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2024年高考生物大一轮选择性必修3复习课件：第45讲 微生物的培养技术及应用
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这是一份2024年高考生物大一轮选择性必修3复习课件：第45讲 微生物的培养技术及应用，共60页。PPT课件主要包含了重温真题经典再现，限时强化练等内容，欢迎下载使用。
课标内容 (1)阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。(2)阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。(3)举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。(4)概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。(5)概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
微生物的选择培养和计数
考点一 微生物的基本培养技术
几种微生物的营养和能量来源
2.无菌技术(1)目的：获得______________。(2)关键：______________。
(3)常见物品的消毒或灭菌方法①消毒方法及适用对象
3.微生物的纯培养 酵母菌纯培养的操作步骤：
下图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析并回答下列问题：
(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是什么？______________________________________________________________________。(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？_________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(3)接种操作为什么一定要在火焰附近进行？________________________。
获得图A效果的接种方法为稀释涂布平板法，获得图B效果的接种方法为平板划线法
最可能的原因是菌液浓度过高或
划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌
火焰附近存在着无菌区域
(1)培养基要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。(2)要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。(3)倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。(4)平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
2.平板划线法操作步骤
(2)平板划线法操作中几次灼烧接种环的目的
1.(2023·湖北襄阳四校联考)微生物培养过程中，要重视无菌操作，现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染，请分析下列操作，正确的是( )A.煮沸消毒法中100 ℃煮沸5～6 min可以杀死全部微生物的细胞和芽孢、孢子B.将接种环直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌C.加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌D.家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌
结合培养基的配制和无菌技术，考查科学思维
解析 煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢，而灭菌能杀灭环境中一切微生物，包括孢子和芽孢，A错误；指示剂和染料可能混有微生物，因此加入培养基中的指示剂和染料也需要灭菌，C错误；家庭制作葡萄酒时，要将容器进行灭菌或消毒，但是葡萄不能灭菌，因为发酵用的酵母菌来自葡萄，D错误。
2.(2023·河南名校联盟)“掌心对掌心，手心压手背，十指交叉摩，手握关节搓，拇指围轴转，指尖掌心揉，手腕别放过。”七步洗手法可以清除手部的污物和微生物，是预防新冠病毒感染的有效措施之一。某生物实验小组设计了“比较洗手前后手上细菌分布情况”的探究活动：各小组成员分别将拇指在甲组培养基上轻轻按一下，然后用肥皂将该手洗干净，再将洗净后的拇指在乙组培养基上轻轻按一下。将这两组培养基放入恒温培养箱中，在适宜温度下培养24小时后，统计两组培养基中菌落数目，请回答下列问题：
(1)该实验中用到的培养基中加入了牛肉膏、蛋白胨、NaCl和水，蛋白胨可以为微生物的生长提供_______________等营养物质，为了使配制的溶液呈固体状态，还需要加入________。为了防止外来杂菌的入侵，可以将培养基放入盛有适量________的高压蒸汽灭菌锅内灭菌15～30 min。(2)实验中“将拇指在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养操作中的________，该操作应该在酒精灯火焰附近进行，原因是____________________________________。
避免周围环境中的微生物污染培养基
(3)统计甲、乙两组培养皿中的菌落，乙组中菌落数比甲少得多，实验结果说明肥皂洗手不能彻底清除手上的微生物。为避免手上微生物在无菌操作中污染培养基，洗过的手还应进行_______________________________等方法处理(答出1种即可)。(4)有同学认为乙中也有菌落产生，是因为培养过程受到杂菌污染，请你在本实验的基础上设计一个简单的方案验证他的猜想是否正确，并预期结果和结论。_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
酒精棉球擦拭双手、戴消毒手套
再加一个不接种的相同培养基(空白培养基)，与甲、乙在相同条件下培养，若该培养基上没有生长菌落，说明培养过程未被杂菌污染，猜想错误；若该培养基上生长菌落，说明培养过程中被杂菌污染，猜想正确。
3.(2023·江苏南京调研)下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法正确的是( )
结合微生物的纯培养，考查科学探究能力
A.步骤①后需将培养基灭菌并调节pHB.步骤①②③操作时需要在酒精灯火焰附近进行C.步骤③到④的过程中，接种环共灼烧处理了5次D.图中步骤①结束后需倒置平板，④结束后不需要
解析 步骤①表示倒平板，培养基需要先调节pH后灭菌，冷却后倒平板，A错误；接种环在每次接种前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，所以步骤③到步骤④的过程中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，步骤③到步骤④的过程中，共需灼烧接种环6次，C错误；步骤④操作结束后需在培养皿的底上做好标记并倒置后放入培养箱中进行培养，D错误。
