养基是否灭菌合格，检测方法是___________。
③滤膜法是根据培养基上菌落的数目来推测样品中的活菌数，其原理是_______________。
【答案】磷酸缓冲液 甲 鉴别 提供碳源、氮源、维生素 干热灭菌 乳糖在高温下会破坏 将未接种的培养基在适宜的条件下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落出现 （当样品中细菌浓度低时，）培养基表面生长的一个菌落来源于样品中的一个活菌
【解析】
（1）利用凝胶色谱法分离蛋白质时，等样品完全进入凝胶层后，需要加入pH为7.0、浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度进行洗脱，若甲蛋白质先洗脱出来，乙蛋白质后洗脱出来，说明甲蛋白质的相对分子质量较大。
（2）①伊红-美蓝可以将大肠杆菌染成深紫色，因此伊红-美蓝培养基属于鉴别培养基，其中蛋白胨可以为大肠杆菌提供碳源、氮源、维生素。
②微生物培养过程中，常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。由于乳糖在高温下会破坏，所以在配制伊红-美蓝培养基时，乳糖需要单独在压力为70kPa，温度为115℃灭菌20min。接种前通常需要将未接种的培养基在适宜的条件下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落出现，以检测固体培养基是否灭菌合格。
③滤膜法是根据培养基上菌落的数目来推测样品中的活菌数，其原理是培养基表面生长的一个菌落来源于样品中的一个活菌。
12．（2020·江苏省江浦高级中学高三二模）土壤中含有能将难溶性磷酸盐转变成植物可以吸收利用的可溶性磷的优良解磷菌株Q。下图1表示制备固体培养基过程中的某操作，图2是科研人员从土壤中分离出菌株Q的部分过程示意图。
请回答下列问题：
（1）图1所示操作称为__________________，待平板冷凝后__________，以防止__________________。
（2）图2所示接种方法是_______________________。在3个平板上分别接入0．1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上菌落数分别是38、42、40，则1 g土壤中的活菌数约为__________________个。
（3）图是某同学利用不同于图2方法分离菌株Q的示意图。下列对其操作及结果的叙述错误的有_______。
a．操作前用无水乙醇对双手进行消毒处理
b．划线时沾有菌种的接种环不能插入培养基中
c．只有在⑤区域中才能得到所需菌落
d．整个过程需要对接种环进行6次灼烧
（4）固体培养基中难溶性磷酸盐在菌株Q的作用下溶解，会在菌落周围形成透明圈（如下图所示），透明圈直径（D）与菌落直径（d）的比值（D/d）代表微生物溶解难溶磷酸盐的能力大小。下表是初步筛选出的三种优良解磷菌株。
菌株
透明圈直径(D)
菌落直径(d)
M—3—01
18．8
12．3
B3—5—6
20．7
8．0
T—4—01
9．1
6．5
根据实验结果分析，溶解难溶性磷酸盐能力最强的菌株是______________。该菌种分离纯化后，常用______________________法进行长期保存。
【答案】倒平板 倒置 皿盖上的冷凝水落入培养基 稀释涂布平板法 4×108 a、c B3－5－6 甘油管藏
【解析】
（1）图1所示操作称为倒平板，待平板冷凝后需要将其倒置，以防止皿盖上的冷凝水落入培养基，对培养基造成污染。
（2）图2所示接种方法是稀释涂布平板法，1g土壤共稀释了106倍。平板上生长的平均菌落数=(38+42+40)÷3=40个，每克样品中的菌株数=(C÷V)×M=(40÷0.1)×106=4×108个。
（3）a、操作前用70%的酒精对接种人员的双手进行消毒处理，a错误；
b、划线时沾有菌种的接种环不应划破培养基表面，b正确；
c、在5个区域中，只要有单个活细菌，通过培养即可获得所需菌落，c错误；
d、在每次划线前和最后一次划线结束均需对接种环灭菌，因此需要对接种环进行6次灼烧，d正确。
故选ac。
（4）根据实验原理中“透明圈直径（D）与菌落直径（d）的比值（D/d）代表微生物溶解难溶磷酸盐的能力大小”，结合表格数据可以确定溶解难溶性磷酸盐能力最强的菌株是B3-5-6。对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏法。
13．（2020·四川省高三三模）大肠杆菌是动物肠道中的正常寄居菌。少数种类的大肠杆菌在一定条件下会使人患病，如肠道出血性大肠杆菌可使人腹泻和便血，严重时危及生命。出血性大肠杆菌在添加血液的平板培养基上生长时，红细胞被细菌破坏而褪色，导致菌落周围形成透明圈。下图表示从污染的食物中分离和提纯该细菌的操作流程。请回答问题：
（1）细菌从肉汤培养基获得的营养成分有______________。
（2）据操作流程可知，将细菌接种在血平板上的方法是______________，接种完毕后要灼烧接种工具的目的是为了______________。
（3）研究细菌的致病性，先要获得纯度较高的细菌蛋白，凝胶色谱法是分离蛋白质的常用方法，在装填凝胶柱时不得有气泡产生，因为______________ ；若肠道出血性大肠杆菌的A蛋白质比B蛋白质后洗脱出来，则______________的相对分子质量较大。
（4）纯化后的细菌蛋白可以用_________测定分子量大小，在此过程中加入的SDS掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使得______________完全取决于分子的大小。
【答案】碳源、氮源、水、无机盐等 平板划线法 避免污染环境和感染操作者 气泡会扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果 B蛋白 电泳法 电泳迁移率
【解析】
（1）肉汤培养基中含有水分、无机盐、蛋白质等物质，因此可为微生物提供的营养成分有：碳源、氮源、水和无机盐。
（2）据操作流程可知，图中的接种工具是接种环，故将细菌接种在血平板上的方法是平板划线法；接种完毕后要灼烧接种工具的目的是避免污染环境和感染操作者。
（3）研究细菌的致病性，先要获得纯度较高的细菌蛋白，凝胶色谱法是分离蛋白质的常用方法，由于气泡会扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果，故在装填凝胶柱时不得有气泡产生；凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质，相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长，移动的速度慢，相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，因此若肠道出血性大肠杆菌的A蛋白质比B蛋白质后洗脱出来，则B蛋白的相对分子质量较大。
（4）纯化后的细菌蛋白可以用凝胶电泳法测定分子量大小；用凝胶电泳法测定蛋白质分子量时，需要在凝胶中加入SDS，目的是消除净电荷对迁移率的影响（或掩盖不同种蛋白间的电荷差别），使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
14．（2020·江苏省高三其他）镇江香醋是我国传统固态酿造食醋的典型代表，具有醇香浓厚、回味悠长的特点。由于发酵过程的半开放模式，来源于酿造原料、生产过程和操作器械的大量微生物会进入发酵液中，与酿醋功能微生物构成竞争性生长。科研人员研究酿醋主要功能微生物的发酵上清液对杂菌生长的抑制效果，并初步研究了抑菌活性物质的种类和特性，下面为部分研究结果。请分析回答：
（1）镇江香醋酿制的主要功能微生物除乳酸杆菌外，还有________等，整个实验过程中所需培养皿、接种用具均需________处理。
（2）科研人员先将10 mL含2%琼脂的肉汤培养基倾注平板，待凝固后将无菌牛津杯(一种不锈钢管)嵌于培养基中。接着将冷却至50℃，含0．75%琼脂糖的肉汤培养基与大肠杆菌混合后倾注于牛津杯中，以制备含菌培养皿。待培养基冷却后取出牛津杯，每孔注入150 μL待测样品，置于37℃下过夜培养，测定抑菌圈大小，得到如上图1所示结果。
①上述制备含大肠杆菌的培养皿所采用的接种方法是________________(选填稀释涂布平板法或平板划线法)。
②每孔分别注入的是灭菌的超纯水和发酵2天、4天、10天、20天后提取的发酵上清液，得到了图1中0～4的抑菌圈，说明______________________________________。
（3）研究结果发现，发酵微生物上清液如果加热处理，抑菌圈会减小，由此可见，该上清液含有________(选填热敏感/耐热的或热敏感和耐热的)的抑菌活性物质。
（4）实验过程中，如使用不同的蛋白酶处理发酵微生物上清液，得到如上图2所示结果，由此可以推测，部分抑菌物质的化学本质是________，另一部分具有抑菌效果的化学物质主要是________。
（5） 结合上述研究结果，试分析酿醋主要微生物的生长和代谢对环境微生物的这种抑制作用的意义是______________________________________。
【答案】醋酸杆菌 无菌 稀释涂布平板法 发酵初期抑菌物质较少，随着发酵时间延长，微生物的代谢产物增多，抑菌效果逐渐增强 热敏感和耐热的 蛋白质 有机酸（醋酸、乳酸等） 维持自身功能和结构的相对稳定，保证醋酸发酵的正常进行
