2024届人教版高中生物一轮复习基因工程及生物技术的安全性与伦理问题学案（不定项）

这是一份2024届人教版高中生物一轮复习基因工程及生物技术的安全性与伦理问题学案（不定项），共37页。
第36讲　基因工程及生物技术的安全性与伦理问题
[课标要求]　1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。4.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质。5.概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质。6.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程。7.探讨转基因技术在应用过程中带来的影响。8.中国禁止生殖性克隆人。9.世界范围内应全面禁止生物武器。10.实验：DNA的粗提取与鉴定和利用PCR扩增DNA片段并完成电泳鉴定。

考点一　重组DNA技术的基本工具与基本操作程序

一、基因工程的概念

二、基因工程的基本工具
1．限制性内切核酸酶

2．DNA连接酶

3．载体

三、基因工程的基本操作程序
1．目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要是指编码蛋白质的基因。
(2)筛选目的基因的方法
①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
PCR
2．基因表达载体的构建
(1)构建基因表达载体的目的
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成

(3)基因表达载体的构建过程

3．将目的基因导入受体细胞
生物种类
植物
动物
微生物
常用方法
农杆菌转化法、花粉管通道法
显微注射法
Ca2＋处理法
受体细胞
体细胞或受精卵　
受精卵
原核细胞
转化
过程
将目的基因插入Ti质粒的T­DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入
4.目的基因的检测与鉴定
检测水平
检测目的
检测方法
分子水平
目的基因是否插入到转基因生物染色体DNA上
PCR、分子杂交等技术
目的基因是否转录出了mRNA
目的基因是否翻译出蛋白质
抗原—抗体杂交
个体水平
转基因生物是否表现出相应的特性
抗性实验
【易错辨析】
(1)目的基因就是指编码蛋白质的基因。(×)
(2)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。(√)
(3)用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物。(√)
(4)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部分，有了它才能驱动DNA的复制过程。(×)
(5)构建基因表达载体过程中通常用同种限制酶切割质粒和目的基因。(√)
(6)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达。(√)
(7)应用PCR技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完成表达。(×)
(8)转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(√)
【长句应答】
1．构建基因表达载体的目的是什么？
提示：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
2．为什么不能将目的基因插入载体的标记基因中？
提示：标记基因用于鉴定目的基因是否成功导入受体细胞，以便将含目的基因的细胞筛选出来，若标记基因中有目的基因插入，则标记基因被破坏，无法进行筛选。

1．限制酶的选择方法
根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因等来确定限制酶的种类。

(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma Ⅰ。
(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和筛选，如图乙中的质粒不能使用Sma Ⅰ切割。
2．目的基因的检测与鉴定方法
(1)载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相应抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素，就可以只保留转入载体并已表达的受体细胞，原理如图所示：

(2)使用目的基因作探针，利用DNA分子杂交技术，检测受体细胞的载体上是否含目的基因。
(3)使用目的基因作探针，运用分子杂交技术检测目的基因是否转录出特定mRNA。
(4)采用抗原—抗体杂交技术，从转基因生物中提取蛋白质(作抗原)，与相应抗体杂交，依据是否出现杂交带确认目的基因是否“指导”特定蛋白质的合成。
(5)采用抗虫、抗病毒等接种实验，进行目的基因成功表达的“个体生物学”水平的鉴定。

考向一　基因工程的基本工具
1．(2023·青岛模拟)下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是(　　)
限制酶名称
识别序列和切割位点
限制酶名称
识别序列和切割位点
BamHⅠ
G↓GATCC
KpnⅠ
GGTAC↓C
EcoRⅠ
C↓AATTC
Sau3AⅠ
↓GATC
HindⅡ
GTY↓RAC
SmaⅠ
CCC↓GGG
注：Y为C或T，R为A或G。
A．HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端
B．Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C．BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D．一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
解析：选D　HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶沿着中轴线切口切开，切割后形成平末端，A正确；Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割位点在识别序列的外部，B正确；BamHⅠ限制酶识别GGATCC序列，Sau3AⅠ限制酶识别GATC序列，切割后形成相同的黏性末端GATC，C正确；HindⅡ能识别GTCAAC，也能识别GTTAAC，D错误。
2．(2021·全国Ⅰ卷)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。