4.(2023·河北衡水金卷)丁草胺是一种有机除草剂，主要用于水稻田杂草的防除，具有潜在的致畸变和致突变性。而在水稻种植过程中农田有一段很长的淹水期，淹水会导致水稻田深层土壤处于厌氧状态。因此研究丁草胺厌氧降解菌对于水稻田土壤中丁草胺的降解具有重要意义。研究人员要对丁草胺厌氧降解菌进行分离、鉴定和扩大培养(如图)，请回答下列问题：
(1)你认为研究小组应该在哪里取样？________________________________(2)配制选择培养基时，研究人员先加入了K2HPO4、KH2PO4、FeSO4、MgCl2、NH4Cl、CaCl2、NaCl、微量元素复合液、维生素复合液等，他们还需要加入一定量的________。对培养基灭菌通常采用______________法。灭菌结束后，应趁热将适量培养基分装于锥形瓶中，充入氮气，塞住胶塞并用铝帽固定，这样操作的目的是____________________。
频繁使用丁草胺的水稻田深层土壤
(3)步骤③中，应将平板放入厌氧罐中，置于培养箱中恒温培养，对长出的菌落进行初步鉴定。菌落是初步区分微生物类型的重要特征，这些特征包括_____________________________________________ (至少答出2点)等。(4)步骤④中，从第二次划线操作起，每次总是要从上一次划线的末端开始划线，其原因是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
菌落的形状、大小、颜色、隆起程度、边缘特征
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，从上一次划线的
末端开始，能使细菌的数目随划线次数的增加逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落
解析 (1)施用过丁草胺的稻田中能够分解丁草胺的菌株数量多，易获得目的菌株，同时由于目的菌株是厌氧型微生物，故获取分离目的菌的土壤样品应从频繁使用丁草胺的水稻田深层土壤获取。(2)配制培养基时除微生物生长所必需的营养物质外，还需加入一定量的丁草胺。培养基灭菌一般采用高压蒸汽灭菌法。灭菌后的培养基趁热充入氮气的目的是去除培养基中的氧气，创造无氧环境。(3)菌落的特征包括菌落的形状、大小、隆起程度、颜色、边缘特征、光泽等。(4)划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随划线次数的增加逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
考点二 微生物的选择培 养和计数
常见选择培养基举例①缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。②含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。③无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。
2.稀释涂布平板法(1)系列稀释操作取1 mL菌液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
(1)利用稀释涂布平板法计数①为了保证结果准确，一般选择菌落数为_________的平板计数，并且在同一稀释度下，应至少对____个平板进行重复计数，并求平均值。②统计结果往往比实际值____。(2)利用显微镜直接计数①需用细菌计数板或血细胞计数板。②统计结果一般是________________的总和。
4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作 (1)实验原理
(3)实验结果分析与评价
5.分解纤维素的微生物的分离 (1)分离方法与原理
(2)纤维素分解菌的培养基成分及鉴定原理
1.利用稀释涂布平板法进行微生物数量测定时，统计的菌落数往往比活菌的实际数目要少，这是因为_____________________________________________ ______________。
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只
2.传统酒曲含有多种有助于酿酒的微生物，某同学想研究一种传统酒曲中所含的微生物，进行了实验。将酒曲制成悬液稀释到一定的倍数，接种到以淀粉为唯一碳源的培养基上，培养一段时间后，观察透明圈的大小，并从最大的透明圈中央挑取菌落并保存。有人说，实验中形成的菌落并不只是能分解淀粉的菌落，你是否同意他的说法？请说明你的理由。
提示 同意。分解淀粉的微生物将淀粉分解后形成的有机物，可供不能分解淀粉的微生物生活。
3.土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论。
提示 将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。
1.(2023·山东淄博月考)某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验，包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察与计数。下列与此实验相关问题的叙述，正确的是( )A.实验用过的带菌培养基经过加热后才能倒掉B.可利用平板划线法对细菌进行分离纯化并计数C.培养基中含有的蛋白胨主要为细菌培养提供氮源和维生素等D.观察细菌培养的实验时，最好是在另一平板上接种清水作为对照实验
结合微生物的选择培养，考查科学思维
解析 带菌的培养基经高压蒸汽灭菌后才能倒掉，以免污染环境，加热不能达到灭菌的目的，A错误；利用稀释涂布平板法对细菌进行分离纯化并计数，平板划线法不能用于细菌的计数，B错误；培养基中含有的蛋白胨主要为细菌培养提供了氮源和维生素等，C正确；要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种无菌水作为对照进行实验，D错误。
2.(2023·福建莆田模拟)某纺织厂为使牛仔布呈现“穿旧”效果，准备用纤维素分解菌处理代替传统的浮石擦洗。工作人员拟从土壤样品中分离该类微生物，并进行扩大培养，相关工艺流程如下图。请回答下列问题：
(1)进行土样中细菌数量的测定，常用稀释涂布平板法(选用104～106倍的稀释液)统计样品中活菌的数量。当第一次用稀释涂布平板法测定土样中纤维素分解菌的数量时，所进行实验的一般基本思路是____________________________________________________________________________________________________________________________________。
(2)在系列稀释操作前，选择培养的一般目的是___________________________________________________________________。
将稀释范围适当放宽的稀释液，采
用稀释涂布平板法分别接种到鉴别培养基(用刚果红染色)，以保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数
以确保能够从样品中分离得到