【解析】
（1）工业发酵在保证无菌操作的前提下，一般都是涉及多种微生物的，酿醋需要醋酸菌，所以镇江香醋酿制的主要功能微生物除乳酸杆菌外，还有醋酸杆菌等，整个实验过程中所需培养皿、接种用具均需无菌（灭菌）处理。
（2）①由题干可知，上述制备含大肠杆菌的培养皿所采用的接种方法是稀释涂布平板法。②每孔分别注人的是超纯水和发酵2天、4天、10天、20天后提取的发酵上清液，得到了图1中0~4的抑菌圈，说明发酵初期抑菌物质较少，随着发酵吋间延长，微生物的代谢产物增多，抑菌效果逐渐增强。
（3）研究结果发现，发酵微生物上清液如果加热处理，抑菌圈会减小，由此可见，加热并没有完全去除灭菌物质，则该上清液含有热敏感、耐热的抑菌活性物质。
（4）实验过程中，如使用不同的蛋白酶处理发酵微生物上清液，得到如图2所示结果，由此可以推测，部分抑菌物质的化学本质是蛋白质（可被高温阻断的），另部分具有抑菌效果的化学物质主要是发酵产生的有机酸。
（5）结合上述研究结果，酿醋主要微生物的生长和代谢对环境微生物的这种抑制作用的意义是维持自身功能和结构的相对稳定，保证醋酸发酵的正常进行。
15．（2020·江苏省高三其他）水产或家畜养殖污水中含有大量的类固醇，而这类化合物会对人体造成危害，且不易被降解，而丛毛单胞菌是日前用于降解这类有机污染物常用的需氧型菌种。由于抗生素的滥用，污水中含有大量的抗生素残余，这些抗生素会强烈地抑制丛毛单胞菌的作用，从而降低污水处理的效果。结合所学知识，回答下列问题：
（1）从自然界中分离出能够降解类固醇化合物的丛毛单胞菌时，一般会从鱼塘废水或附近土壤进行取样，其原因是___________________________________________________________。
（2）筛选丛毛单胞菌时，通常以________________为唯一碳源的选择培养基进行筛选。制备这一培养基的一般步骤包括计算、称量，溶化、______________、倒平板。
（3）研究人员从含抗生素的污水中分离出了3个抗生素耐药型丛毛单胞菌菌株（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）为了测试其在高浓度抗生素条件下的增殖能力，他们进行了如下实验：
①将等量的三种菌株，分别接种到添加了高浓度抗生素和一定量类固醇物质的细菌液体培养基中，测量计算初始培养液中种群密度的相对值，之后不断通入无菌空气，在适宜的条件下进行培养；
②接种培养开始后100小时内，每20小时取样一次，每次每种菌株重复3次计数，常利用_______________法接种进行活菌数的测定，从初始到实验结束，实验过程中需测定计数的样品次数为____________。在测定菌群密度相对值的同时，每次取样还要测定菌液中固醇类物质的浓度。
③下面的曲线图是根据实验过程中所获得的数据绘制而成。
a．与菌株Ⅱ、Ⅲ相比，实验进行到60小时左右时，造成菌株I种群密度下降的原因有______________（填序号）。
①种内斗争加剧 ②营养物质积累
③营养物质消耗 ④代谢废物消耗
b．从污水处理的角度分析及研究数据来看，菌株____________更适合作为污水中类固醇污染物的处理，理由是___________________________________________________________________________。
【答案】这些区域内类固醇物质较多，容易富集丛毛单胞菌 类固醇 （调pH、）灭菌 稀释涂布平板 45 ①③ Ⅱ 在实验时间内，种群数量持续保持递增趋势，同时对类固醇物质的代谢能力最强
【解析】
（1）由于鱼塘废水或附近土壤中类固醇物质较多，容易富集丛毛单胞菌，所以从自然界中分离出能够降解类固醇化合物的丛毛单胞菌时，一般会从鱼塘废水或附近土壤进行取样。
（2）根据选择培养基的作用筛选丛毛单胞菌时，通常以类固醇为唯一碳源的选择培养基进行筛选。配置培养基的一般步骤包括计算、称量，溶化、灭菌、倒平板。
（3）②在对菌种进行分离与计数时常利用稀释涂布平板法接种进行活菌数的测定；根据题中的操作信息，三种菌株，100小时内每20小时取样一次，共取样5次，每次每种菌株重复3次计数，因此从初始到实验结束，实验过程中需测定计数的样品次数为45次。
③a、与菌株Ⅱ、Ⅲ相比，实验进行到60小时左右时，菌株I种群密度大幅下降，推测可能的原因是：随着种群数量的增多及营养物质的消耗，种内斗争加剧，以及有害代谢废物的积累等。
b、根据图甲及图乙中的数据综合分析，菌株Ⅱ在实验时间内，种群数量持续保持递增趋势，同时对类固醇物质的代谢能力最强，因此其更适合作为污水中类固醇污染物的处理。
2020届高考生物难点及易错题精讲精练
专题12 微生物的培养和应用
【难点精讲】
一、微生物的实验室培养和无菌技术
例题：(2018·全国Ⅱ，37)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：
(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具___________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是_____________________________________________________________________________。
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能_______________________。在照射前，适量喷洒________，可强化消毒效果。
(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是____________________。
【答案】 (1)可以 (2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少 (3)破坏DNA结构 消毒液 (4)氯气 (5)未将锅内冷空气排尽
【解析】 (1)干热灭菌是指将物品放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃条件下加热1～2 h。耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等，可采用干热灭菌的方法。(2)巴氏消毒法是在70～75 ℃条件下煮30 min或在80 ℃条件下煮15 min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养物质损失较少。(3)接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30 min，紫外线能破坏微生物的DNA结构，以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以强化消毒效果。(4)自来水通常是用氯气进行消毒的。(5)在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是锅内原有的冷空气没有排尽。
【难点突破】
无菌技术
(1)含义：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
(2)常用方法
大肠杆菌的纯化培养
(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
→→→→→
(2)纯化大肠杆菌的方法
①平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
②稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
(3)菌种的保存方法
①对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。
②对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。
变式训练：（2018·河北衡水中学七调）下列表格是某公司研发的一种培养大肠杆菌的培养基配方，请结合所学知识，回答下列相关问题。
成分
含量
蛋白胨
10.0 g
乳糖
5.0 g
蔗糖
5.0 g
K2HPO4
2.0 g
显色剂（伊红美蓝）
0.2 g
琼脂
12.0 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL
（1）根据用途划分，该培养基属于 培养基，若要分离能分解尿素的细菌，需对培养基做出的最关键的调整是 ，若还需鉴定分解尿素的细菌.需做出的调整是 。
（2）从培养基的成分上看，大肠杆菌的同化类型为 。该培养基能否用于分离筛选出大肠杆菌？为什么？_______________________________。
（3）在实验室培养微生物时，获得纯净培养物的关键是 ，紫外线可对空气进行灭菌的原因是_____________________________________________________。
（4）某同学尝试纯化大肠杆菌，其中一个平板的菌落分布如上图，推测该同学接种时可能的操作失误是__________________________________________。