回答下列问题：
(1)常用的DNA连接酶有E.coliDNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中________酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA连接酶连接。上图中________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是________。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能__________；质粒DNA分子上有______________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是______________。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指__________________。
解析　(1)限制酶EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ切割形成的是黏性末端，限制酶Sma Ⅰ和EcoR V切割形成的是平末端，E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4 DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcoR Ⅰ和Pst Ⅰ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coliDNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶Sma Ⅰ和EcoR V切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4 DNA连接酶连接。(2)DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。(3)质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制性内切核酸酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(4)启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。
答案　(1)EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ　EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ、Sma Ⅰ和EcoR V　(2)磷酸二酯键　(3)自我复制　一至多个限制酶切位点　用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞　(4)位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
考向二　PCR技术的应用
3．(2022·济南质检)如图为利用PCR技术扩增特定DNA片段的部分示意图，图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。下列有关描述错误的是(　　)

A．利用PCR技术扩增目的基因时不需要解旋酶而需要耐高温的DNA聚合酶
B．引物是子链合成延伸的基础，子链沿着模板链的3′→5′方向延伸
C．从理论上推测，第四轮循环产物中只含有引物A的DNA片段所占的比例为1/16
D．在第三轮循环产物中才开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段且占1/2
解析：选D　利用PCR技术扩增目的基因时不需要解旋酶，该过程中氢键的断裂是通过高温完成的，而子链延伸过程需要耐高温的DNA聚合酶，A正确；耐高温的DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即子链沿着模板链的3′→5′方向延伸，B正确；DNA复制为半保留复制，DNA复制4次，共形成24个DNA，其中2个DNA含有母链和子链(引物A或引物B)，(24－2)个DNA都含有子链(含有引物A和引物B)，因此，第四轮循环产物中只含有引物A的DNA片段所占的比例为1/16，C正确；第三轮循环共形成8个DNA，其中只有2个两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，含量为1/4，D错误。
4．(2021·全国甲卷)PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是________(用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是________。PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是________。
(3)为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与________特异性结合。
(4)PCR(多聚酶链式反应)技术是指________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
解析　(1)为了检测病人是否感染了某种病原菌，首先应采集病人组织样本，然后从病人组织样本中提取DNA，利用PCR扩增DNA片段后，再分析PCR扩增结果，所以正确的操作顺序是④②③①。(2)PCR技术中用到的DNA聚合酶是Taq酶，又称热稳定DNA聚合酶，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性和延伸三步。复性是温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)PCR反应所用引物要根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计，要检测是否感染病原菌，应根据该病原菌的DNA碱基序列合成引物。这样PCR反应所用的引物会与某种病原菌的DNA特异性结合。(4)PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，通过这一技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。
答案　(1)④②③①　(2)DNA聚合酶　延伸　引物通过碱基互补配对与单链DNA结合　(3)病原菌DNA　(4)在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术
考向三　基因工程的基本操作程序
5．(2022·济南高三联考)戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2基因编码的结构蛋白(pORF2)位于病毒表面，构成病毒的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程如图。下列关于该疫苗的叙述，正确的是(　　)

A．过程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、C
B．重组基因表达载体上的启动子需来源于戊型肝炎病毒
C．过程⑤需要用聚乙二醇处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
D．过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定
解析：选D　戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，过程①是以病毒RNA为模板合成DNA，获取目的基因的过程，需要的酶是逆转录酶，原料是四种脱氧核苷酸，A错误；启动子是一段有特殊结构的DNA片段，其作用是供RNA聚合酶的识别结合以驱动目的基因的转录，启动子具有物种或组织特异性，构建在大肠杆菌细胞内特异表达pORF2蛋白的载体时，需要选择大肠杆菌细胞的启动子，而不能选择其他物种和组织细胞的启动子，B错误；将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2＋处理法，需要用Ca2＋处理大肠杆菌，增大大肠杆菌细胞壁的透过性，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C错误。
考点二　DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增与电泳鉴定

1．DNA的粗提取与鉴定
(1)基本原理
①提取思路：利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
②DNA的性质：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精；DNA能溶于2 mol·L－1的NaCl溶液。
③DNA的鉴定：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
(2)方法步骤

2．DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础
①PCR原理：利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
②电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
③PCR产物的鉴定：一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
(2)PCR实验操作步骤

(3)DNA的电泳鉴定

【易错辨析】
(1)在溶有DNA的NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色。(×)
(2)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。(√)
(3)进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 ℃储存。(×)
(4)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关。(×)
【长句应答】
1．DNA的粗提取实验中过滤能否用滤纸代替纱布？
提示：不可以，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。
2．DNA片段电泳鉴定的原理是什么？
提示：DNA分子在碱性条件下(pH＝8.0的缓冲液)带负电，在电场力的驱动下，从负极向正极在琼脂糖凝胶的孔洞中蠕动；核酸染料带正电，在电场力的驱动下，从正极向负极运动，遇到DNA就嵌入其中完成染色，但这个颜色可见光下看不到，需要紫外光激发。