所需要的微生物，增加纤维素分解菌的数量
(3)涂布接种时，转动培养皿的目的是_________________。
(4)在鉴别培养基上，菌落周围的透明圈大小可能与纤维素酶的_________有关。
解析 (1)第一次用稀释涂布平板法测定土样中纤维素分解菌的数量时，需要将稀释范围适当放宽的稀释液，采用稀释涂布平板法分别接种到鉴别培养基(用刚果红染色)，以保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。(2)选择培养的目的是确保能够从样品中分离得到所需要的纤维素分解菌，增加纤维素分解菌的数量。(3)涂布接种时，转动培养皿的目的是使菌液分布均匀。(4)该实验中的透明圈的大小与纤维素酶的量和活性有关。
跳出题海 两种纯化方法的比较
3.(2022·广东卷，21)研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对中国南海科考中，中国科学家采集了某海域1 146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。
围绕微生物的分离和计数，考查科学思维和探究能力
回答下列问题：(1)研究者先制备富集培养基，然后采用________________法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28 ℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养，除了稀释涂布平板法，还可采用_________法。据图分析，拟杆菌新菌株在以________为碳源时生长状况最好。(2)研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是________________________________________________________________________________________(答一点即可)。
某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质
才能生存(或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活)
(3)藻类细胞解体后的难降解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系统组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是_________________________________________________________________________________________________________________。(4)深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有________。
拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行
解析 (1)培养基通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。可以采用稀释涂布平板法或平板划线法，将单个微生物分散在固体培养基上，经过培养得到单菌落，从而获得纯种培养。分析题图可知，在以纤维素为碳源的培养基中，细胞数量最多，可推知拟杆菌新菌株在以纤维素为碳源时生长状况最好。(2)深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物质才能生存(或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活)，故将采集的样品置于各种培养基中培养，仍可能有很多微生物不能被分离筛选出来。(3)拟杆菌为异养生物，作为该生态系统的分解者，能将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行。(4)深海冷泉温度较低，故生活在其中的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，应具有耐低温的特性，才能高效降解多糖，保证拟杆菌的正常生命活动所需。
1.(2022·湖北卷，5)灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是( )A.动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行B.微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染C.为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌D.可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌
解析 动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行，A错误；动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染，保证无菌环境，而微生物的培养一般不能加入抗生素，B错误；一般用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，以防止杂菌污染，C错误；可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌，以防止杂菌污染，D正确。
2.(2021·山东等级考试，14)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成脂肪酸和甘油并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色。下列说法错误的是( )A.甲菌属于解脂菌B.实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源C.可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比D.该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
解析 根据题意，甲、乙两种菌分别接种在醇溶青琼脂平板上，二者都能生存，甲周围呈现深蓝色，说明培养基的脂肪被分解为脂肪酸，使平板呈现深蓝色，脂肪的分解需要脂肪酶的催化，说明甲能够分泌脂肪酶，属于解脂菌，A正确；乙周围不变色，说明乙不能分泌脂肪酶分解脂肪，没有脂肪酸的产生，不能利用脂肪，但由于乙能在该培养基上生存，说明该培养基中除了脂肪作为碳源外，还存在别的碳源，否则乙不能在该培养基上生存，B错误；为了便于比较结果，可以将两种菌接种到同一平板的不同区域，C正确；菌落周围深蓝色的直径越大，说明解脂菌分泌脂肪酶的能力越强，D正确。
3.(2022·山东卷，14)青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应。目前已实现青霉素的工业化生产，关于该生产过程，下列说法错误的是( )A.发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖B.可用深层通气液体发酵技术提高产量C.选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中D.青霉素具有杀菌作用，因此发酵罐不需严格灭菌