【解析】 （1）伊红美蓝是鉴定大肠杆菌的试剂，因此该培养基从用途上分属于鉴别培养基；若要分离能分解尿素的细菌，则需要保证培养基中以尿素为唯一氮源，即将蛋白胨换成尿素；鉴定分解尿素的细菌，需要使用酚红指示剂。（2）大肠杆菌需要从培养基中获得碳源，因此其同化作用类型是异养型；由于表格中的培养基中的碳源种类很多，可供多种微生物生存，因此该培养基不能用于分离筛选出大肠杆菌。（3）微生物培养时，关键是防止外来杂菌的感染；空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能让蛋白质变性，同时还能破坏DNA的结构。
（4）由题图可知，接种时该同学采用的是稀释涂布平板法，但菌落比较集中，没有很好地分散开来，可能是涂布不均匀导致的。
【答案】 （1）鉴别 将蛋白胨换成尿素 将伊红美蓝换成酚红指示剂 （2）异养型 不能，原因是培养基中的碳源种类很多，可供多种微生物生存 （3）防止外来杂菌的感染 紫外线能使蛋白质变性，还能破坏DNA的结构 （4）涂布不均匀
二、 目标微生物的筛选与鉴定
例题：（2017·全国卷Ⅰ，37）某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：
（1）有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生 。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是________________________________，但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是______________（答出两点即可）。
（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择 （填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”）作为氮源，不选择其他两组的原因是
________________________________________________________________。
（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有
_________________________________________________（答出两点即可）。
【答案】 （1）脲酶 分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物 为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料 （2）尿素 其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用 （3）为细菌生长提供无机盐离子，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
【解析】 （1）只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。能分解尿素的细菌是一种分解者，属于异养型生物，不能以尿素的分解产物CO2作为碳源。能分解尿素的细菌可以以葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是：一方面可氧化分解为细胞生命活动提供能量，另一方面其代谢中间产物可为多种有机物的合成提供原料。
（2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择以尿素作为唯一氮源的选择培养基，而其他两组都含有含氮物质NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3不能起到筛选作用。
（3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用：KH2PO4和Na2HPO4构成缓冲液，可维持培养基的pH相对稳定；KH2PO4和Na2HPO4能为微生物生长提供无机盐离子。
【难点突破】
分离微生物的原理与措施
（1）原理：自然环境中的微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物应首先采用的方法是将单个的微生物与其他微生物分离，再给该微生物提供合适的营养和条件，使其生长成为可见的群体。
（2）常用措施
①接种过程中尽量使微生物分散开来，如平板划线法、稀释涂布平板法。
②运用选择培养基的作用特点，在培养基中添加某种特定的物质，抑制不需要的微生物的生长，促进所需微生物的生长。
选择培养基四种常见制备方法或实例
变式训练：(2018·山东、湖北部分重点中学高考冲刺模拟)从土壤中分离尿素分解菌和纤维素分解菌，具有下列类似的操作过程：
(1)在过程④的选择培养基是________培养基(填“固体”或“液体”)，过程⑧的选择培养基是________培养基(填“固体”或“液体”)。④的具体操作是________________；⑧的具体操作是________________________________________________________________________。
(2)在过程③样品梯度稀释后，一般只将稀释度为104～106倍的菌液分别接种到3个平板培养基上。接种的常用方法为____________________________。
(3)过程⑩采用______________________的鉴别方法较简单。周围出现透明圈但不能100%确定为纤维素分解菌的菌落，原因是_________________________________________。
【答案】 (1)固体 液体 以尿素为唯一氮源 以纤维素为唯一碳源 (2)稀释涂布平板(或平板划线)法 (3)倒平板时加入刚果红染液 不分解纤维素(如分解刚果红)的微生物菌落也可能出现透明圈
【解析】 (1)将微生物接种在固体培养基上培养，才能形成菌落，可见，过程④的选择培养基是固体培养基。进行梯度稀释并接种前要进行过程⑧所示的选择培养，因此过程⑧的选择培养基是液体培养基。④选择培养的目的是筛选尿素分解菌，所以具体的操作是以尿素为唯一氮源；⑧选择培养的目的是筛选纤维素分解菌，所以⑧的具体操作是以纤维素为唯一碳源。(2)常采用稀释涂布平板(或平板划线)法，将稀释度为104～106倍的菌液分别接种到3个平板培养基上。(3)刚果红可与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维素水解后的纤维二糖和葡萄糖发生颜色反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。可见，过程⑩采用倒平板时加入刚果红染液的鉴别方法较简单。由于不分解纤维素(如分解刚果红)的微生物菌落也可能出现透明圈，所以周围出现透明圈的菌落，不能100%确定为纤维素分解菌的菌落。
【真题回顾】
一、单选题
1．（2019·北京高考真题）筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解淀粉，培养平板经稀碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈（如图），实验结果见下表。
菌种
菌落直径：C（mm）
透明圈直径：H（mm）
H/C
细菌Ⅰ
5.1
11.2
2.2
细菌Ⅱ
8.1
13.0
1.6
有关本实验的叙述，错误的是
A．培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质
B．筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布
C．以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外
D．H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异
【答案】C
【解析】
培养基一般含有碳源、氮源、水、无机盐和生长因子等成分，A正确；筛选淀粉分解菌时，需要对菌液进行一系列的梯度稀释，再将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基上进行培养，B正确；由题意可知，以上两种菌均会产生透明圈，说明两种菌均可以产生淀粉酶并分泌到细胞外分解淀粉，C错误；淀粉分解菌的H/C越大，说明其产生的淀粉酶分解的淀粉相对越多，可说明该淀粉分解菌分解淀粉的能力越强，D正确。因此，本题答案选C。
2．（2019·江苏省高考真题）下列关于产纤维素酶菌分离及运用的叙述，不合理的是
A．筛选培养基中应含有大量的葡萄糖或蔗糖提供生长营养
B．可从富含腐殖质的林下土壤中筛选产纤维素酶菌
C．在分离平板上长出的菌落需进一步确定其产纤维素酶的能力
D．用产纤维素酶菌发酵处理农作物秸秆可提高其饲用价值
【答案】A
【解析】
应该用以纤维素为唯一碳源的培养基筛选纤维素分解菌，只有纤维素分解菌能够存活，A错误；木材、秸秆中富含纤维素，故可以从富含腐殖质的林下土壤中筛选产纤维素酶菌，B正确；用以纤维素为唯一碳源的培养基筛选纤维素分解菌后，为了确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，C正确；用产纤维素酶菌发酵处理农作物秸秆，可以把纤维素分解成葡萄糖，提高饲用价值，D正确。故选A。