考向一　DNA的粗提取与鉴定
1．(2022·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是(　　)
A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
解析：选B　低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。
2．(2023·黄山模拟)如图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中几个重要操作的示意图，下列叙述不正确的是(　　)

A．通过①操作使NaCl溶液浓度降至0.14 mol/L，析出DNA
B．经①②操作，DNA留在纱布上；经③②操作，则DNA留在滤液中
C．图④是用预冷的体积分数为95%的酒精来进一步纯化粗提取的DNA
D．图①③④都需要玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，以防止破坏DNA
解析：选D　DNA的粗提取实验原理是0.14 mol/L NaCl溶液中DNA溶解度最低，用蒸馏水将2 mol/L NaCl溶液浓度调制0.14 mol/L，析出的是DNA，丢弃的是滤液，故通过①操作使NaCl溶液浓度降至0.14 mol/L，析出DNA，A正确；经①操作DNA已经析出，再经过②操作后，DNA留在纱布上；经③操作，细胞会破碎，细胞中DNA会释放到滤液中，再经过②操作过滤，将杂质过滤掉，DNA留在滤液中，B正确；图④是用预冷的体积分数为95%的酒精来进一步纯化粗提取的DNA，C正确；图①③④都需要玻璃棒沿一个方向搅拌，以防止破坏DNA，但③要求快速搅拌，以使红细胞破裂，D错误。
考向二　DNA片段的扩增与电泳鉴定
3．(2022·滨州二模)脱氧核苷三磷酸(dNTP)3′­C上的­OH被­H替换后转化为双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。在PCR反应体系中加入待测DNA片段、4种dNTP、1种32P标记的ddNTP和1种引物及其他所需材料，经扩增后获得不同长度的DNA片段混合物。利用每种32P标记的ddNTP分别进行PCR后，将产物点样在变性凝胶上进行电泳分离，通过放射性自显影检测，就可以读出DNA的核苷酸序列。下图为某待测DNA片段的电泳检测结果，下列说法错误的是(　　)

A．PCR反应体系中的热稳定DNA聚合酶可催化磷酸二酯键的形成
B．连接到核苷酸链上的ddNTP因3′­C上没有—OH而导致DNA延伸中断
C．该DNA片段的待测碱基序列为5′－TTGGCTGCAA－3′
D．该PCR过程中待测DNA片段只有1条链作为模板
解析：选C　PCR体系中温度可达到90 ℃以上，延伸过程中需要热稳定DNA聚合酶催化不同脱氧核糖核苷酸之间形成磷酸二酯键，A正确；ddNTP为双脱氧核苷三磷酸，只要ddNTP掺入链端，该链就停止延长的原因是3′­C上不是­OH，不能与下一个脱氧核苷酸的磷酸形成磷酸二酯键，B正确；当ddNTP结合时，DNA合成终止，因此DNA合成链可能随机停止在任何碱基处，根据四种碱基的条带位置反向推出DNA序列。PCR扩增时，由5′端向3′端延伸，则根据电泳图及点样点的位置可知，该DNA片段的待测碱基序列为3′－TTGGCTGCAA－5′，C错误；该PCR过程中待测DNA片段如果有两条链作模板，四种碱基的条带位置可能会有四条，图示都少于四条，故只有1条链作为模板，与引物结合后，在DNA聚合酶作用下子链沿从5′端向3′端方向进行延伸反应，D正确。
4．(2022·济南调研)人类胰岛素基因位于第11号染色体上，长度为8 416 bp，人类胰岛素的氨基酸序列已知。回答下列相关问题。

(1)上图是利用PCR技术获取人胰岛素基因的方法，除了此方法外，还可以利用的方法是____________________________________________。
(2)利用PCR技术获取人胰岛素基因，在缓冲液中除了要添加模板和引物外，还需要添加的物质有________________________________。
(3)经过________轮循环可以得到所需的目的基因，一个DNA分子经过5轮循环，需要引物A________个，从PCR的过程和DNA分子的特点，试着写出设计引物需要注意的问题：________________________、____________________________(答出2点即可)。
(4)利用SDS—凝胶电泳分离不同DNA分子，迁移速度取决于____________________。
(5)利用图示方法获取的目的基因，直接构建基因表达载体后导入大肠杆菌，______(填“能”或“不能”)表达出人胰岛素，理由是________________________________。
解析　(3)题图中引物A和引物B在DNA片段内部，根据PCR的过程和DNA分子半保留复制的特点可知，前两轮循环产生的4个DNA分子的两条链均不等长，第三轮循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链，即目的基因。其过程图如下：

