2024届人教版高中生物一轮复习基因工程学案（不定项）

这是一份2024届人教版高中生物一轮复习基因工程学案（不定项），共32页。

选择性必修3　生物技术与工程
第十单元 生物技术与工程

第5讲　基因工程
课标解读
核心素养
1.概述基因工程的诞生
2.阐明基因工程的原理及技术(含PCR技术)
3.举例说明基因工程的应用
4.概述蛋白质工程的原理及应用
5.活动:DNA的粗提取与鉴定
6.活动:利用PCR扩增DNA片段并完成电泳鉴定,或运用软件进行虚拟PCR实验
生命观念
基因的结构决定其功能
科学思维
建立基因工程的操作流程模型
科学探究
探究基因工程在生产上的应用和蛋白质工程的应用
社会责任
基因工程和蛋白质工程在生产实践上的应用

考点一　重组DNA技术的基本工具

1.基因工程的概念。

2.基因工程的基本工具。
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)。

提醒　①限制酶的识别序列与被作用的DNA序列是不同的。前者一般由6个核苷酸组成,少数由4个、8个或其他数量的核苷酸组成;后者是双链序列。
②判断黏性末端是否由同一种限制酶切割形成的方法是将黏性末端旋转180°,同一种限制酶切割形成的黏性末端应该是完全相同的结构。
③限制酶作用的化学键只能是磷酸二酯键,而不能是氢键。
④在切割含目的基因的DNA分子时,需用限制酶切割两次此DNA分子,产生4个末端。只有这样才能使目的基因的两端都有可连接的黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶。

(3)载体。

提醒　与膜载体的区别:基因工程中的载体是DNA分子,能将目的基因导入受体细胞内,并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制;膜载体是蛋白质,与细胞膜的通透性有关。
正误判断
(1)限制酶只能用于切割目的基因。(×)
(2)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(×)
(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。(×)
(4)E.coli DNA连接酶既可连接平末端,又可连接黏性末端。(×)
(5)限制酶也可以识别和切割RNA。(×)
(6)限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。(×)
(7)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。(×)
(8)每个质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点。(√)
(9)质粒是小型环状DNA分子,是基因工程常用的载体。(√)
(10)载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中,使之稳定存在并表达。(√)
(11)只能用一种限制酶分别切割运载体和目的基因,便于两者连接。(×)
教材微点
1.(选择性必修3 P71“旁栏思考”)(1)存在于原核生物中的限制酶的作用是什么?
提示　切割外源DNA以保证自身安全,防止外来病原物的危害。
(2)限制酶来源于原核生物,为什么不能切割自身的DNA分子?
提示　原核生物的DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
2.(选择性必修3 P72“旁栏思考”)DNA连接酶和DNA聚合酶不是(填“是”或“不是”)一回事。原因是①DNA连接酶连接的是两个DNA片段,而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板,而DNA连接酶不需要模板。

1.基因工程的理论基础。

2.限制酶的选择原则。
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。

①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,以便将目的基因“切出”,如图可选择PstⅠ。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,防止破坏目的基因,如图不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切割位点,而且这两种限制酶切割后不会完全破坏标记基因)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。

(3)根据Ti质粒的T⁃DNA片段选择限制酶,图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。

3.标记基因的作用:可用于检测目的基因是否导入受体细胞。

4.与DNA有关的几种酶的比较。


角度一 结合基因工程所需工具酶,考查科学思维能力
1.下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点,由此推断以下说法中,错误的是(　　)
限制酶名称
识别序列和
切割位点
限制酶名称
识别序列和
切割位点
BamHⅠ
G↓GATCC
KpnⅠ
GGTAC↓C
EcoRⅠ
C↓AATTC
Sau3AⅠ
↓GATC
HindⅡ
GTY↓RAC
SmaⅠ
CCC↓GGG
注:Y为C或T,R为A或G。
A.HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B.Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C.BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
解析　HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶沿着中轴线切口切开,切割后形成平末端,A项正确;Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列,切割位点在识别序列的外部,B项正确;BamHⅠ限制酶识别GGATCC序列,Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列,切割后形成相同的黏性末端GATC,C项正确;HindⅡ能识别GTCAAC,也能识别GTTAAC,D项错误。
答案　D
2.(不定项)DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入到适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子,将其导入人体内,在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答,且可持续一段时间。限制性内切核酸酶的切点分别是Bgl Ⅱ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析错误的是(　　)

甲　 乙
A.构建DNA疫苗时,可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒
B.图乙中只用EcoRⅠ切割后的质粒,含有2个游离的磷酸基团
C.用EcoRⅠ切割目的基因和质粒,再用DNA连接酶连接,只产生1种连接产物
D.抗原基因在体内表达时需要解旋酶
解析　从图甲看出,用EcoRⅠ切割目的基因后两端各有一个切口,与图乙中EcoRⅠ切口对接时,可有两种可能,即可产生两种重组DNA,C项错误;基因表达包括转录和翻译,转录时不需要解旋酶,在RNA聚合酶的作用下,DNA即可解旋,D项错误。
答案　CD
3.(2021·全国乙卷)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。