3．（2019·江苏省高考真题）下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是
A．培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌
B．接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧
C．接种后的培养皿要倒置，以防培养污染
D．菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基
【答案】A
【解析】
接种室、接种箱等常用紫外线消毒法处理，接种环等常用灼烧灭菌法处理，吸管、培养皿等常用干热灭菌法处理，培养基及多种器材用高压蒸汽灭菌法处理，A错误；为了防止杂菌污染，每次接种前后，接种环都要进行灼烧灭菌，B正确；接种后，培养皿需要倒置，以防皿盖上水珠落入培养基造成污染，C正确；分离菌种可以用平板划线法和稀释涂布平板法，后者还可以用于微生物的计数，所用培养基为固体培养基，D正确。故选A。
二、综合题
4．（2019·全国高考真题）已知一种有机物X（仅含有C、H两种元素）不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌（目标菌）。
Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X（5g/L）。
Ⅱ号培养基：氯化钠（5g/L），硝酸铵（3g/L），其他无机盐（适量），X（15g/L）。
Ⅲ号培养基：氯化钠（5g/L），硝酸铵（3g/L），其他无机盐（适量）。X（45g/L）。
回答下列问题。
（1）在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是___________。Ⅱ、Ⅲ号培养基为微生物提供碳源的有机物是_________。
（2）若将土壤悬浮液种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会_________，其原因是_________。
（3）Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是______________。
（4）假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供_________和_________。
【答案】牛肉膏、蛋白胨 X 下降 不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖 稀释涂布平板法 能量 合成其他物质的原料
【解析】
（1）氮源是微生物生长需要的一类营养物质，是含氮化合物，可为微生物的生长提供氮元素，牛肉膏、蛋白胨来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质，因此在1号培养基中，可为微生物提供氮源的是牛肉膏、蛋白胨。碳源也是微生物生长所需要的一类营养物质，可为微生物的生长提供碳元素，而有机物均含碳元素，II、III号培养基均含有有机物X，因此，II、III号培养基为微生物的生长提供碳源的均为有机物X。
（2）由于II号培养基含有的碳源只有有机物X，因此若将土壤悬浮液接种在II号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌由于无法获得碳源而无法增殖导致其比例减少。
（3）微生物的接种方法很多，最常用的有平板划线法与稀释涂布平板法，由于稀释涂布平板法中，稀释度足够高的菌液经涂布培养后，在培养基表面形成的一个菌落是由菌液中的一个活菌繁殖而来，所以常用来进行微生物的计数。
（4）丙酮酸参与有氧呼吸的第二阶段，能被分解产生能量，且丙酮酸可作为许多物质合成的中间产物，因此其可为微生物的生长提供能量和合成其他物质的原料。
5．（2018·全国高考真题）将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。
回答下列问题：
（1）M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制___________的生长，加入了链霉素的培养基属于___________培养基。
（2）M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有___________（答出两点即可）。氮源进入细菌后，可参与合成的生物大分子有___________（答出两点即可）。
（3）若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产生淀粉酶的微生物，加入的显色剂是___________，该方法能筛选出产生淀粉酶微生物的原理___________。
（4）甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：
甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133。
乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。
有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是：_____________________。
【答案】细菌 选择 碳源、无机盐 蛋白质、DNA、RNA 碘液 淀粉遇碘显蓝色，产淀粉酶菌落周围淀粉被水解，形成透明圈 乙同学的结果中，1个平板的计数与另2个相差悬殊，结果的重复性差
【解析】
（1）M培养基若用于真菌的筛选，说明M培养基能满足真菌的生长，而能抑制其它微生物的生长，链霉素是一种抗生素，可以抑制细菌的生长。加入了链霉素的培养基能筛选出真菌，该培养基属于选择培养基。
（2）微生物生长需要多种营养物质除氮源外，还需要碳源、无机盐、水以及特殊营养物质等。氮元素是蛋白质和核酸等生物大分子的组成元素，因此氮源进入细胞后,可参与合成的生物大分子有蛋白质和核酸（DNA、RNA）。
（3）淀粉与碘液会变成蓝色，筛选产淀粉酶的微生物，依据淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈，再根据透明圈，来筛选产淀粉酶的微生物。
（4）乙同学结果不合理，因为1个平板的计数结果与另2个相差悬殊较大，结果的重复性差，不能简单的用其平均数作为最终结果。
6．（2018·全国高考真题）回答下列与酵母菌有关的问题：
（1）分离培养酵母菌通常使用____________（填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”）培养基，该培养基应采用________灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后会观察到菌落，菌落的含义是_______________。
（2）酵母菌液体培养时，若通入氧气，可促进______________（填“菌体快速增殖”、“乙醇产生”或“乳酸产生”）；若进行厌氧培养，可促进_________（填“菌体快速增殖”、“乙醇产生”或“乳酸产生”）。
（3）制作面包时，为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松软的原因是______________________。
【答案】麦芽汁琼脂 高压蒸汽 由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体 菌体快速增殖 乙醇产生 酵母菌分解葡萄糖会产生CO2，CO2使面包松软
【解析】
（1）麦芽汁琼脂培养基的碳氮比较高，而且含糖量高，更适合酵母菌；该培养基应采用高压蒸汽灭菌法灭菌；若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后可观察到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。
（2）酵母菌液体培养时，若通入氧气，进行有氧呼吸产生H2O和CO2，释放能量多，细胞增殖快；若进行无氧培养，进行无氧呼吸，产生酒精和CO2，释放能量少，增殖慢。
（3）制作面包时，在面粉中添加一定量的酵母菌，因酵母菌可以分解面粉中的葡萄糖，产生二氧化碳，二氧化碳是气体，遇热膨胀而形成小孔，使得面包松软多孔。
7．（2019·全国高考真题）回答下列与细菌培养相关的问题。
（1）在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是_____________（填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”）。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是________。硝化细菌在没有碳源的培养基上______（填“能够”或“不能”）生长，原因是____________。
（2）用平板培养细菌时一般需要将平板____________（填“倒置”或“正置”）。
（3）单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是____________。