第一轮：

第二轮：
由①得到的DNA分子如下：

由②得到的DNA分子如下：

第三轮：由①可得

由②可得

从理论上推测，一个DNA分子经n次循环合成的DNA分子为2n个，脱氧核昔酸链数为2n＋1，新合成的脱氧核苷酸链数为2n＋1－2，而每合成一条脱氧核苷酸链需要一个引物，所以共需要消耗2n＋1－2个引物，即25＋1－2＝62个，其中引物A为31个。设计引物时需要注意以下几点：引物自身及引物之间不能有互补序列，以防止自身或相互连接，引物长度适当，引物能与目的基因两侧特异性结合等。(4)在凝胶中DNA分子的迁移速度与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。(5)图示获得的目的基因含有外显子和内含子，因此直接将含有此目的基因的表达载体导入大肠杆菌并不能表达出胰岛素，原因是大肠杆菌无法正常识别内含子而对内含子部分转录的mRNA进行翻译，导致合成的蛋白质出现错误。
答案　(1)从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选或人工合成
(2)四种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶
(3)3　31　引物自身不能有互补序列　引物之间不能有互补序列　(4)DNA分子的大小　(5)不能　因为此方法获得的目的基因中含有内含子，大肠杆菌无法正常识别内含子，而对内含子部分转录的mRNA进行翻译，导致合成的蛋白质出现错误
考点三　基因工程的应用和蛋白质工程

1．基因工程的应用

2．蛋白质工程的原理和应用
(1)蛋白质工程的概念

(2)蛋白质工程的基本原理

(3)蛋白质工程的应用
①医药工业方面：研发药物，如延长干扰素的保存时间；降低小鼠单克隆抗体诱发免疫反应的强度。
②其他工业方面：改进酶的性能或开发新的工业用酶。
③农业方面：通过改造某些参与调控光合作用的酶，增加粮食产量；改造微生物蛋白质的结构，设计优良微生物农药，防治病虫害。
【易错诊断】
(1)Bt基因来源于苏云金杆菌，对哺乳动物有毒害作用。(×)
(2)乳腺生物反应器是将药用蛋白基因导入动物的乳腺细胞中。(×)
(3)用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类一般称为基因工程菌。(√)
(4)为延长干扰素保存时间，需要替换氨基酸；为提高玉米中赖氨酸含量，需要在蛋白质中加入赖氨酸。(×)
(5)由大肠杆菌工程菌获得的人干扰素可直接应用。(×)
(6)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改造分子的结构。(×)
【长句应答】
1．利用转基因技术获得的已整合药用蛋白基因的转基因小鼠分泌的乳汁中检测不到药用蛋白，根据中心法则分析，其可能的原因是_________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________。
提示：药用蛋白基因没有转录或翻译。
2．对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？原因是什么？
提示：通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造。原因是任何蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的基因可以遗传下去。如果对蛋白质直接进行改造，即使改造成功了，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传。

1．乳腺生物反应器与工程菌生产药物的区别
比较内容
乳腺生物反应器
工程菌
含义
指让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白
指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类
基因表达
合成的药物蛋白与天然蛋白质相同
细菌合成的药物蛋白可能没有活性
受体细胞
动物受精卵
微生物细胞
目的基因
导入方式
显微注射法
感受态细胞法
生产条件
不需严格灭菌；温度等外界条件对其影响不大
需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件
药物提取
从动物乳汁中提取
从微生物细胞或其培养液中提取
2.蛋白质工程与基因工程的区别和联系
项目
蛋白质工程
基因工程
过程
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质
筛选与获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需要的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果
可生产自然界中不存在的蛋白质
只能生产自然界中已存在的蛋白质
联系
蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程