解析 青霉菌处于葡萄糖浓度不足的环境中会通过分泌青霉素杀死细菌；发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖，A正确；青霉菌的代谢类型为异养需氧型，可用深层通气液体发酵技术提高产量，B正确；选育出的高产青霉素菌株经扩大培养纯化后，才可接种到发酵罐中进行工业化生产，C正确；为了防止细菌、其他真菌等微生物的污染，获得纯净的青霉素，发酵罐仍需严格灭菌，D错误。
4.(2022·全国甲卷，37)某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。实验所用的培养基成分如下：
培养基Ⅰ：K2HPO4、MgSO4、NH4NO3、石油。培养基Ⅱ：K2HPO4、MgSO4、石油。操作步骤：
①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。回答下列问题：
(1)实验所用培养基中作为碳源的成分是__________。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成_____________________(答出2种即可)等生物大分子。(2)步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是__________。
DNA、RNA、蛋白质
(4)现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是__________，理由是______________________________________________________________________。
(3)为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示(“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示无透明圈)，推测该同学的实验思路是_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ __________。
在无菌条件下，将等量等浓度的A菌
液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力
A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有
添加氮源的培养基中也能生长
解析 (1)培养基的成分有碳源、氮源、无机盐和水等，从组成培养基的物质所含化学元素可知，作为碳源的成分是石油。生物大分子DNA、RNA、蛋白质都含有N元素，故氮源在菌体内可以参与合成这些物质。(2)由题意“资源和空间不受限制”可知，细菌数量的增长呈“J”形曲线，细菌每繁殖一代就是上一代的2倍，根据公式Nt＝N0·λt，λ＝2，繁殖n代后细菌的数量是N0·2n。(3)分析表格数据可知，实验的结果是：在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能力高于B菌株；在平板Ⅱ上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，根据实验的单一变量和对照原则，推测该同学的思路是：在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到
平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力。(4)由表格数据可知，在平板Ⅱ(无氮源的培养基)上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，所以要治理贫氮且被石油污染的土壤，应该选用A菌株，因为A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长。
考点一 微生物的基本培养技术1.(2023·江苏徐州调研)下列关于微生物培养的叙述，正确的是( )A.微生物在培养液中培养一段时间后用显微镜观察，可见到形成的菌落B.NH3可以作为硝化细菌的氮源和能源物质C.任何培养基都必须含有碳源、氮源、无机盐、水和琼脂D.某些细菌生长过程中需要额外补充营养物质，比如培养酵母菌时，要添加维生素
解析 微生物在固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落，A错误；硝化细菌可利用氧化NH3释放的能量合成有机物，B正确；培养基不一定都含有碳源、氮源，如培养自养微生物的培养基中不需加入碳源，分离自生固氮菌的培养基中，不需加入氮源，C错误；酵母菌不属于细菌，D错误。
2.(2022·海南卷，12)为探究校内植物园土壤中的细菌种类，某兴趣小组采集园内土壤样本并开展相关实验。下列有关叙述错误的是( )A.采样时应随机采集植物园中多个不同地点的土壤样本B.培养细菌时，可选有牛肉膏蛋白胨固体培养基C.土壤溶液稀释倍数越低，越容易得到单菌落D.鉴定细菌种类时，除形态学鉴定外，还可借助生物化学的方法
解析 采集植物园中土壤样本的原则之一是要随机采样，A正确；牛肉膏蛋白胨固体培养基中含有细菌生长所需的碳源、氮源、水、无机盐等，可用于细菌的培养，B正确；土壤溶液稀释倍数足够高时，才能将聚集的细菌分散开，有助于在培养基表面形成单菌落，C错误；不同种类细菌的理化特性一般不同，鉴定细菌种类时，除根据菌落特征进行形态学鉴定外，还可以借助生物化学的方法进行鉴定，D正确。
3.(2023·北京大学附中期末改编)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。下列相关叙述，错误的是( )A.玻璃和金属材质的实验器具可放入干热灭菌箱中干热灭菌B.接种前后的接种环都要在酒精灯的火焰上进行灼烧消毒C.没有将高压蒸汽灭菌锅内的冷空气排尽将影响培养基的灭菌效果D.喷洒石炭酸同时配合紫外线照射可提高对接种室的消毒效果
解析 在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌，一些金属材质的实验器具也可以灼烧灭菌，A正确；为了防止杂菌污染和感染操作者，每次接种前后，接种环都要进行灼烧灭菌，B错误；若未将高压蒸汽灭菌锅内的冷空气排尽，会因达不到规定温度而影响灭菌的效果，C正确；紫外线能破坏DNA结构，密闭空间常采用紫外线照射消毒，喷洒石炭酸同时配合紫外线照射可提高对接种室的消毒效果，D正确。
考点二 微生物的选择培养和计数4.(2023·江苏盐城期中)餐厨垃圾中具有高效降解能力的微生物，可用于餐厨垃圾高效无害化处理。科研人员取一定量的餐厨样品，制备不同浓度的样品稀释液，并将样品接种于利用蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂配制的培养基表面进行培养并分离。下列分析正确的是( )A.牛肉膏主要为微生物提供氮源B.接种时需用力将菌种接种到培养基内C.稀释样品获得单个菌落以便判断菌种类型D.经过培养可筛选出有高效降解能力的微生物