（4）有些使用后的培养基在丢弃前需要经过____________处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
【答案】蛋白胨 不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同 能够 硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源 倒置 在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征 灭菌
【解析】
（1）葡萄糖只能为细菌提供碳源，硝酸钠为细菌提供无机盐，而蛋白胨既可以为细菌碳源，也可以为细菌提供氮源；由于不同的细菌生长繁殖的最适宜pH是不同的，因此制备培养基时要根据所培养的细菌的不同来调节培养基的pH；硝化细菌属于化能自养型微生物，其可以利用氨氧化释放的能量将空气中的二氧化碳固定为有机物，因此硝化细菌可以在无碳培养基中生长。
（2）用平板培养细菌时，一般需要将平板倒置培养，以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
（3）由于每一大类微生物都有其独特的细胞形态，因而其菌落形态特征也各异，因此根据菌落的形态、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物。
（4）有些使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。
三、实验题
8．（2019·全国高考真题）物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌（目标菌）。回答下列问题。
（1）要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是_________。
（2）在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落（如图所示）。如果要得到目标菌，应该选择________菌落进一步纯化，选择的依据是________。
（3）土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即_______。
（4）该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶（酶E）。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。
①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加_________，三处滴加量相同。
②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明___________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明___________。
【答案】W 乙 乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W 将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源 缓冲液 缓冲液不能降解W 酶E与天然酶降解W的能力相近
【解析】
（1）该研究小组的目标菌是能够降解物质W的细菌，而物质W是一种含氮有机物，故可作筛选培养基中的氮源。
（2）研究小组的目标菌，是能够降解物质W的细菌，培养基中乙菌落的周围出现透明圈，说明乙菌落能够降解物质W，故乙菌落为该小组的目标细菌。
（3）目标菌能够利用空气中的氮气作为氮源，故选用的筛选培养基不添加氮源，能够在无氮源的培养基上生存的细菌便是目的细菌，故实验操作为：将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。
（4）①C处作为空白对照，要排除作为溶剂的缓冲液对实验可能造成的影响，故需要在C处滴加缓冲液，且保持滴加量相同；②培养基中的透明圈表示物质W被降解的情况，若C处不出现透明圈，则说明缓冲液不能降解物质W；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明物质W被降解的程度相近，即酶E与天然酶降解物质W的能力相近。
9．（2018·全国高考真题）在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：
（1）在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________（填“可以”或“不可以”）放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
（2）牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是________。
（3）密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能________，在照射前，适量喷洒_________，可强化消毒效果。
（4）水厂供应的自来水通常是经过________（填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”）消毒的。
（5）某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是__________________________。
【答案】可以 在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少 破坏DNA结构 消毒液 氯气 未将锅内冷空气排尽
【解析】
（1）能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
（2）煮沸消毒法即在100℃煮沸5～6 min可以杀死微生物细胞和一部分芽孢；巴氏消毒法即在70～75℃煮30 min或在80℃煮15min，可以杀死微生物，并且保证营养物质不被破坏。因此，与煮沸消毒法相比，牛奶消毒常采用的巴氏消毒法或高温瞬时消毒法的优点是在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。
（3）因紫外线能破坏DNA结构，所以密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒。在照射前，适量喷洒消毒液，可强化消毒效果。
（4）通常乙醇消毒是75%的酒精，有气味，影响水质，不适宜消毒自来水；高锰酸钾本身有颜色，消毒后溶液呈紫红色，无法使用；因此水厂供应的自来水通常是经过氯气消毒的。
（5）采用高压蒸汽灭菌时，锅内的水加热煮沸，将其中原有的冷空气彻底排除后才能将锅密闭。如果未将锅内冷空气排尽，则会出现压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度的现象。
10．（2018·江苏省高考真题）酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废中醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。下图所示为操作流程，请回答下列问题:
（1）配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的_________，及时对培养基进行分装，并进行_________灭菌。
（2）取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约_________（在25℃、50℃或80℃中选择）的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。
（3）挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④进行划线。下列叙述合理的有_________。（多选）
a.为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌
b.划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落
c.挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量
d.可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株
（4）分离培养酵母菌通常使用_________（填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”）培养基，步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和_________供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1 000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型（1mm×lmm×O.1mm）血细胞计数板计数5个中格中的细胞数，理论上_________色细胞的个数应不少于_________，才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。