考向一　基因工程的应用
1．(2022·淄博一模)为确定W基因在染色体上的位置，研究人员进行了如下操作：①破裂细胞后将染色体固定在玻片上，去除mRNA及染色体上的蛋白质，拍摄染色体得到显微照片1。②制备32P标记的W基因探针(单链DNA)。③将玻片上的染色体DNA变性为单链后，置于含W基因放射性探针的杂交溶液中温育一段时间。④洗脱玻片上未杂交的放射性探针，对玻片进行放射性自显影处理得到照片2。⑤将照片1和照片2叠加，确定W基因的所在染色体及其位置。下列分析错误的是(　　)
A．可用A－32P～P～P制备W基因的放射性探针
B．W基因探针的碱基序列与W基因中某条单链的部分碱基序列相同或互补
C．去除染色体上的蛋白质并将DNA变性为单链有利于DNA与探针完成杂交
D．去除mRNA可以防止W基因的mRNA与探针杂交，对实验结果产生干扰
解析：选A　W基因探针为单链DNA，可用dA－32P～P～P制备W基因的放射性探针，A错误；W基因所在的DNA是碱基互补的两条链，W基因探针能与W基因中其中一条单链进行碱基互补配对，因此W基因探针的碱基序列与W基因中某条单链的部分碱基序列相同或互补，B正确；染色体主要是由蛋白质和DNA组成的，同时DNA是双链结构，而探针是单链DNA，因此去除染色体上的蛋白质并将DNA变性为单链有利于DNA与探针完成杂交，C正确；DNA可与RNA发生部分的碱基互补配对，因此去除mRNA可以防止W基因的mRNA与探针杂交，对实验结果产生干扰，D正确。
2．(2022·全国乙卷)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT－PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是________。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明
________________________________________________________________________________________________________________________________________________(答出1种情况即可)；
若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明__________________________________ __________________________________________________________________________________________________________________。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析　(1)以RNA为模板合成cDNA的过程需要逆转录酶起催化作用。(2)在设计PCR引物时，为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，应依据新冠病毒RNA中一段特有的核苷酸序列来进行。PCR过程每次循环分为3步，变性(温度为90 ℃以上)、复性(温度为50 ℃左右)、延伸(温度为72 ℃左右)，故其中温度最低的一步是复性。(3)在对某人同时进行核酸检测和抗体检测时，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该人近期可能感染过新冠病毒，经自身免疫系统的作用，体内病毒被消灭，但体内产生的抗体尚未消失。若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明该人感染了新冠病毒，且机体免疫系统产生了相应抗体，但还未将病毒完全消灭。(4)基因工程的基本流程是：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
答案　(1)逆转录酶(或反转录酶)　(2)一段特有的核苷酸序列　复性　(3)该人近期可能感染过新冠病毒，经自身免疫系统的作用，体内病毒被消灭，但体内产生的抗体尚未消失　该人感染了新冠病毒，且机体免疫系统产生了相应抗体，但还未将病毒完全消灭　(4)目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
考向二　蛋白质工程及其应用
3．(2023·南京模拟)下列有关蛋白质工程的叙述正确的是(　　)
A．蛋白质工程不需要构建基因表达载体
B．通过蛋白质工程改造后的蛋白质有的仍是天然的蛋白质
C．蛋白质工程需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶
D．蛋白质工程是在蛋白质分子水平上改造蛋白质的
解析：选C　蛋白质工程是对基因进行修饰改造或重新合成，然后进行表达，需构建基因表达载体，A错误；通过蛋白质工程改造后的蛋白质不再是天然的蛋白质，B错误；蛋白质工程是对基因进行修饰改造或重新合成，需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶，C正确；蛋白质工程是在基因水平上改造蛋白质的，D错误。
4．(2022·湖南卷)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是________，物质b是________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是____________________。

(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有________________、________________和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是________________________。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的________(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是_________________________________ _______________________________________________________________________________________________________________。

(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路_________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析　(1)据分析可知，物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是DNA双链复制。(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，实验设计思路为：取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间。
答案　(1)氨基酸序列多肽链　mRNA　密码子的简并性　(2)从基因文库中获取目的基因　通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成　DNA双链复制　(3)种类　提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏　(4)取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间
考点四　生物技术的安全性与伦理问题

一、转基因产品的安全性
1．转基因成果

2．对转基因产品安全性的争论

3．理性看待转基因技术
(1)理性看待转基因技术
①清晰地了解转基因技术的原理和操作规程。
②看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素的影响。
③靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。
(2)我国对转基因技术的方针是一贯的、明确的，就是研究上要大胆，坚持自主创新；推广上要慎重，做到确保安全；管理上要严格，坚持依法监管。
二、关注生殖性克隆人

三、禁止生物武器

【易错辨析】
(1)转基因作为一项技术本身是中性的。(√)
(2)种植转基因植物有可能因基因扩散而影响野生植物的遗传多样性。(√)
(3)转抗虫基因的植物，不会导致昆虫群体抗性基因频率增加。(×)
(4)中国政府的态度是坚决反对生殖性克隆和治疗性克隆。(×)
(5)与常规武器相比，生物武器的致病能力强、攻击范围广。(√)
(6)中国反对生物武器，但中国在特殊情况下可以生产生物武器。(×)
【长句应答】
1．转基因鱼成功的物质基础是什么？
提示：转基因技术能够进行的物质基础是各种细胞生物都是以DNA分子作为遗传物质，且各种生物都共用一套遗传密码。
2．鱼类易于逃逸、扩散，因此转基因鱼的生态安全性问题是很值得研究的问题，试分析引起生态安全性问题的原因。
提示：转基因鱼与同种野生鱼杂交，使野生鱼带有转基因，具有生长优势，使其捕食对象大量减少，与其他物种竞争加剧，引起生态危机。
3．试从保障生态安全性问题分析我国科学家只投放三倍体鱼到自然生态系统的原因。
提示：三倍体鱼不能繁殖，可以人工控制养殖数量和范围，避免发生杂交、竞争，引起生态危机。