解析 牛肉膏主要为微生物提供碳源、磷酸盐和维生素等，A错误；在培养基接种菌种时，应将菌种接入培养基表面，有利于其生长，如果用力接种会划破培养基，从而会影响菌株的生长，不能形成正常的特征形态，影响对菌落形态的观察及特征鉴别，B错误；该培养基为基本培养基，不能选出有高效降解能力的微生物，经过培养、筛选后还需要进行鉴定，才能选出有高效降解能力的微生物，D错误。
5.(2023·江西九江质检)在筛选纤维素分解菌的培养基中加入刚果红染料，研究者观察到几个有透明圈的菌落。据图分析正确的是( )
A.透明圈内的刚果红染料已被分解B.菌落②中的菌株降解纤维素能力最强C.图中菌落可能是细菌也可能是真菌D.图中培养基可用牛肉膏、蛋白胨配制
解析 透明圈不显红色的原因是其中的纤维素已被分解，A错误；菌落①形成的透明圈直径与菌落直径之比最大，说明菌落①降解纤维素能力最强，B错误；根据题干信息不能判断图中菌落的微生物类型，可能是细菌也可能是真菌，C正确；图中培养基应以纤维素为唯一碳源，不可用牛肉膏、蛋白胨配制，D错误。
6.(2023·中原名校联盟)营养缺陷型菌株是野生型菌株经过人工诱变或自发突变失去合成某种生长因子的能力，只能在补充了相应的生长因子的基本培养基中才能正常生长的变异菌株。某研究小组对酵母菌用紫外线照射后将其接种到甲培养皿的培养基上，一段时间后将甲培养皿的菌落影印接种(不改变菌落位置)到乙、丙两培养皿的培养基中，进一步培养得到如下图所示结果。
下列分析正确的是( )A.接种到甲培养皿采用的是平板划线法B.甲、丙两培养皿中的培养基是基本培养基C.甲培养皿中菌落数目有可能比接种的酵母菌数少D.甲、乙、丙三个培养皿都可能存在营养缺陷型菌落
解析 甲培养皿的菌落均匀分布，接种方法应为稀释涂布平板法，A错误；甲、丙培养基菌落数目多，包括野生型酵母菌菌株和某种营养缺陷型酵母菌菌株，乙培养皿没有生长的菌株是某种营养缺陷型酵母菌菌株，故乙培养皿的培养基是基本培养基，甲和丙生长了同样的菌株，则甲和丙是加入了同种生长因子的培养基，B错误；由于基因突变具有不定向性，接种到甲培养皿的酵母菌可能还有其他营养缺陷型菌株，且有些菌落不一定由一个酵母菌形成，所以，甲培养皿中菌落数有可能比接种的酵母菌数少，C正确；乙培养皿的培养基是基本培养基，形成的菌落只可能是野生型菌落，D错误。
7.(2023·湖南长沙调研)某生物活动小组为探究当地农田土壤中分解尿素的细菌的数量，进行了随机取样、系列梯度稀释、涂布平板、培养、计数等步骤，实验操作过程如下：
请分析并回答下列问题：(1)该实验中含有琼脂的培养基从物理性质来说，属于________培养基，培养基中只选择了________作为唯一氮源。(2)分解尿素的细菌能产生________酶，将尿素分解为___________。(3)在采用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，需要进行梯度稀释的原因是_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ __________________。
只有在稀释度足够高时，聚集在一起的微生物才被分散成单个细胞，并形成单个菌落；但稀释度过高时，得到的平板菌落数太少，实验的偶然性太大。进行梯度稀释时，取菌落数为30～300个的平板进行计数，所得的实验结果最准确(合理即可)
(4)实验结果：6号试管涂布的三个平板的菌落数为550、501、688，7号试管涂布的三个平板的菌落数为58、73、97，8号试管涂布的三个平板的菌落数为8、15、28。该10 g土壤样品中含有分解尿素的细菌的估算数目是__________个。
解析 (1)琼脂可作为凝固剂，故从物理性质来说，含琼脂的培养基属于固体培养基。筛选分解尿素的细菌的选择培养基应以尿素为唯一氮源。(2)分解尿素的细菌产生的脲酶能将尿素分解为NH3和CO2。(3)在采用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，只有在稀释度足够高时，聚集在一起的微生物才被分散成单个细胞，并形成单个菌落；但稀释度过高时，得到的平板菌落数太少，实验的偶然性太大，所以需进行梯度稀释，取菌落数为30～300个的平板进行计数，实验结果最准确。
(4)由于平板计数的适宜值在30～300之间，所以应选择7号试管涂布的平板进行计数，其平均菌落数为(58＋73＋97)/3＝76个，据图可知，10 g土壤样品经梯度稀释至7号试管，稀释度为108倍，而不是107倍，因为在锥形瓶处已经稀释10倍，所以利用公式计算每克土壤样品中的菌落数：(C÷V)×M＝(76÷0.1)×108＝7.6×1010个，但要特别注意，此时求出的是1 g土壤中的微生物数量，所以该10 g土壤样品中含有分解尿素的细菌的数目是7.6×1010×10＝7.6×1011个。
8.(2023·湖北十堰模拟)自生固氮菌是土壤中能独立固定空气中N2的细菌，将玉米种子用自生固氮菌拌种后播种，可显著提高产量并降低化肥的使用量。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究，部分实验流程如下图。回答下列问题：
(1)步骤①土样应取自当地表层土壤的原因是_______________________________________________；步骤②需充分振荡的主要目的是____________________________________。
在富含有机质的土壤表层，有更
使土壤中的微生物充分释放到无菌水中
(2)下表为两种培养基的配方，步骤④应选其中的________培养基，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________。
该培养基不含氮源，具有选择作用，自生固氮菌可以利用空气中的氮气作为氮源，LB培养基中的蛋白胨可以提供氮源，不具有选择作用
(3)步骤④所用的接种工具是________，若在④的平板上统计的菌落的平均数量为126个，则每克土壤中含有的固氮菌为________个。
(4)将纯化的固氮菌置于完全培养液中扩大培养48小时，经离心后收集下层细胞并转移至特定培养基中进行固氮能力的测定，筛选出固氮能力最强的菌种CM12，为进一步鉴定其固氮能力，科研人员选用发芽一致的玉米种子进行3组盆栽实验，30天后测定土壤微生物有机氮含量，结果如图。
注：CK：对照处理组；N：尿素处理组(每盆土壤中50 mL有氮全营养液：成分为在1 000 mL无氮植物营养液中加入0.12 g尿素)；CM12：自生固氮菌CM12处理组(每盆土壤浇50 mL接种自生固氮菌的无氮植物营养液)。
②实验结果表明：施用尿素处理和接种固氮菌CM12处理均能显著增加土壤微生物有机氮含量。与尿素处理组相比，CM12处理组土壤微生物有机氮含量增加了约________%(保留1位小数)。③自生固氮菌较共生固氮菌(如根瘤菌)的应用范围更广，原因是______________________________________________。
自生固氮菌能在土壤中独立固氮，不受宿主的限制
①对照组（CK）的处理为______________________________________________。
每盆土壤浇50 mL无氮植物营养液
9.(2023·湖南邵阳模拟)植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将纤维二糖分解成葡萄糖。回答下列问题：(1)微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、________________四类，为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：