【答案】 pH 高压蒸汽 50℃ a、b、d 麦芽汁琼脂 氧气 无 30
【解析】
（1）配制培养基的操作步骤为称量→溶化→定容→调pH→培养基的分装→包扎→灭菌，因此微生物的培养基配制好后应该先调节pH，再分装。常见的灭菌方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、灼烧灭菌。培养基适宜用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。
（2）在步骤③中，待培养基冷却至50℃左右时进行倒平板。
（3）在划线过程中，接种针、接种环使用前都必须灭菌，以防止杂菌污染，a正确；划线时应避免划破培养基表面，否则将不能形成正常菌落，b正确；该实验的目的是获得利用工业废甲醇作为碳源的酵母菌，不需要测定酵母菌中的甲醇含量，c错误；培养基中的甲醇浓度越高，此种培养基中得以生存的酵母菌利用甲醇的能力越强，因此可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株，d正确。
（4）酵母菌通过有氧呼吸大量繁殖，因此为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和氧气供应；台盼蓝是大分子物质，不能将活细胞染色，再根据25×16型的血球计数板：1毫升悬液中待测标本（菌体）总数=80小方格内菌体数/80×400×104×稀释倍数。而台盼蓝与菌液等体积加入，因此要达到每毫升3×109个活细胞的预期密度，理论上无色细胞数应该不少于（3×109）÷（1000×2×104×400÷80）=30个。
【新题精练】
一、单选题
1．（2020·山东省济南外国语学校高三其他）用纸片扩散法测定某病原菌对各种抗生素敏感性的实验，是在某病原菌均匀分布的平板上，铺设含有不同种抗生素的纸片后进行培养。图示为培养的结果，其中抑菌圈是在纸片周围出现的透明区域。下列分析正确的是
A．在图示固体培养基上可用平板划线法或涂布法接种病原菌
B．未出现抑菌圈可能是病原菌与抗生素接触后发生抗性变异
C．形成的抑菌圈较小的原因可能是微生物对药物较敏感
D．不同抗生素在平板上的扩散速度不同会对实验结果造成影响
【答案】D
【解析】
A、在图示固体培养基上用稀释涂布平板法进行接种病原菌，A错误；
B、病原菌发生抗性变异在接触之前，B错误；
C、微生物对药物较敏感形成的抑菌圈应较大，C错误；
D、纸片所含的药物吸取平板中的水分溶解后便不断向纸片周围区域扩散，不同抗生素在平板上的扩散速度不同会对实验结果造成影响，D正确。
故选D。
2．（2020·山东省高三二模）尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。下列有关土壤中尿素分解菌的分离和培养的叙述，正确的是（ ）
A．培养基中加入尿素作为唯一碳源，该培养基是鉴别培养基
B．测定土壤中分解尿素的细菌数量和测定土壤中其他细菌的数量可采用相同的稀释度
C．细菌合成的脲酶能将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高
D．利用稀释涂布平板法可以直接完成土壤中分解尿素的细菌的分离计数和纯化鉴定
【答案】C
【解析】
A、培养基中加入尿素作为唯一碳源，该培养基是选择培养基，A错误；
B、因为土壤中各类微生物的数量不同，故为获得不同类型的微生物，要按不同的稀释倍数进行分离，B错误；
C、细菌合成的脲酶能将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，可加入酚红指示剂进行检测，C正确；
D、鉴定分解尿素的细菌应该用加酚红的鉴别培养基，D错误。
故选C。
3．（2020·江苏省高三一模）下图表示培养和纯化X细菌的部分操作步骤。有关叙述正确的是（ ）
A．步骤①操作时，倒好平板后应立即将其倒置，防止冷凝水落在培养基上造成污染
B．步骤②接种环和试管口应先在火焰上灼烧，接种环冷却后再放入试管中蘸取菌液
C．步骤③沿多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后可根据出现的单个菌落计数
D．步骤④将培养皿放在恒温培养箱中培养，一段时间后所得到的都是X细菌菌落
【答案】B
【解析】
A、倒好平板后需待培养基凝固再倒置，A错误；
B、接种环和试管口的灼烧都属于无菌操作，接种环冷却后才能沾取菌液，B正确；
C、计数一般使用稀释涂布平板法，平板划线法不适合，C错误；
D、步骤④培养后得到的菌落可能还有杂菌，需要进一步纯化，D错误。
故选B。
4．（2020·江苏省高三其他）穿刺接种是用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。下列叙述错误的是（ ）
A．与平板划线法所用的培养基相比，穿刺接种所需的培养基添加的琼脂较少
B．穿刺接种可用于样品中活菌数量统计
C．穿刺接种可用于保藏厌氧菌种或研究微生物的运动
D．穿刺接种可用于鉴定微生物的呼吸作用类型
【答案】B
【解析】
A、由于是半固体培养基，因此与平板划线法所用的培养基相比，穿刺接种的培养基添加的琼脂较少，A正确；
B、穿刺接种不可用于样品中活菌数量统计，因为接种是不定量的，B错误；
C、由于是半固体培养基，所以穿刺接种可用于保藏厌氧菌种或研究微生物的运动，C正确；
D、由于穿刺接种后微生物可以分布于培养基的各个部位，因此可用于鉴定微生物的呼吸作用类型，D正确。
故选B。
二、综合题
（2020·上海高三二模）人类历史发展至今，已经历过数次微生物传染病的爆发流行，远者如1347～1353年间席卷欧洲的黑死病（鼠疫），近者如2020新年伊始由新型冠状病毒SARS-CoV2引发的COVID-19。
5．图1所示为鼠疫的传播过程。由图可知，鼠疫的传播途径是 。
A．空气传播 B．接触传播
C．媒介物传播 D．病媒传播
6．鼠疫杆菌的研究中常用到龙胆紫血液琼脂培养基，其配方如表所示：
成分
蛋白胨
牛肉粉
氯化钠
龙胆紫
琼脂
浓度（g/L)
10．0
3．0
5．0
0．01
15．0
注：（1）调节pH至70-7．2使用；（2）灭菌冷却后每1000mL培养基应加入lmL脱纤维兔血。
脱纤维兔血可刺激鼠疫杆菌的生长，而龙胆紫则抑制其他杂菌的生长。关于该培养基的说法，正确的是 。
A．此为液体培养基 B．此为通用培养基
C．调节pH应在灭菌前进行 D．灭菌的条件应设定为100℃，30min
7．在18～22℃条件下鼠疫噬菌体只裂解鼠疫杆菌而不裂解其他菌。某实验室拟用鼠疫噬菌体裂解试验对其分离到的疑似鼠疫杆菌菌株进行鉴定，所得结果如图2所示并由此确定该菌株为鼠疫杆菌。据此推测，鼠疫噬菌体裂解试验的步骤为：
（1）在酒精灯火焰附近使用___________（选填“平板划线法”或“涂布平板法”）接种待鉴定的菌株；
（2）在图2所示平板上___________（选填“A点”或“B点”）位置滴加含鼠疫噬菌体的溶液；
（3）将平板___________（选填“倒置”或“直立”）放置，置于20℃条件下培养24h。
（说明：“倒置”指平板与水平面平行，接种面朝下；“直立”指平板与水平面垂直）
[COVID-19和SARS-CoV2]
2020年3月4日，国家卫健委发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》在原有确诊标准（病毒核酸检测）上新增了血淸SARS-CoV2特异性IgM和IgG抗体作为病原学诊断标准。
8．关于IgM和IgG，下列说法正确的是 。
A．二者均存在于内环境中
B．浆细胞和记忆B细胞均可分泌
C．高尔基体是二者的合成场所
D．二者参与的特异性免疫称细胞免疫
9．如图所示为SARS-CoV2感染后发展示意图，下列说法正确的是 。
A．COVID-19易感人群的血清中检测不到SARS-CoV2特异性IgM和IgG
B．患者感染SARS-CoV2后体内产生IgM和IgG属于先天免疫
C．隐性感染者体内也会产生SARS-COV2特异性IgM和IgG
D．IgG抗体的产生晚于IgM抗体，但在体内的持续存在时间长于IgM抗体
E.IgG抗体阳性可提示近期感染，而IgM抗体阳性可提示感染时间较长的既往感染
【答案】
5．D
6．C
7． 平板划线法 A点 直立
8．A
9．ACD
【解析】
1、一些生物能携带病原体，并将其直接或间接地传播给人，使人得传染病，这类生物被称作病媒生物，这种传播传染病的途径被称为病媒传播。常见的可以被病媒生物传播的传染病很多，如鼠疫、流行性出血热、流行性乙型脑炎（乙脑）、人粒细胞无形体病等。
2、常用的微生物接种方法为：平板划线法和稀释涂布平板法。
5．由图可知，鼠疫的传播是由于跳蚤叮咬鼠时携带了鼠疫杆菌，并在叮咬人的过程中将鼠疫杆菌传播给人，所以鼠疫的传播途径是病媒传播，即D正确，ABC错误。
故选D。
6．A、此培养基含有琼脂，为固体培养基，A错误；
B、此培养基中的脱纤维兔血可刺激鼠疫杆菌的生长，而龙胆紫则抑制其他杂菌的生长，故此培养基为选择培养基，不是通用培养基，B错误；
C、培养基制备过程中调节pH应在灭菌前进行，C正确；
D、该培养基的灭菌应为高压蒸汽灭菌，灭菌的条件应设定为121℃，15min，D错误。
故选C。