考向一　转基因产品的安全性
1．(2022·临沂高三期末)美国科学家在研究生长在墨西哥某地的野生玉米后发现，这种玉米含有包括苏云金芽孢杆菌抗虫毒蛋白基因在内的转基因作物的基因，下列有关叙述中正确的是(　　)
A．转基因作物的基因可传播到野生植物中
B．转基因作物不可能对天然植物的遗传多样性构成威胁
C．为防止基因污染，应当禁止转基因作物的研究
D．自然杂交与转基因过程没有任何区别
解析：选A　转基因作物可通过花粉散落到它的近亲野生植物中，从而污染生物基因库，A正确；转基因植物可能会与野生植物杂交，造成基因污染，因而可能会对天然植物的遗传多样性构成威胁，B错误；虽然转基因生物存在危害，但我们应理性地看待转基因生物的研究，C错误；自然杂交是同种生物个体之间的基因交流，而转基因是将外源基因导入受体细胞的过程，即不同生物之间基因的交流，D错误。
2．对转基因生物的安全性发生争论，与科学发展水平的限制有密切关系。下面关于基因的相关知识中，不可能是争论原因的是(　　)
A．对基因的结构和调控机制等的了解仍相当有限
B．所转移的基因有不少是异种生物的基因
C．外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的
D．DNA重组技术需要有精心设计的“分子工具”
解析：选D　转基因生物是否安全关键在转移后的基因，而技术操作过程中所需的“分子工具”与转基因生物的安全性的关系不大。
考向二　关注生殖性克隆人、禁止生物武器
3．(2022·河北百师联盟联考)2018年11月，世界首例免疫艾滋病的基因编辑婴儿诞生。这项研究用到了能够精确定位并修饰基因的基因编辑技术，即基因编辑时用约为头发二十分之一细的针把Cas9蛋白和特定的RNA引导序列注入受精卵中，对CCR5基因进行修改，预期婴儿出生后能天然抵抗人类免疫缺陷病毒，关于该技术的安全性问题，下列说法错误的是(　　)
A．基因编辑时，引导序列可能发生变异，导致剪切错误，造成不可预知的后果
B．经过基因编辑的个体，有可能影响基因选择性表达，而导致其他疾病的产生
C．将基因编辑技术应用于治疗性克隆，符合人类伦理道德
D．只要加强监管、完善法律法规、完善技术手段，不需担心基因编辑技术的安全性
解析：选D　可以加强监管、完善法律法规、完善技术手段，但基因编辑技术仍存在一定的安全性问题，D错误。
4．下列关于生物武器的说法，错误的是(　　)
A．生物武器包括致病菌类、病毒类、生化毒剂类等
B．利用炭疽杆菌制成的生物武器，具有传染性极强、致死率极高的特点
C．中美两国发布联合声明，重申在一般情况下不发展、不生产、不储存生物武器
D．彻底销毁生物武器是世界上大多数国家的共识
解析：选C　中美两国发布联合声明，重申在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散，C错误。

与PCR技术相关的生物学科素养

1．生命观念主要体现在：
(1)物质与能量观：PCR扩增目的基因需要模板原料并消耗能量。
(2)结构与功能观：PCR仪、微量移液管、微量离心管等的使用以及注意事项。
2．科学思维主要体现在：
(1)归纳与概括：比较PCR技术和DNA体内复制的异同。
(2)分析与推理：PCR技术中引物的选取。
3．科学探究主要体现在：
(1)实验操作能力：探究DNA片段的扩增及电泳实验中PCR反应体系的配方的配制以及实验流程中的动手操作能力。
(2)实验现象的观察、分析能力：对DNA片段的扩增及电泳实验结果的观察、分析。
4．社会责任主要体现在：
PCR扩增的用途包括获取目的基因、对感染疾病(核酸检测)的诊断等。

[典例]　(2020·江苏卷)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图(以EcoR Ⅰ酶切为例)：

请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种________酶，它通过识别特定的________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′­羟基与5′­磷酸间形成________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得________；TaqDNA聚合酶的作用是催化________。
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。

DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知
序列


PCR
引物
①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′
②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′
③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′
④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是____________。
A．5′－AACTATGCGAGCCCTT－3′
B．5′－AATTCCATGCTGAATT－3′
C．5′－GCAATGCGTTCGGGAA－3′
D．5′－TTGATACGOCGAGTAC－3′
[思维建模]
信息
指引
(1)已知一小段DNA的序列，采用PCR扩增目的基因
(2)已知的DNA序列和PCR引物序列
(3)PCR产物测序
误区
点睛
(1)EcoR Ⅰ酶不仅能够切下目的基因，还能够切开载体
(2)质粒是环状DNA分子，限制酶切割后得到一个DNA双链
(3)一个目的基因的引物有两种
答题
要语
(1)基因工程的剪刀是限制酶
(2)DNA聚合酶催化磷酸二酯键形成
(3)高温具有和解旋酶相似的作用，可使氢键断裂
核心
素养
(1)结合题干信息，分析PCR技术的过程，形成科学思维习惯
(2)掌握PCR技术的原理和三个基本步骤，学以致用，指导生产生活，培养社会责任
解析　(1)EcoR Ⅰ是一种限制性内切核酸酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定的位点。(2)DNA连接酶可催化相邻核苷酸之间的3′­羟基和5′­磷酸之间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95 ℃时，DNA受热变性后解旋为单链；TaqDNA聚合酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA链为模板的DNA链的延伸。(3)引物是一小段单链DNA，引物5′端的碱基可以与DNA两条链的3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5′→3′，据题图分析，结合已知序列可知，能与片段F左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤Ⅲ选用的PCR引物应当为②④。(4)对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoR Ⅰ剪切的两端，它识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5′端应该是AATTC,3′端是GAATT，故选B。
答案　(1)限制性内切核酸(或限制)　核苷酸序列
(2)磷酸二酯键　DNA单链　以DNA为模板的DNA链的延伸　(3)②④　(4)B

1．荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如下图)。下列说法不正确的是(　　)

A．该技术的原理是DNA的体外复制，需要用到解旋酶和Taq酶
B．该技术需要用到一对引物，且引物之间的碱基序列不能互补
C．该技术中DNA聚合酶只能从引物的3′端开始延伸DNA链
D．若循环次数相同，荧光值越高，证明新冠病毒感染程度越高
解析：选A　PCR技术用的原理是DNA的体外复制，其中双链解聚靠的是高温，不需要解旋酶，A错误；PCR技术用到的引物之间的碱基序列不能互补，以免影响引物与模板链的结合，B正确；DNA聚合酶只能从引物的3′端开始延伸DNA链，C正确；循环次数相同时，荧光值越高，证明感染的新冠病毒越多，感染程度越高，D正确。
2．(2023·连云港模拟)常用的PCR技术有实时荧光定量PCR、RT­PCR、重叠延伸PCR等，其中重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景。利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因的合理改造，过程如下图所示。回答下列问题。

(1)①PCR定点突变需要设计的引物是 __________；②过程获得突变产物AD，需要使用的引物是______________________________。
(2)在第一阶段，为获得产物AB和产物CD，必须将引物a、b和引物c、d置于不同反应系统中，这是因为____________________________________。
(3)新冠病毒常用“荧光RT­PCR技术”进行检测。
①“荧光RT­PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有________、荧光标记的核酸探针、引物、dNTP、缓冲体系。
②用__________向微量离心管中依次加入各组分，稍微进行________，使反应液集中在微量离心管底部，将微量离心管放入PCR仪，设定好PCR仪的循环程序，进行PCR反应。
(4)在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加。可通过荧光强度的变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

①“平台期”出现的最可能的原因是______________________________________。
②理论上，在检测过程中有荧光标记的“杂交双链”出现，则说明检测结果呈________(填“阴”或“阳”)性，但为了保证检测结果的准确性，一般要达到或超过阈值时才确诊。现有两个待检样本，检测时都出现了上述形态的曲线，但甲的A点比乙的A点明显左移。请对这种结果做出科学合理的解释(试剂盒合格且正常，操作过程规范且准确)。________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析　(1)由题图中信息可知，定点突变位点在引物b和引物c的结合位点处，而引物a与引物b是合成产物AB的引物，引物c和引物d是合成产物CD的引物，因此需要设计引物b和引物c，使它们不发挥作用才可以得到突变产物AD；②过程获得突变引物AD是由产物AB上链延伸与CD下链延伸得到的，因此需要使用的引物是引物a和引物d。(2)引物是一段DNA，引物b和引物c对应的碱基之间多数可以配对，在一个反应系统中配对后失效。(3)①新冠病毒是RNA病毒，因此在进行RT­PCR时，需要先进行逆转录合成DNA，然后再进行PCR，因此需要逆转录酶，而RT­PCR过程中除原料、模板、能量外，还需要Taq酶以合成子链DNA。②向微量离心管中加入成分时需要用微量移液器；加入微量离心管后使反应液集中到微量离心管底部的方法是离心。(4)①平台期出现是由于随着循环次数增加，试剂盒中的原料、引物和探针被消耗完，超出一定的循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加。②检测过程中有杂交双链，说明样本中有与病毒核酸相同的核酸序列，因此结果为阳性；两个样本中，A点是阈值对应的点，甲的A点比乙的A点明显左移，说明甲样本中的新冠病毒含量更高，达到阈值所需的循环数更少。
答案　(1)引物b和引物c　引物a和引物d
(2)引物b和引物c对应的碱基之间多数可以配对，在一个反应系统中配对后失效
(3)①逆(反)转录酶、热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)　②微量移液器　离心
(4)①试剂盒中的原料、引物和探针数量一定，超出一定的循环数后，荧光标记的“杂交双链”不再增加　②阳　甲样本中的新冠病毒含量更高，达到阈值所需的循环数更少