注：“＋”表示有，“－”表示无。
(2)据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是_______________________________________________________________________________________________。(3)据表判断，培养基乙________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是_________________________。(4)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成________色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。
纤维素分解菌选择培养基属于液体培养基，纤维素分解菌鉴别培
养基属于固体培养基(培养基中没有琼脂)
(5)纯化菌株时，通常使用的划线工具是________。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有___________________________________________________。
①接种环灼烧后未冷却；②划线未从第一区域末端开始
解析 (1)实验室培养微生物需要配制培养基，培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。(2)分析表格可知，培养基甲的配方中无琼脂，为液体培养基，不能用于分离和鉴别纤维素分解菌，纤维素分解菌鉴别培养基属于固体培养基。
(3)培养基乙没有纤维素粉，因此也不能用于分离和鉴别纤维素分解菌。(4)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成红色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的透明圈。(5)接种时常用接种环，平板划线法操作时要求将灼烧后的接种环冷却后再划线，否则会灼伤菌株甚至导致菌株死亡，划线时要从上一次划线的末端开始，这样接种环上才有菌株，因此若第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌，而第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落，可能的原因有接种环灼烧后未冷却或划线未从第一区域末端开始。
10.(2022·广东中山调研)鲸死亡后会沉入海底，俗称“鲸落”。“鲸落”后期会形成一个以厌氧菌和硫细菌等为主体的生态系统。厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，同时产生一些硫化氢等硫化物，硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物。请回答相关问题：(1)培养微生物的培养基中一般都会含有水、无机盐、氮源和碳源，培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是____________________。要培养硫细菌，培养基中的成分需要特殊配制，主要体现在______________________________ ________________，这种培养基可以用来专一性培养硫细菌，所以称为_____培养基。
碳源必须是含碳无机物(或碳酸盐)，
(2)在分离“鲸落”中的微生物时要制备固体培养基，在倒平板操作后，将平板倒置，这样做的目的是___________________________________________________________________________。(3)为了研究“鲸落”中含有微生物的情况，需将“鲸落”提取物加水稀释，然后将稀释水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，这种方法称为________________。
下面所示的四种菌落分布情况中，不可能由该方法得到的是________。
防止培养皿盖上凝结的水珠落入培养皿造成污染；防
止培养基中水分过快挥发
(4)若想得到“鲸落”中某目标菌种，可用平板划线法进行纯化。若下图甲是接种培养后的菌落分布图，对应的平板划线操作示意图为________。图甲中的③更易获得单菌落，判断依据是_____________________________________________________________________________。
每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，最
后一次划线结束时更容易获得单菌落
解析 (1)厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，属于异养微生物，故培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是含碳有机物(或脂肪)。硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物.即硫细菌为自养生物，所以要培养硫细菌，培养基中的成分需要特殊配制，主要体现在碳源必须是含碳无机物(或碳酸盐)，同时加入硫化物。这种人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基称为选择培养基。
(3)使用涂布器涂布接种微生物的方法为稀释涂布平板法。稀释涂布平板法接种的微生物会在培养基上形成均匀分布的菌落，而平板划线法接种的微生物在划线的起始部分菌落连在一起生长，由图可知，A、B、C均形成了均匀分布的单个菌落，属于稀释涂布平板法接种的，而D中菌落是连在一起生长的，是通过平板划线法接种的。
11.(2022·重庆一中调研)大肠杆菌是寄生于人和动物肠道中的细菌，其代谢产物能与染料伊红美蓝反应，使菌落呈黑色。下面是其培养基配方：
回答下列问题：(1)该培养基中，蛋白胨为大肠杆菌提供的主要营养有________和维生素等。(2)在接种大肠杆菌前，需先将灭菌后的空白培养基放在恒温箱中培养一段时间，观察是否有菌落生成，其目的是________________________________________。
(3)为了检测严重污染的水体中大肠杆菌的数量，将水样适当稀释后，取样涂布在上述平板培养基中，应选择颜色为_________的菌落进行计数。该方法是通过统计平板上的菌落数来推测样品中的活菌数，其原理是_________________________________________________________________________________。
检测培养基制备是否合格(或灭菌是否彻底)
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌
(4)将1 mL水样稀释1 000倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为_____________。(5)除利用特定培养基选择鉴定某种细菌外，还可以依据______________________________对细菌进行初步的鉴定和分类。