7．（1）根据图2可知，微生物的接种方法为平板划线法。
（2）（3）根据在18～22℃条件下鼠疫噬菌体只裂解鼠疫杆菌而不裂解其他菌可知，在图2所示平板上A点位置滴加含鼠疫噬菌体的溶液；将平板直立放置，使含鼠疫噬菌体的溶液沿着垂直方向向下渗透，置于20℃条件下培养24h，可出现图示中的平板中间不含鼠疫杆菌的结果。
8．A、抗体主要存在于血浆、组织液等内环境中，A正确；
B、只有浆细胞能产生抗体，记忆B细胞不能产生抗体，B错误；
C、抗体的本质是蛋白质，合成场所是核糖体，C错误；
D、抗体参与的特异性免疫称体液免疫，D错误。
故选A。
9．A、由图可知，潜伏期的2周内血清中没有抗体，所以COVID-19易感人群的血清中可能检测不到SARS-CoV2特异性IgM和IgG，A正确；
B、患者感染SARS-CoV2后体内产生IgM和IgG属于后天产生的特异性免疫，B错误；
C、由图可知，隐性感染者体内也会产生SARS-COV2特异性IgM和IgG，C正确；
D、由图可知，IgG抗体的产生晚于IgM抗体，但在体内的持续存在时间长于IgM抗体，D正确；
E、根据IgG抗体的产生晚于IgM抗体，但在体内的持续存在时间长于IgM抗体，可知IgM抗体阳性可提示近期感染，而IgG抗体阳性可提示感染时间较长的既往感染，E错误。
故选ACD。
10．（2020·湖北省高三二模）随着人们生活质量的提高，餐饮含油脂废水的排放量大量增加，合理处置油脂废水也成为新的课题。已知芽孢杆菌中有多种分解油脂产酸的菌种，科研人员欲采用下列流程筛选出能高效分解油脂的微生物。
菌种取样→分离培养→菌株的筛选→形态特征观察和生理生化反应鉴定回答下列问题：
（1）选取饭店附近排污渠的含油脂废水作为样本，采样约10g，立即装于试管内，此试管使用前需要经过________处理。
（2）样品分离培养前，一般需要将菌液进行________处理，然后吸取0．2ml菌液涂布到营养琼脂培养基平板上，置于37℃恒温培养箱内培养24h，记录菌落总数。将分离出的菌株按照菌落________等表观特征初步分类。
（3）上述步骤筛选出的菌株分别接种到含“花生油”的琼脂培养基平板上，37℃恒温培养箱中培养24h，筛选出油脂降解菌，培养基中“花生油”为菌种繁殖提供________。在该培养基还需要加入中性红染料（中性红为脂溶性染料，遇酸为红色，遇碱为黄色），挑选菌株要挑选显________降解圈的菌株，并且选颜色较________（填“深或浅”）的为宜。
（4）实际操作中，由于油脂易聚集成液滴，常在培养基中加入2-3滴乳化剂使油脂分散均匀，鉴定效果更好，试分析原因________________。
【答案】灭菌 稀释 形状、大小、隆起程度和颜色 碳源和能源 红色 深 油脂乳化后均匀分散在培养基表面，分解油脂的微生物产生的降解圈更为明显，便于快速分离和鉴定
【解析】
（1）微生物实验需要无菌操作，所以试管使用前需要经过灭菌处理。
（2）菌液一般需要先经过稀释处理，再进行涂布。不同微生物菌落的形状、大小、隆起程度和颜色不同，所以可以根据菌落的特征初步分类。
（3）花生油的主要成分是脂肪，所以为菌种提供碳源和能源。脂肪可以被分解为甘油和脂肪酸，使培养基呈酸性，所以选择红色降解圈的菌株，并且颜色较深的脂肪酸含量越高，说明分解能力越强。
（4）油脂乳化后均匀分散在培养基表面，分解油脂的微生物产生的降解圈更为明显，便于快速分离和鉴定摸索与可以在培养基中加入2-3滴乳化剂。
11．（2020·辽宁省高三其他）大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一类细菌，含有2000种以上的蛋白质；大肠杆菌的数量是检测自来水是否受粪便污染的最直接的指标。回答下列问题：
（1）利用凝胶色谱法分离提取到的部分大肠杆菌蛋白质时，等样品完全进入凝胶层后，加入pH为7.0、浓度为20mmol/L的___________ 到适当高度进行洗脱，结果甲蛋白质先洗脱出来，乙蛋白质后洗脱出来，则相对分子质量较大的是_____蛋白质。
（2）通过滤膜法可以测定自来水中大肠杆菌的数目：一定体积的自来水样过滤后，将滤膜放在伊红-美蓝培养基（主要成分包括：蛋白胨、NaCl、琼脂、乳糖、伊红和美蓝水溶液）上培养，大肠杆菌的代谢产物能与伊红-美蓝反应，使菌落呈黑色。根据培养基上菌落的数目，计算出大肠杆菌的数量。
①伊红-美蓝培养基属于____（填“选择”或“鉴别”）培养基，蛋白胨的作用有 _________。
②在微生物培养过程中，常用的灭菌方法有灼烧灭菌、________和高压蒸汽灭菌。配制伊红-美蓝培养基时，乳糖需要单独在压力为70kPa，温度为115℃灭菌20min，原因是__________。接种前通常需要检测固体培养基是否灭菌合格，检测方法是___________。
③滤膜法是根据培养基上菌落的数目来推测样品中的活菌数，其原理是_______________。
【答案】磷酸缓冲液 甲 鉴别 提供碳源、氮源、维生素 干热灭菌 乳糖在高温下会破坏 将未接种的培养基在适宜的条件下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落出现 （当样品中细菌浓度低时，）培养基表面生长的一个菌落来源于样品中的一个活菌
【解析】
（1）利用凝胶色谱法分离蛋白质时，等样品完全进入凝胶层后，需要加入pH为7.0、浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度进行洗脱，若甲蛋白质先洗脱出来，乙蛋白质后洗脱出来，说明甲蛋白质的相对分子质量较大。
（2）①伊红-美蓝可以将大肠杆菌染成深紫色，因此伊红-美蓝培养基属于鉴别培养基，其中蛋白胨可以为大肠杆菌提供碳源、氮源、维生素。
②微生物培养过程中，常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。由于乳糖在高温下会破坏，所以在配制伊红-美蓝培养基时，乳糖需要单独在压力为70kPa，温度为115℃灭菌20min。接种前通常需要将未接种的培养基在适宜的条件下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落出现，以检测固体培养基是否灭菌合格。
③滤膜法是根据培养基上菌落的数目来推测样品中的活菌数，其原理是培养基表面生长的一个菌落来源于样品中的一个活菌。
12．（2020·江苏省江浦高级中学高三二模）土壤中含有能将难溶性磷酸盐转变成植物可以吸收利用的可溶性磷的优良解磷菌株Q。下图1表示制备固体培养基过程中的某操作，图2是科研人员从土壤中分离出菌株Q的部分过程示意图。
请回答下列问题：
（1）图1所示操作称为__________________，待平板冷凝后__________，以防止__________________。
（2）图2所示接种方法是_______________________。在3个平板上分别接入0．1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上菌落数分别是38、42、40，则1 g土壤中的活菌数约为__________________个。
（3）图是某同学利用不同于图2方法分离菌株Q的示意图。下列对其操作及结果的叙述错误的有_______。
a．操作前用无水乙醇对双手进行消毒处理
b．划线时沾有菌种的接种环不能插入培养基中
c．只有在⑤区域中才能得到所需菌落
d．整个过程需要对接种环进行6次灼烧
（4）固体培养基中难溶性磷酸盐在菌株Q的作用下溶解，会在菌落周围形成透明圈（如下图所示），透明圈直径（D）与菌落直径（d）的比值（D/d）代表微生物溶解难溶磷酸盐的能力大小。下表是初步筛选出的三种优良解磷菌株。
菌株
透明圈直径(D)
菌落直径(d)
M—3—01
18．8
12．3
B3—5—6
20．7
8．0
T—4—01
9．1
6．5
根据实验结果分析，溶解难溶性磷酸盐能力最强的菌株是______________。该菌种分离纯化后，常用______________________法进行长期保存。
【答案】倒平板 倒置 皿盖上的冷凝水落入培养基 稀释涂布平板法 4×108 a、c B3－5－6 甘油管藏
【解析】
（1）图1所示操作称为倒平板，待平板冷凝后需要将其倒置，以防止皿盖上的冷凝水落入培养基，对培养基造成污染。
（2）图2所示接种方法是稀释涂布平板法，1g土壤共稀释了106倍。平板上生长的平均菌落数=(38+42+40)÷3=40个，每克样品中的菌株数=(C÷V)×M=(40÷0.1)×106=4×108个。
（3）a、操作前用70%的酒精对接种人员的双手进行消毒处理，a错误；
b、划线时沾有菌种的接种环不应划破培养基表面，b正确；
c、在5个区域中，只要有单个活细菌，通过培养即可获得所需菌落，c错误；
d、在每次划线前和最后一次划线结束均需对接种环灭菌，因此需要对接种环进行6次灼烧，d正确。
故选ac。
（4）根据实验原理中“透明圈直径（D）与菌落直径（d）的比值（D/d）代表微生物溶解难溶磷酸盐的能力大小”，结合表格数据可以确定溶解难溶性磷酸盐能力最强的菌株是B3-5-6。对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏法。
13．（2020·四川省高三三模）大肠杆菌是动物肠道中的正常寄居菌。少数种类的大肠杆菌在一定条件下会使人患病，如肠道出血性大肠杆菌可使人腹泻和便血，严重时危及生命。出血性大肠杆菌在添加血液的平板培养基上生长时，红细胞被细菌破坏而褪色，导致菌落周围形成透明圈。下图表示从污染的食物中分离和提纯该细菌的操作流程。请回答问题：