回答下列问题:
(1)常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中　　　　　　　　　　酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中　　　　　　　　　　酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是　　　　　　。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中能　　　　;质粒DNA分子上有　　　　　,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因),利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞,方法是　　　　　　　。
(4)表达载体含有启动子,启动子是指　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
解析　(1)由题图可以看出,EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端,E.coli DNA连接酶可用于连接黏性末端,T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。(2)DNA连接酶催化DNA链的5'端与另一DNA链的3'端生成磷酸二酯键。(3)复制原点是在基因组上复制起始的一段序列,可以保证质粒在宿主细胞中进行复制。质粒上有限制酶切位点,该位点可被限制酶切开并使外源目的基因插入其中。在含有特定抗生素的培养基上进行选择性培养可以将含质粒载体的细胞筛选出来。(4)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需要的蛋白质。
答案　(1)EcoRⅠ、PstⅠ　EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoRⅤ　(2)磷酸二酯键　(3)复制　限制酶切位点　选择性培养　(4)RNA聚合酶识别和结合的部位
角度二 结合载体的作用及特点,考查科学思维能力
4.如图为某种质粒的简图,小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点,P为转录的启动部位。已知目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点,受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列有关叙述,正确的是(　　)

A.将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切,在DNA连接酶作用下,生成的由两个DNA片段连接形成的产物有两种
B.DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来,形成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键
C.为了防止目的基因反向粘连和质粒自身环化,酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ
D.能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞中已成功导入该目的基因
解析　根据题意,目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点,将含有目的基因的DNA用EcoRⅠ酶切,会得到目的基因片段;根据质粒的简图可知,将质粒用EcoRⅠ酶切,会得到与质粒周长等长的链状DNA;因此将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切,在DNA连接酶作用下,可生成目的基因—目的基因片段、目的基因—质粒片段、质粒—质粒片段三种产物,A项错误;DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来形成一个重组质粒,该过程形成四个磷酸二酯键,B项错误;EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列不同,获取目的基因和切割质粒时,同时选用EcoRⅠ和BamHⅠ切割,目的基因两端形成的末端不同,切割后的质粒两端形成的末端不同,再用DNA连接酶连接,可以防止目的基因反向连接和质粒自身环化,C项正确;导入普通质粒的大肠杆菌和导入重组质粒的大肠杆菌都能在含青霉素的培养基中生长,因此能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞不一定含有目的基因,D项错误。
答案　C
5.(2023·丹东模拟)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒P0具有四环素抗性基因(TetR)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题:

图1
(1)EcoR Ⅴ酶切位点为↓…GATATC……CTATAG…↑,EcoR Ⅴ酶切出来的线性载体P1为　　　　末端。
(2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段,其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理,在两端各添加了一个碱基为　　　　的脱氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在　　　　酶作用下,形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到A、B、C三类菌落,其生长情况如下表(“+”代表生长,“-”代表不生长)。根据表中结果判断,应选择的菌落是　　　　(填表中字母)类,另外两类菌落质粒导入情况分别是　　　　　　　、　　　　　　　　　　。
平板类型
菌落类型
A
B
C
无抗生素
+
+
+
氨苄青霉素
+
+
-
四环素
+
-
-
氨苄青霉素+四环素
+
-
-
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是　　　　。某学生尝试用图中另外一对引物,结果从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段,原因是　　　　　　　　　　　。

图2
解析　(1)从图中可以看出,EcoRⅤ酶切出来的载体质粒为平末端。(2)从图中可以看出,目的基因的两端各有一个游离的腺嘌呤脱氧核苷酸,由于载体P1为平末端,所以载体P1的两端应该各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸,这样在DNA连接酶的作用下才能把目的基因和载体P1连接起来。(3)由题意可知,构建重组质粒时四环素抗性基因被破坏,所以导入目的基因的菌落只能在没有抗生素或含有氨苄青霉素的培养基中存活,应该选B类菌落。A类菌落能在表中条件下存活,说明导入的是P0质粒。C类菌落只能在无抗生素的培养基中存活,说明C类菌落没有导入质粒。(4)据图分析,目的基因的外侧链只能用丙作引物,内侧链可用甲、乙作引物,如果用甲、丙作引物,则无论目的基因是否插入正确,都能通过PCR扩增大量目的基因,如果用乙、丙作为引物,当目的基因插入不正确(反向插入)时,则乙、丙两引物都结合在外侧,PCR不能正常进行,因此选用乙、丙作为引物可以进行RCR鉴定。若扩增出的DNA片段为400 bp,则正好是目的基因反向连接后,外侧链用乙作引物,内侧链用甲作引物扩增出的片段。
答案　(1)平　(2)胸腺嘧啶(T)　DNA连接
(3)B　A类菌落含有P0　C类菌落未转入质粒
(4)乙、丙　目的基因反向连接



考点二　基因工程的基本操作程序

1.目的基因的筛选与获取。
(1)筛选合适的目的基因。
①目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因。
②筛选目的基因的方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
(2)利用PCR获取和扩增目的基因。

提醒　①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。
②引物是一小段单链的DNA或RNA,作为新子链的合成起点,只能结合在母链的3'端,使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+。
2.基因表达载体的构建——核心。
(1)目的。
使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代,同时使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)组成。