解析 (1)蛋白胨主要为大肠杆菌提供氮源和维生素等。(2)为了检测培养基制备是否合格(或灭菌是否彻底)，在接种大肠杆菌前，需先将灭菌后的空白培养基放在恒温箱中培养一段时间，观察是否有菌落生成。(3)大肠杆菌的代谢产物能与培养基中的染料伊红美蓝反应，使菌落呈黑色，因此，为了检测严重污染水体中大肠杆菌的数量，将水样适当稀释后，取样涂布在上述平板培养基中，应选择颜色为黑色的菌落进行计数。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，因此可通过统计平板上的菌落数来推测样品中的活菌数。(4)将1 mL水样稀释1 000倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37，据此可得出每升水样中的活菌数为[(39＋38＋37)÷3]÷0.1×1 000×1 000＝3.8×108。(5)一般来说，在一定的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，因此可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的鉴定和分类。
课标内容 (1)阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。(2)阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。(3)举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。(4)概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。(5)概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
微生物的选择培养和计数
考点一 微生物的基本培养技术
几种微生物的营养和能量来源
2.无菌技术(1)目的：获得______________。(2)关键：______________。
(3)常见物品的消毒或灭菌方法①消毒方法及适用对象
3.微生物的纯培养 酵母菌纯培养的操作步骤：
下图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析并回答下列问题：
(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是什么？______________________________________________________________________。(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？_________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(3)接种操作为什么一定要在火焰附近进行？________________________。
获得图A效果的接种方法为稀释涂布平板法，获得图B效果的接种方法为平板划线法
最可能的原因是菌液浓度过高或
划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌
火焰附近存在着无菌区域
(1)培养基要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。(2)要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。(3)倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。(4)平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
2.平板划线法操作步骤
(2)平板划线法操作中几次灼烧接种环的目的
1.(2023·湖北襄阳四校联考)微生物培养过程中，要重视无菌操作，现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染，请分析下列操作，正确的是( )A.煮沸消毒法中100 ℃煮沸5～6 min可以杀死全部微生物的细胞和芽孢、孢子B.将接种环直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌C.加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌D.家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌
结合培养基的配制和无菌技术，考查科学思维
解析 煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢，而灭菌能杀灭环境中一切微生物，包括孢子和芽孢，A错误；指示剂和染料可能混有微生物，因此加入培养基中的指示剂和染料也需要灭菌，C错误；家庭制作葡萄酒时，要将容器进行灭菌或消毒，但是葡萄不能灭菌，因为发酵用的酵母菌来自葡萄，D错误。
2.(2023·河南名校联盟)“掌心对掌心，手心压手背，十指交叉摩，手握关节搓，拇指围轴转，指尖掌心揉，手腕别放过。”七步洗手法可以清除手部的污物和微生物，是预防新冠病毒感染的有效措施之一。某生物实验小组设计了“比较洗手前后手上细菌分布情况”的探究活动：各小组成员分别将拇指在甲组培养基上轻轻按一下，然后用肥皂将该手洗干净，再将洗净后的拇指在乙组培养基上轻轻按一下。将这两组培养基放入恒温培养箱中，在适宜温度下培养24小时后，统计两组培养基中菌落数目，请回答下列问题：
(1)该实验中用到的培养基中加入了牛肉膏、蛋白胨、NaCl和水，蛋白胨可以为微生物的生长提供_______________等营养物质，为了使配制的溶液呈固体状态，还需要加入________。为了防止外来杂菌的入侵，可以将培养基放入盛有适量________的高压蒸汽灭菌锅内灭菌15～30 min。(2)实验中“将拇指在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养操作中的________，该操作应该在酒精灯火焰附近进行，原因是____________________________________。
避免周围环境中的微生物污染培养基
(3)统计甲、乙两组培养皿中的菌落，乙组中菌落数比甲少得多，实验结果说明肥皂洗手不能彻底清除手上的微生物。为避免手上微生物在无菌操作中污染培养基，洗过的手还应进行_______________________________等方法处理(答出1种即可)。(4)有同学认为乙中也有菌落产生，是因为培养过程受到杂菌污染，请你在本实验的基础上设计一个简单的方案验证他的猜想是否正确，并预期结果和结论。_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
酒精棉球擦拭双手、戴消毒手套
再加一个不接种的相同培养基(空白培养基)，与甲、乙在相同条件下培养，若该培养基上没有生长菌落，说明培养过程未被杂菌污染，猜想错误；若该培养基上生长菌落，说明培养过程中被杂菌污染，猜想正确。