（1）细菌从肉汤培养基获得的营养成分有______________。
（2）据操作流程可知，将细菌接种在血平板上的方法是______________，接种完毕后要灼烧接种工具的目的是为了______________。
（3）研究细菌的致病性，先要获得纯度较高的细菌蛋白，凝胶色谱法是分离蛋白质的常用方法，在装填凝胶柱时不得有气泡产生，因为______________ ；若肠道出血性大肠杆菌的A蛋白质比B蛋白质后洗脱出来，则______________的相对分子质量较大。
（4）纯化后的细菌蛋白可以用_________测定分子量大小，在此过程中加入的SDS掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使得______________完全取决于分子的大小。
【答案】碳源、氮源、水、无机盐等 平板划线法 避免污染环境和感染操作者 气泡会扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果 B蛋白 电泳法 电泳迁移率
【解析】
（1）肉汤培养基中含有水分、无机盐、蛋白质等物质，因此可为微生物提供的营养成分有：碳源、氮源、水和无机盐。
（2）据操作流程可知，图中的接种工具是接种环，故将细菌接种在血平板上的方法是平板划线法；接种完毕后要灼烧接种工具的目的是避免污染环境和感染操作者。
（3）研究细菌的致病性，先要获得纯度较高的细菌蛋白，凝胶色谱法是分离蛋白质的常用方法，由于气泡会扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果，故在装填凝胶柱时不得有气泡产生；凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质，相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长，移动的速度慢，相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，因此若肠道出血性大肠杆菌的A蛋白质比B蛋白质后洗脱出来，则B蛋白的相对分子质量较大。
（4）纯化后的细菌蛋白可以用凝胶电泳法测定分子量大小；用凝胶电泳法测定蛋白质分子量时，需要在凝胶中加入SDS，目的是消除净电荷对迁移率的影响（或掩盖不同种蛋白间的电荷差别），使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
14．（2020·江苏省高三其他）镇江香醋是我国传统固态酿造食醋的典型代表，具有醇香浓厚、回味悠长的特点。由于发酵过程的半开放模式，来源于酿造原料、生产过程和操作器械的大量微生物会进入发酵液中，与酿醋功能微生物构成竞争性生长。科研人员研究酿醋主要功能微生物的发酵上清液对杂菌生长的抑制效果，并初步研究了抑菌活性物质的种类和特性，下面为部分研究结果。请分析回答：
（1）镇江香醋酿制的主要功能微生物除乳酸杆菌外，还有________等，整个实验过程中所需培养皿、接种用具均需________处理。
（2）科研人员先将10 mL含2%琼脂的肉汤培养基倾注平板，待凝固后将无菌牛津杯(一种不锈钢管)嵌于培养基中。接着将冷却至50℃，含0．75%琼脂糖的肉汤培养基与大肠杆菌混合后倾注于牛津杯中，以制备含菌培养皿。待培养基冷却后取出牛津杯，每孔注入150 μL待测样品，置于37℃下过夜培养，测定抑菌圈大小，得到如上图1所示结果。
①上述制备含大肠杆菌的培养皿所采用的接种方法是________________(选填稀释涂布平板法或平板划线法)。
②每孔分别注入的是灭菌的超纯水和发酵2天、4天、10天、20天后提取的发酵上清液，得到了图1中0～4的抑菌圈，说明______________________________________。
（3）研究结果发现，发酵微生物上清液如果加热处理，抑菌圈会减小，由此可见，该上清液含有________(选填热敏感/耐热的或热敏感和耐热的)的抑菌活性物质。
（4）实验过程中，如使用不同的蛋白酶处理发酵微生物上清液，得到如上图2所示结果，由此可以推测，部分抑菌物质的化学本质是________，另一部分具有抑菌效果的化学物质主要是________。
（5） 结合上述研究结果，试分析酿醋主要微生物的生长和代谢对环境微生物的这种抑制作用的意义是______________________________________。
【答案】醋酸杆菌 无菌 稀释涂布平板法 发酵初期抑菌物质较少，随着发酵时间延长，微生物的代谢产物增多，抑菌效果逐渐增强 热敏感和耐热的 蛋白质 有机酸（醋酸、乳酸等） 维持自身功能和结构的相对稳定，保证醋酸发酵的正常进行
【解析】
（1）工业发酵在保证无菌操作的前提下，一般都是涉及多种微生物的，酿醋需要醋酸菌，所以镇江香醋酿制的主要功能微生物除乳酸杆菌外，还有醋酸杆菌等，整个实验过程中所需培养皿、接种用具均需无菌（灭菌）处理。
（2）①由题干可知，上述制备含大肠杆菌的培养皿所采用的接种方法是稀释涂布平板法。②每孔分别注人的是超纯水和发酵2天、4天、10天、20天后提取的发酵上清液，得到了图1中0~4的抑菌圈，说明发酵初期抑菌物质较少，随着发酵吋间延长，微生物的代谢产物增多，抑菌效果逐渐增强。
（3）研究结果发现，发酵微生物上清液如果加热处理，抑菌圈会减小，由此可见，加热并没有完全去除灭菌物质，则该上清液含有热敏感、耐热的抑菌活性物质。
（4）实验过程中，如使用不同的蛋白酶处理发酵微生物上清液，得到如图2所示结果，由此可以推测，部分抑菌物质的化学本质是蛋白质（可被高温阻断的），另部分具有抑菌效果的化学物质主要是发酵产生的有机酸。
（5）结合上述研究结果，酿醋主要微生物的生长和代谢对环境微生物的这种抑制作用的意义是维持自身功能和结构的相对稳定，保证醋酸发酵的正常进行。
15．（2020·江苏省高三其他）水产或家畜养殖污水中含有大量的类固醇，而这类化合物会对人体造成危害，且不易被降解，而丛毛单胞菌是日前用于降解这类有机污染物常用的需氧型菌种。由于抗生素的滥用，污水中含有大量的抗生素残余，这些抗生素会强烈地抑制丛毛单胞菌的作用，从而降低污水处理的效果。结合所学知识，回答下列问题：
（1）从自然界中分离出能够降解类固醇化合物的丛毛单胞菌时，一般会从鱼塘废水或附近土壤进行取样，其原因是___________________________________________________________。
（2）筛选丛毛单胞菌时，通常以________________为唯一碳源的选择培养基进行筛选。制备这一培养基的一般步骤包括计算、称量，溶化、______________、倒平板。
（3）研究人员从含抗生素的污水中分离出了3个抗生素耐药型丛毛单胞菌菌株（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）为了测试其在高浓度抗生素条件下的增殖能力，他们进行了如下实验：
①将等量的三种菌株，分别接种到添加了高浓度抗生素和一定量类固醇物质的细菌液体培养基中，测量计算初始培养液中种群密度的相对值，之后不断通入无菌空气，在适宜的条件下进行培养；
②接种培养开始后100小时内，每20小时取样一次，每次每种菌株重复3次计数，常利用_______________法接种进行活菌数的测定，从初始到实验结束，实验过程中需测定计数的样品次数为____________。在测定菌群密度相对值的同时，每次取样还要测定菌液中固醇类物质的浓度。
③下面的曲线图是根据实验过程中所获得的数据绘制而成。
a．与菌株Ⅱ、Ⅲ相比，实验进行到60小时左右时，造成菌株I种群密度下降的原因有______________（填序号）。
①种内斗争加剧 ②营养物质积累
③营养物质消耗 ④代谢废物消耗
b．从污水处理的角度分析及研究数据来看，菌株____________更适合作为污水中类固醇污染物的处理，理由是___________________________________________________________________________。
【答案】这些区域内类固醇物质较多，容易富集丛毛单胞菌 类固醇 （调pH、）灭菌 稀释涂布平板 45 ①③ Ⅱ 在实验时间内，种群数量持续保持递增趋势，同时对类固醇物质的代谢能力最强
【解析】
（1）由于鱼塘废水或附近土壤中类固醇物质较多，容易富集丛毛单胞菌，所以从自然界中分离出能够降解类固醇化合物的丛毛单胞菌时，一般会从鱼塘废水或附近土壤进行取样。
（2）根据选择培养基的作用筛选丛毛单胞菌时，通常以类固醇为唯一碳源的选择培养基进行筛选。配置培养基的一般步骤包括计算、称量，溶化、灭菌、倒平板。
（3）②在对菌种进行分离与计数时常利用稀释涂布平板法接种进行活菌数的测定；根据题中的操作信息，三种菌株，100小时内每20小时取样一次，共取样5次，每次每种菌株重复3次计数，因此从初始到实验结束，实验过程中需测定计数的样品次数为45次。
③a、与菌株Ⅱ、Ⅲ相比，实验进行到60小时左右时，菌株I种群密度大幅下降，推测可能的原因是：随着种群数量的增多及营养物质的消耗，种内斗争加剧，以及有害代谢废物的积累等。
b、根据图甲及图乙中的数据综合分析，菌株Ⅱ在实验时间内，种群数量持续保持递增趋势，同时对类固醇物质的代谢能力最强，因此其更适合作为污水中类固醇污染物的处理。
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