提醒　启动子≠起始密码子,终止子≠终止密码子
①启动子:一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,它是RNA聚合酶识别、结合的部位。
②终止子:一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的下游,作用是使转录在所需要的地方停止。
③起始密码子和终止密码子位于mRNA上,分别控制翻译过程的启动和终止。
(3)构建过程。

3.将目的基因导入受体细胞。
受体细胞
导入方法
内容
植物细胞
花粉管通道法
用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中等
农杆菌转化法
农杆菌细胞内的Ti质粒上的T⁃DNA可携带目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上
动物细胞
显微注射技术
常用受体细胞:受精卵
原核细胞
Ca2+处理法
用Ca2+处理细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
提醒　①农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入。
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T⁃DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T⁃DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上;第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T⁃DNA导入受体细胞。
②导入的目的基因,可能存在于细胞质中,也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中,造成“基因污染”。
4.目的基因的检测与鉴定。

提醒　分子水平检测是否插入了目的基因和是否转录出了mRNA时,①都遵循碱基互补配对原则;②都使用基因探针,探针是放射性同位素或荧光标记的含目的基因的单链DNA片段。
教材微点
1.(选择性必修3 P79 “旁栏思考题”)PCR不可以扩增mRNA的原因是PCR是以DNA双链作模板的,不能直接用单链RNA做PCR,必须把mRNA逆转录成单链cDNA之后再做PCR。
2.(选择性必修3 P83“到社会中去”)转基因抗虫棉培育过程中,检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种?抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。
长句突破
1.(事实概述)[全国卷Ⅱ,T38(2)改编]以mRNA为材料可以获得DNA,其原理是在逆转录酶的作用下,以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成DNA。
2.(事实概述)[江苏卷,T33(4)改编]PCR扩增时,复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关,长度相同但G、C含量高的引物需要设定更高的复性温度。
3.(事实概述)[全国卷Ⅰ,T40(2)]从受体细胞中分离纯化出目的蛋白,该蛋白作为抗原注入机体后,刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是抗体,该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV,检测的原理是抗原、抗体特异性结合。
4.(科学思维)[全国卷Ⅰ,T38(2)]若用家蚕作为表达基因A的受体,在噬菌体和昆虫病毒两种载体中,不选用噬菌体作为载体,其原因是噬菌体的宿主是细菌,而不是家蚕。
5.(科学思维)[全国卷Ⅱ,T38(3)]若要使目的基因在受体细胞中表达,需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞,原因是目的基因无复制原点;目的基因无表达所需的启动子(答出两点即可)。
6.(科学思维)目前在PCR反应中使用耐高温的DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是耐高温的DNA聚合酶热稳定性高,而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活。

1.目的基因的获取方法。
(1)利用PCR获取和扩增目的基因。
(2)人工合成目的基因。
①逆转录法:主要用于相对分子质量较大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA为模板,借助逆转录酶合成双链DNA,其过程如下:
目的基因的mRNA双链DNA(目的基因)
① 化学合成法:依据某一蛋白质的氨基酸序列,推测出其基因序列,然后直接合成目的基因,其过程如下:

(3)从基因文库中获取目的基因。
根据目的基因的有关信息,例如,根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物——mRNA,以及基因的表达产物——蛋白质等特性来获取目的基因。
2.PCR技术的过程。
(1)
(2)循环图示与规律。

循环次数
1
2
3
n
DNA分子数
2
4
8
2n
含引物A(或B)
的DNA分子数
1
3
7
2n-1
同时含引物A、B
的DNA分子数
0
2
6
2n-2
共消耗的引物数量
2
6
14
2n+1-2
注:第三轮循环后,开始出现双链等长的目的基因片段。

角度一 结合PCR技术的操作和应用,考查科学思维能力
1.锦鲤疱疹病毒是一种双链DNA病毒。如图为TaqMan荧光探针技术的原理示意图,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时该探针被Taq酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增1个DNA分子,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。下列有关叙述不正确的是(　　)

A.在基因工程中,目前获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取、PCR技术扩增等
B.引物的化学本质是DNA单链
C.引物中的GC含量比探针中的略高,这有利于保证退火时引物先与模板DNA结合
D.若最初该反应体系中只有一个病毒DNA分子,经n次循环后,需要消耗TaqMan荧光探针2n-1个
解析　在基因工程中,目前获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取、PCR技术扩增、利用化学方法人工合成,A项正确;引物是根据目的基因合成的,一般是一段短的DNA单链,B项正确;GC之间形成3个氢键,GC含量高的DNA更稳定,更难变性,但是对复性过程影响不大,C项错误;由于每扩增1个DNA分子,就有一个荧光分子形成,经n次循环后共有2n个DNA,跟初始相比,新增2n-1个DNA,所以需要TaqMan荧光探针2n-1个,D项正确。
答案　C
2.(2020·江苏卷)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如下图(以EcoRⅠ酶切为例):

请据图回答问题:
(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种　　　　酶,它通过识别特定的　　　　切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'⁃羟基与5'⁃磷酸间形成　　　　　　　　　　;PCR循环中,升温到95 ℃是为了获得　　　　;Taq DNA聚合酶的作用是催化　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是　　　　(从引物①②③④中选择,填编号)。

DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知
序列

PCR
引物
①5'⁃AACTATGCGCTCATGA⁃3'
②5'⁃GCAATGCGTAGCCTCT⁃3'
③5'⁃AGAGGCTACGCATTGC⁃3'
④5'⁃TCATGAGCGCATAGTT⁃3'
(4)对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列),结果正确的是　　　　。
A.5'⁃AACTATGCGAGCCCTT⁃3'
B.5'⁃AATTCCATGCTGAATT⁃3'
C.5'⁃GCAATGCGTTCGGGAA⁃3'
D.5'⁃TTGATACGCCGAGTAC⁃3'
解析　(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种限制性内切核酸酶,它通过识别特定的核苷酸序列来进行切割。(2)步骤Ⅱ中用DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'⁃羟基与5'⁃磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中,升温到95 ℃是为了解开DNA双链获得DNA单链,Taq DNA聚合酶的作用是催化以DNA为模板延伸形成子链的过程。(3)PCR过程中,根据已知的DNA序列合成两个引物,要注意模板链和引物的方向是相反的,引物的核苷酸序列要能够和相应模板的核苷酸序列发生碱基互补配对,环状DNA图中显示PCR过程是从已知DNA序列的两端分别向相反方向形成子链,一个引物是与已知DNA序列的第一条链的左端互补结合,向左侧方向延伸形成子链,该引物是④,另一个引物是与已知DNA序列的第二条链的右端互补结合,向右侧方向延伸形成子链,该引物是②。(4)图中由片段F形成的环状DNA的未知序列中有一个EcoRⅠ限制酶的切割位点,而EcoRⅠ识别的位点是,因此片段F的单链中的一端应含有“AATT”序列,另一端应含有“TTAA”序列,只有B项符合题意。
答案　(1)限制性内切核酸(或限制)　核苷酸序列　(2)磷酸二酯键　DNA单链　以DNA为模板的DNA子链的延伸　(3)②④　(4)B

(1)细胞膜上的载体与基因工程中的载体化学本质不同:细胞膜上的载体化学成分是蛋白质;基因工程中的载体可能是物质,如质粒(DNA),也可能是生物,如噬菌体、动植物病毒等。
(2)PCR中的复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时,引物与DNA模板的结合是随机的,也存在DNA解开的两条链的结合。
(3)PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物,比所需的DNA片段要长,从第二次循环才出现所需的DNA片段,这样的片段存在两种引物。
(4)任何一种天然蛋白质都是由基因编码的,利用蛋白质工程改造了基因即对蛋白质进行了改造,而且改造过的蛋白质可以遗传下去。
角度二 以基因工程的操作程序为载体,考查科学探究能力
3.某质粒上有Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ三种限制酶切割位点,同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程,如图所示。请回答下列问题:

(1)将目的基因导入植物细胞,采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是　　　　;该质粒含有一段特殊的DNA片段,称为　　　　。该方法中农杆菌的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)在构建重组质粒时,和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比,选用HindⅢ和SalⅠ两种酶的好处是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖,农杆菌中是否已含有目的基因?　　　　(填“是”或“否”)。为什么? 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(4)将已经转化的农杆菌进行如下操作,筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养,长出菌落后,用无菌牙签挑取A上的单个菌落,分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上,一段时间后,菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中?请在图中相应的位置上圈出来。

答案　(1)Ti质粒　T⁃DNA　感染烟草细胞,把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上　(2)防止目的基因自连和质粒自连,以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率;防止目的基因与质粒反向连接
(3)否　含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏
(4)


如何筛选出含有目的基因的受体细胞
(1)原理:将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时,如果插入某种抗生素抗性基因内部,则会导致该抗生素抗性基因失活。如下图,目的基因插入四环素抗性基因内部,则四环素抗性基因失活。
(2)被转化的细菌有三种:含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。
(3)筛选方法:将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养,能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌,如图1、2、3、4、5菌落,再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上,如图能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落,如图1、5菌落。最后,可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。

　
4.(2021·辽宁卷)PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因,研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因),大小为0.9 kb(1 kb=1 000碱基对),利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题:
(1)图1为所用载体图谱示意图,图中限制酶的识别序列及切割位点如表。为使phb2基因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接,在扩增的phb2基因两端分别引入　　　　　和　　　　　两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时,可选用　　　　　(填“E.coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。

图1
相关限制酶的识别序列及切割位点
名称
识别序列
及切割位点
名称
识别序列
及切割位点
HindⅢ

EcoRⅠ

PvitⅡ

PstⅠ

KpnⅠ

BamH Ⅰ

注:箭头表示切割位点。
(2)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞,使其处于　　　　　的生理状态,以提高转化效率。
(3)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养,随机挑取菌落(分别编号为1、2、3、4)培养并提取质粒,用(2)中选用的两种限制酶进行酶切,酶切产物经电泳分离,结果如图2,　　　　号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。