1．(2021·山东卷)粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是(　　)
A．加入适量的木瓜蛋白酶
B．37～40 ℃的水浴箱中保温10～15分钟
C．加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精
D．加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L
解析：选A　木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物，A正确；37～40 ℃的水浴箱中保温10～15分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60～75 ℃的水浴箱中保温10～15分钟，使蛋白质变性析出，B错误；向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中，C错误；加入NaCl调节浓度至2 mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 mol/L，DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不会进入滤液中，D错误。
2．(2020·北京卷)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。

为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是(　　)
A．①＋③ B．①＋②
C．③＋② D．③＋④
解析：选B　图示中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①＋②，即B正确。
3．(2022·广东卷)大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对____________，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。

(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是______________________，终止子的作用是____________________________。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是________________________，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了________________，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于________________，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
解析　(1)利用PCR技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结合后，Taq酶才能从引物的3′端延伸子链。
(2)基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有目的基因的受体细胞，终止子可终止转录，使转录在需要的地方停下来。
(3)重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，在这些酶蛋白的作用下，二氧化碳等气体大量用于合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致生长迟缓。
(4)根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的二氧化碳等—碳温室气体为原料，实现了废物的资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
答案　(1)引物　(2)作为标记基因，筛选含有目的基因的受体细胞　终止转录，使转录在所需要的地方停下来　(3)二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长　(4)废物的资源化　不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳
4．(2022·山东卷)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG­P和FLAG­P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是________，为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是___________________ __________________________________。修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是_______________________________________________。

(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG­P、FLAG­P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG­P和FLAG­P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是________；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是____________________________________________________________。


(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是________。
解析　(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。(2)融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。(3)①组仅添加UBC处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG­P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG­P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG­P的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG­P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG­P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。(4)根据(3)的分析推测，药物A促进UBC与FLAG­P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。
答案　(1)两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补配对　5′端　(2)在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变　在EcoRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数　(3)促进UBC与FLAG­P的结合　P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列　(4)药物A促进UBC与FLAG­P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的
5．(2022·北京卷)生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质(E物质)污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白(GFP)等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。
(1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是________。
(2)为监测E物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质­受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案1相比，方案2的主要优势是________，因而被用于制备监测鱼(MO)。


(3)现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM需经MO和另一亲本(X)杂交获得。欲获得X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。
Ⅰ.启动子：________。
①ERE　②UAS　③使基因仅在生殖细胞表达的启动子(P生)　④使基因仅在肌细胞表达的启动子(P肌)
Ⅱ.基因：________。
A．GFP
B．Gal4
C．雌激素受体基因(ER)
D．仅导致生殖细胞凋亡的基因(dg)
(4)SM不育的原因是：成体SM自身产生雌激素，与受体结合后________造成不育。
(5)使拟用于实际监测的SM不育的目的是________。
解析　(1)将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，所以将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是显微注射法。(2)由图可知，方案1E物质­受体复合物激活ERE，使GFP基因表达，方案2E物质­受体复合物先激活ERE获得Gal4蛋白，然后Gal4蛋白激活UAS启动子，使GFP基因表达，方案2GFP蛋白表达量大，更灵敏。(3)MO和另一亲本(X)杂交获得SM，MO是方案2获得，所以亲本X启动子选择UAS。要获得SM是不育个体，MO是可育的所以X必须有仅导致生殖细胞凋亡的基因(dg)。(4)成体SM自身产生雌激素，与受体结合后形成复合物，激活ERE诱导Gal4表达，Gal4与UAS启动子结合诱导dg表达，使生殖细胞凋亡。(5)监测鱼属于转基因生物，目前安全性不确定，为了避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，需要SM不育。
答案　(1)显微注射　(2)监测灵敏度更高
(3)②　D　(4)激活ERE诱导Gal4表达，Gal4结合UAS诱导dg表达，生殖细胞凋亡　(5)避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题