图2
注:M为指示分子大小的标准参照物;小于0.2 kb的DNA分子条带未出现在图中。
(4)将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中,培养24小时后,检测处于细胞周期(如图3)不同时期的细胞数量,统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的　　　　　(填“G1”“S”或“G2/M”)期。

图3
注:分裂间期包括G1期、S期和G2期。

图4
注:G2/M表示G2和M。
解析　(1)根据启动子和终止子的生理作用可知,目的基因应导入启动子和终止子之间。由图1可知,两者之间存在三种限制酶切点,但是由于KpnⅠ在质粒上不止一个酶切位点,所以应该选择EcoRⅠ和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列;根据PvitⅡ的酶切序列,切出了平末端,所以构建基因表达载体时,应该用T4 DNA连接酶连接质粒和目的基因。(2)转化时用CaCl2处理大肠杆菌细胞,使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,以提高转化效率。(3)由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中,因此都含有质粒,重组质粒包含了目的基因和质粒,如果用EcoRⅠ和PvitⅡ两种酶切割重组质粒,电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带,由于phb2基因大小为0.9 kb,所以对应电泳图是3号菌落。(4)图4中G1期和S期细胞减少,而G2期细胞数目明显增多,说明G1期和S期细胞可以进入G2期,而G2期的细胞没有能够完成分裂进入M期,因此PHB2蛋白应该作用于G2/M期。
答案　(1)EcoRⅠ　PvitⅡ　T4 DNA连接酶
(2)一种能吸收周围环境中DNA分子
(3)3　(4)G2/M
考点三　基因工程的应用与蛋白质工程

1.基因工程的应用。

提醒　乳腺生物反应器与膀胱生物反应器。
①乳腺生物反应器是利用转基因动物的乳汁生产药用蛋白,而膀胱生物反应器是利用转基因动物的尿液生产药用蛋白,二者的优点是产量高、质量好、成本低、易提取,且不必对动物造成伤害。
②乳腺生物反应器需是处于生殖期的雌性动物才可生产药用蛋白,而膀胱生物反应器则是任何生长时期的雌、雄动物均可生产。
2.蛋白质工程的原理和应用。
(1)蛋白质工程的概念。

(2)蛋白质工程的基本原理。

(3)蛋白质工程的应用。
①医药工业方面:研发药物,如延长干扰素的保存时间;降低小鼠单克隆抗体诱发免疫反应的强度。
②其他工业方面:改进酶的性能或开发新的工业用酶。
③农业方面:通过改造某些参与调控光合作用的酶,增加粮食产量;改造微生物蛋白质的结构,设计优良微生物农药,防治病虫害。
提醒　基因工程不会导致受体细胞或生物产生“新基因”或“新蛋白质”。
正误判断
(1)转基因抗病农作物不需要使用农药。(×)
(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品,如人的血清白蛋白,这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。(×)
(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用。(×)
(4)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。(√)
(5)蛋白质工程可以合成自然界中不存在的蛋白质。(√)
(6)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作,定向改变分子的结构。(×)
教材微点
(选择性必修3 P90 “正文信息”)利用转基因技术获得的已整合药用蛋白基因的转基因小鼠分泌的乳汁中检测不到药用蛋白,根据中心法则分析,其可能的原因是药用蛋白基因没有转录或翻译。

角度一 借助基因工程的应用,考查科学思维和社会责任
1.(2023·山东威海模拟)下列生物技术操作对遗传物质的改造,不能遗传给子代的是(　　)
A.将含胰岛素基因的表达载体转入大肠杆菌,筛选获得的基因工程菌
B.通过植物体细胞杂交获得的番茄—马铃薯杂种植株
C.将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者,进行基因治疗
D.将生长激素基因导入奶牛受精卵,培育出能分泌含生长激素乳汁的奶牛
解析　将含胰岛素基因的表达载体转入大肠杆菌,筛选获得的基因工程菌可以通过二分裂的方式遗传给子代,A项不符合题意;通过植物体细胞杂交获得的番茄—马铃薯杂种植株,遗传物质发生改变,可以通过无性繁殖遗传给子代,B项不符合题意;将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞,只是淋巴细胞含有这个基因,其生殖细胞没有该基因,因此不能遗传给子代,C项符合题意;将生长激素基因导入奶牛受精卵,受精卵含有生长激素基因,受精卵培育成的奶牛含有该基因,因此可以遗传给子代,D项不符合题意。
答案　C
2.(2022·广东卷)“绿水逶迤去,青山相向开”。大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力,有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体,多来自高污染排放企业)为原料,通过厌氧发酵生产丙酮,构建一种生产高附加值化工产品的新技术。

回答下列问题:
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对　　　　,利用PCR技术,在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k,用于在梭菌中建立多基因组合表达库,经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等,其中抗生素抗性基因的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,终止子的作用是　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时,出现了生长迟缓的现象,推测其原因可能是　　　　　　　　　　　　　　,此外丙酮的积累会伤害细胞,需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术,实现了　　　　　　,体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看,该技术的优势在于　　　　　　　　　　　　　　　　　　,具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
解析　(1)利用PCR技术扩增目标酶基因,首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物,引物与模板链结合后,Taq酶才能从引物的3'端延伸子链。(2)基因表达载体中,抗生素抗性基因作为标记基因,可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞,终止子可终止转录,使转录在需要的地方停下来。(3)重组梭菌大量表达上述酶蛋白时,在这些酶蛋白的作用下,二氧化碳等气体大量用于合成丙酮,而不是用于重组梭菌的生长,所以会导致生长迟缓。(4)由题意可知,这种生产高附加值化工产品的新技术,以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原料,实现了废物的资源化,体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看,该技术生产丙酮的过程不仅不排放二氧化碳,而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳,有利于减缓温室效应,并实现较高的经济效益,所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
答案　(1)引物　(2)作为标记基因,筛选含有基因表达载体的受体细胞　终止转录,使转录在需要的地方停下来　(3)二氧化碳等气体用于大量合成丙酮,而不是用于重组梭菌的生长　(4)废物的资源化　不仅不排放二氧化碳,而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳
角度二 围绕蛋白质工程,考查科学思维能力
3.人体内的t⁃PA蛋白能高效降解由血纤维蛋白凝聚而成的血栓,然而为心梗患者注射大剂量的基因工程t⁃PA会诱发颅内出血,其原因是t⁃PA与血纤维蛋白结合的特异性不高。研究证实,通过某技术,将t⁃PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸,可制造出性能优异的改良t⁃PA蛋白,进而显著降低出血副作用。下列叙述正确的是(　　)
A.该技术的关键是知道t⁃PA蛋白基因的分子结构
B.该技术生产改良t⁃PA蛋白的过程遵循中心法则
C.该技术是在蛋白质分子水平上直接改造蛋白质
D.该技术制造出的蛋白质在自然界早已存在
解析　将t⁃PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸需要采用蛋白质工程技术,该技术的关键工作是了解t⁃PA蛋白质的分子结构,A项错误;该技术生产改良t⁃PA蛋白的过程遵循中心法则,B项正确;该技术是在基因分子水平上通过改造基因来实现对蛋白质的改造,C项错误;该技术制造出的蛋白质是自然界不存在的蛋白质,D项错误。
答案　B
4.(2022·湖南卷)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是　　　　　　,物质b是　　　　。在生产过程中,物质a可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。

(2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有　　　　　　　　　　、　　　　　　　　　　　　　和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是　　　　　　　　　　。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的　　　　(填“种类”或“含量”)有关,导致其活性不同的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。

(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,简要写出实验设计思路:　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
解析　 (1)蛋白质工程的流程一般为预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列(基因)。密码子的简并性指的是同一种氨基酸可以由几种不同的密码子决定。(2)获得目的基因的常用方法有从基因文库中获取、化学合成法和利用PCR技术扩增等。(3)由题图可知,将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,水解产物中的肽含量差别不大,但抗凝血活性差别较大,推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关。不同肽的功能不同主要与氨基酸的数目、排列顺序不同有关。
答案　(1)mRNA　多肽链　密码子具有简并性(一种氨基酸对应多个密码子)
(2)从基因文库中获取　化学方法合成　DNA双链复制
(3)种类　不同肽链的氨基酸数目、排列顺序不同导致功能出现差异
(4)取四支试管,分别加入等量的生理盐水、蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素,再向四支试管中各加入等量的新鲜血液,观察四支试管中血液的凝血情况

基因工程与蛋白质工程的比较
(1)区别。
项目
基因工程
蛋白质工程
过程
筛选和获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质
　
续表
项目
基因工程
蛋白质工程
实质
定向改造生物的遗传特性,以获得人类所需的生物类型和生物产品
定向改造或生产人类所需的蛋白质
结果
只能生产自然界已存在的蛋白质
可生产自然界没有的蛋白质
(2)联系。
①蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。
②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行改造。
考点四　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定

1.DNA的粗提取与鉴定。
(1)实验原理。

(2)方法步骤(以洋葱为例)。

2.DNA片段的扩增及电泳鉴定。
(1)原理。
①PCR原理:DNA的热变性原理,即通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。

②电泳。

(2)方法步骤。

①PCR扩增。
准备移液混合离心反应
②鉴定PCR产物→琼脂糖凝胶电泳法→配制琼脂糖溶液→制备琼脂糖凝胶→将电泳缓冲液加入电泳槽中→加样→电泳→取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
教材微点
1.(选择性必修3 P84~85 “探究·实践”)DNA的电泳鉴定实验中,影响DNA分子迁移速率的因素有哪些?
提示　电泳时,DNA分子的相对分子质量越大,受到的阻力越大,迁移速率越慢,DNA分子的相对分子质量越小,受到的阻力越小,迁移速率越快。
2.(选择性必修3 P84~85 “探究·实践”)你进行电泳鉴定的结果是几条条带?如果不止一条条带,请分析产生这个结果的可能原因。
提示　多条条带。不止一条条带的原因:操作过程中混入限制酶将DNA片段切割成片段或还有其他DNA片段,以此为模板,进行了扩增。

1.DNA的粗提取与鉴定的注意事项。
(1)加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免加剧DNA分子的断裂,导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
(2)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料,原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。
(3)鉴定DNA时,一支试管为对照组,另一支试管为实验组。两支试管中都先加物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液;在实验组试管中加DNA丝状物,对照组不加;加入二苯胺试剂后沸水浴加热。结果可以看到加DNA丝状物的试管呈现蓝色,对照组无色。如果实验组蓝色较浅,说明提取出的DNA量太少。
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定。
(1)为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)该实验所需材料可以直接从公司购买,缓冲液和酶应分装成小份,并在-20 ℃储存。使用前,将所需试剂从冰箱拿出,放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换,避免试剂的污染。
(4)在进行操作时,一定要戴好一次性手套。
(5)观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。

角度一 围绕DNA的粗提取与鉴定,考查实验探究能力
1.下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述,错误的是(　　)
A.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B.DNA析出过程中,搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C.预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
解析　哺乳动物(如兔)成熟的红细胞无细胞核,细胞内基本不含DNA,故兔血不宜作为该实验的实验材料,A项错误;DNA析出过程中,搅拌要轻柔,以防DNA断裂,B项正确;DNA不溶于冷乙醇,向DNA提取液中加入适量预冷的乙醇溶液,会使DNA析出,从而进一步提纯DNA,C项正确;向溶有DNA的溶液中加入二苯胺试剂,沸水浴加热数分钟,溶液出现蓝色,D项正确。
答案　A
2.(2023·贵州遵义联考)如图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图,相关叙述正确的是(　　)

图1　 图2
A.图1中溶液a是物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液
B.图2所示实验操作中有一处明显错误,可能导致试管2中蓝色变化不明显
C.图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精,而蛋白质等杂质不溶酒精
D.图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色
解析　图1中溶液a是NaCl溶液,其目的是溶解DNA,DNA在物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中的溶解度较高,在物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最低,A项错误;图2所示实验的试管中,溶液的液面高于烧杯中的液面,可能导致加热不充分,试管2中蓝色变化不明显,B项正确;图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精,而蛋白质等杂质能溶于酒精,C项错误;图2试管1起对照作用,目的是证明沸水浴条件下,物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色,而DNA遇二苯胺出现蓝色,D项错误。
答案　B
角度二 围绕DNA片段的扩增及电泳鉴定,考查科学探究能力
3.下列关于PCR操作过程的叙述,错误的是(　　)
A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B.PCR利用了DNA的热变性原理
C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后,迅速融化
D.在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换
解析　为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌,A项正确;PCR利用了DNA的热变性原理,B项正确;缓冲液和酶应分装成小份,在-20 ℃储存,使用前,将所需试剂从冰箱取出,放在冰块上缓慢融化,C项错误;在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换,以免其他成分的污染,D项正确。
答案　C
4.(不定项)在基因工程操作过程中,科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体,进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图所示。以下相关叙述中,不正确的是(　　)

A.该载体最可能为链状DNA分子
B.两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C.限制酶R1与R2的切点最短相距约200 bp
D.限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂
解析　当仅用一种限制酶切割载体时,仅产生一种长度的DNA片段,因此该载体最有可能为环状DNA分子,A项错误;当仅用一种限制酶切割载体时,两种限制酶切割产生的DNA片段等长,而两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段,所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点,B项正确;两种限制酶同时切割时则产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段,所以两种限制酶的酶切位点至少相距200 bp,C项正确;限制酶切割DNA分子,破坏的是作用位点上两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键,D项错误。
答案　AD

1.(2021·辽宁卷)腈水合酶(N0)广泛应用于环境保护和医药原料生产等领域,但不耐高温。利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。下列有关叙述错误的是(　　)
A.N1与N0氨基酸序列的差异是影响其热稳定性的原因之一
B.加入连接肽需要通过改造基因实现
C.获得N1的过程需要进行转录和翻译
D.检测N1的活性时先将N1与底物充分混合,再置于高温环境
解析　在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1),则N1与N0氨基酸序列有所不同,这可能是影响其热稳定性的原因之一,A项正确;蛋白质工程的作用对象是基因,即加入连接肽需要通过改造基因实现,B项正确;N1为蛋白质,蛋白质的合成需要经过转录和翻译两个过程,C项正确;酶具有高效性,检测N1的活性需先将其置于高温环境,再与底物充分混合,D项错误。
答案　D
2.(2020·北京卷)为了对重金属污染的土壤进行生物修复,研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接,导入杨树基因组中(如图)。

为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因,同时避免内源HMA3基因的干扰,在进行PCR扩增时,应选择的引物组合是(　　)
A.①+③ B.①+②
C.③+② D.③+④
解析　为了检测转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因,并避免内源HMA3基因的干扰,在扩增时则不能包括HMA3基因,可通过检测是否含有外源高效启动子基因,因此选择的引物组合为①+②,B项正确;①+③只有一条链的引物,不能完成两条链的扩增,A项错误;③+②、③+④扩增的片段中均含有HMA3基因,C、D两项错误。
答案　B
3.(2021·山东卷)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点,该位点结合BCL11A蛋白后,γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列,解除对γ基因表达的抑制,可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段,将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测,以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。

注:F1~F7、R:引物
P:雌激素诱导下发挥作用的启动子。

(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知,在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是　　　　,在R末端添加的序列所对应的限制酶是　　　　。本实验中,从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要　　　　种酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是
　　　　　　　　　　　　　　。
(3)向培养液中添加适量的雌激素,含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列,据此结果可推测,BCL11A蛋白结合位点位于　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　,理由是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。
解析　(1)观察含载体的部分结构的图示,荧光蛋白基因的左侧为终止子,为了将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达,扩增后的产物的插入点应在荧光蛋白基因的右侧,而荧光蛋白基因的右侧有三个限制酶切点,分别是MunⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ限制酶的切点,但因为用EcoRⅠ会破坏荧光蛋白基因,所以只能用MunⅠ和XhoⅠ切割,切割后的载体图示如图:

扩增后的产物的两端添加限制酶后得到的DNA片段能够替换上图载体中位于MunⅠ和XhoⅠ限制酶切割位点之间的片段,并能与左侧的荧光蛋白基因片段及右侧的P片段连接起来。由于F1~F7中有XhoⅠ限制酶切割位点,所以需寻找能代替XhoⅠ限制酶,且切割后的产物能与XhoⅠ限制酶切割后的产物连接的限制酶,而SalⅠ就符合这一要求,所以在F1~F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ;而调控序列及启动子中含有MunⅠ的切割位点,所以需寻找能代替MunⅠ的限制酶,且切割后的产物能与MunⅠ限制酶切割后的产物连接,而EcoRⅠ就符合这一要求;所以在R末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ,扩增后的产物的两端添加的限制酶识别序列如图所示:

即用EcoRⅠ和SalⅠ切割调控序列及启动子,用MunⅠ和XhoⅠ切割载体。本实验中,从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要Taq酶、SalⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、MunⅠ、DNA连接酶共6种酶。(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞,成功转化后,含F1~F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白,受体细胞有荧光,说明F1~F6与R扩增产物含完整的启动子,荧光蛋白基因表达;含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光,说明F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达。(3)向培养液中添加适量的雌激素,雌激素能诱导启动子发挥作用。构建的载体含有BCL11A基因,导入构建载体的受体细胞能合成BCL11A蛋白。含F1~F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光,说明F1~F4与R扩增产物上均有BCL11A蛋白的结合位点(调控启动子,荧光蛋白基因不表达),因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧);而含F5~F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光,说明F5~F6与R扩增产物上均无结合位点(启动子完整,荧光蛋白基因能表达),可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
答案　(1)SalⅠ　EcoRⅠ　6　(2)F7与R扩增产物不含完整的启动子,荧光蛋白基因不表达　(3)引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上　根据有无荧光情况判断,F1~F4与R扩增产物上均有结合位点,因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧);F5~F6与R扩增产物上均无结合位点,可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧),所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
4.(2021·河北卷)采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉(Cd)在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内,进行后续处理(例如,收集植物组织器官异地妥善储存),可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力,研究者将酵母液泡Cd转运蛋白(YCF1)基因导入受试植物,并检测了相关指标。
回答下列问题:
(1)为获取YCF1基因,将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接,导入受体菌的群体中储存,这个群体称为　　　　　　。
(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时,所需要的两种酶是　　　　　　　　。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因,其作用是　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)进行前期研究时,将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜,采用最多的方法是　　　　　　　　　　　　。
研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系,采用不育株系作为实验材料的目的是　　　　　　　。
(4)将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中,半年后测定植株干重(图1)及不同器官中Cd含量(图2)。据图1可知,与野生型比,转基因植株对Cd具有更强的　　　　(填“耐性”或“富集能力”);据图2可知,对转基因植株的　　　　进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
　
图1 图2
(5)已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析,转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是　　　　　　　　　　　　　　。
相较于草本植物,采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于　　　　　　　 (写出两点即可)。
解析　(1)为获取YCF1基因,将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接,导入受体菌的群体中储存,这个群体含有酵母菌的全部基因,称为基因组文库。(2)将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时,需要用限制酶切割供体DNA和质粒,以产生相同的黏性末端,然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。(3)农杆菌容易侵染双子叶植物,其质粒中的T⁃DNA可转移并插入到受体细胞DNA中,将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜,采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性,采用不育株系作为实验材料,可避免目的基因在自然界中的扩散。(4)根据分析可知,与野生型比,转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加,说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好,即对Cd具有更强的耐性;据图2分析,转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型,因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理,可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用,对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。(5)YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡,可通过主动运输将Cd离子运到液泡中,提高了细胞液的浓度,有利于植株吸水,所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境。相较于草本植物,杨树具有发达的根系和高大的树冠,更适应污染矿区等不良环境,同时可充分吸收土壤中的Cd,木材也方便运输、利用,作为Cd污染土壤修复植物更具有优势。
答案　(1)基因组文库　(2)限制酶和DNA连接酶　便于目的基因的检测和鉴定　(3)农杆菌转化法　避免目的基因在自然界中的扩散　(4)耐性　茎、叶
(5)YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中,提高了细胞液的浓度,有利于植株吸水　杨树具有发达的根系和高大树冠,更适应污染矿区等不良环境,同时可充分吸收土壤中的Cd,木材也方便运输、利用