3.(2023·江苏南京调研)下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法正确的是( )
结合微生物的纯培养，考查科学探究能力
A.步骤①后需将培养基灭菌并调节pHB.步骤①②③操作时需要在酒精灯火焰附近进行C.步骤③到④的过程中，接种环共灼烧处理了5次D.图中步骤①结束后需倒置平板，④结束后不需要
解析 步骤①表示倒平板，培养基需要先调节pH后灭菌，冷却后倒平板，A错误；接种环在每次接种前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，所以步骤③到步骤④的过程中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，步骤③到步骤④的过程中，共需灼烧接种环6次，C错误；步骤④操作结束后需在培养皿的底上做好标记并倒置后放入培养箱中进行培养，D错误。
4.(2023·河北衡水金卷)丁草胺是一种有机除草剂，主要用于水稻田杂草的防除，具有潜在的致畸变和致突变性。而在水稻种植过程中农田有一段很长的淹水期，淹水会导致水稻田深层土壤处于厌氧状态。因此研究丁草胺厌氧降解菌对于水稻田土壤中丁草胺的降解具有重要意义。研究人员要对丁草胺厌氧降解菌进行分离、鉴定和扩大培养(如图)，请回答下列问题：
(1)你认为研究小组应该在哪里取样？________________________________(2)配制选择培养基时，研究人员先加入了K2HPO4、KH2PO4、FeSO4、MgCl2、NH4Cl、CaCl2、NaCl、微量元素复合液、维生素复合液等，他们还需要加入一定量的________。对培养基灭菌通常采用______________法。灭菌结束后，应趁热将适量培养基分装于锥形瓶中，充入氮气，塞住胶塞并用铝帽固定，这样操作的目的是____________________。
频繁使用丁草胺的水稻田深层土壤
(3)步骤③中，应将平板放入厌氧罐中，置于培养箱中恒温培养，对长出的菌落进行初步鉴定。菌落是初步区分微生物类型的重要特征，这些特征包括_____________________________________________ (至少答出2点)等。(4)步骤④中，从第二次划线操作起，每次总是要从上一次划线的末端开始划线，其原因是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
菌落的形状、大小、颜色、隆起程度、边缘特征
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，从上一次划线的
末端开始，能使细菌的数目随划线次数的增加逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落
解析 (1)施用过丁草胺的稻田中能够分解丁草胺的菌株数量多，易获得目的菌株，同时由于目的菌株是厌氧型微生物，故获取分离目的菌的土壤样品应从频繁使用丁草胺的水稻田深层土壤获取。(2)配制培养基时除微生物生长所必需的营养物质外，还需加入一定量的丁草胺。培养基灭菌一般采用高压蒸汽灭菌法。灭菌后的培养基趁热充入氮气的目的是去除培养基中的氧气，创造无氧环境。(3)菌落的特征包括菌落的形状、大小、隆起程度、颜色、边缘特征、光泽等。(4)划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随划线次数的增加逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
考点二 微生物的选择培 养和计数
常见选择培养基举例①缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。②含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。③无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。
2.稀释涂布平板法(1)系列稀释操作取1 mL菌液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
(1)利用稀释涂布平板法计数①为了保证结果准确，一般选择菌落数为_________的平板计数，并且在同一稀释度下，应至少对____个平板进行重复计数，并求平均值。②统计结果往往比实际值____。(2)利用显微镜直接计数①需用细菌计数板或血细胞计数板。②统计结果一般是________________的总和。
4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作 (1)实验原理
(3)实验结果分析与评价
5.分解纤维素的微生物的分离 (1)分离方法与原理
(2)纤维素分解菌的培养基成分及鉴定原理
1.利用稀释涂布平板法进行微生物数量测定时，统计的菌落数往往比活菌的实际数目要少，这是因为_____________________________________________ ______________。
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只
2.传统酒曲含有多种有助于酿酒的微生物，某同学想研究一种传统酒曲中所含的微生物，进行了实验。将酒曲制成悬液稀释到一定的倍数，接种到以淀粉为唯一碳源的培养基上，培养一段时间后，观察透明圈的大小，并从最大的透明圈中央挑取菌落并保存。有人说，实验中形成的菌落并不只是能分解淀粉的菌落，你是否同意他的说法？请说明你的理由。
提示 同意。分解淀粉的微生物将淀粉分解后形成的有机物，可供不能分解淀粉的微生物生活。
3.土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论。
提示 将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。
1.(2023·山东淄博月考)某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验，包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察与计数。下列与此实验相关问题的叙述，正确的是( )A.实验用过的带菌培养基经过加热后才能倒掉B.可利用平板划线法对细菌进行分离纯化并计数C.培养基中含有的蛋白胨主要为细菌培养提供氮源和维生素等D.观察细菌培养的实验时，最好是在另一平板上接种清水作为对照实验
结合微生物的选择培养，考查科学思维
解析 带菌的培养基经高压蒸汽灭菌后才能倒掉，以免污染环境，加热不能达到灭菌的目的，A错误；利用稀释涂布平板法对细菌进行分离纯化并计数，平板划线法不能用于细菌的计数，B错误；培养基中含有的蛋白胨主要为细菌培养提供了氮源和维生素等，C正确；要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种无菌水作为对照进行实验，D错误。
2.(2023·福建莆田模拟)某纺织厂为使牛仔布呈现“穿旧”效果，准备用纤维素分解菌处理代替传统的浮石擦洗。工作人员拟从土壤样品中分离该类微生物，并进行扩大培养，相关工艺流程如下图。请回答下列问题：
(1)进行土样中细菌数量的测定，常用稀释涂布平板法(选用104～106倍的稀释液)统计样品中活菌的数量。当第一次用稀释涂布平板法测定土样中纤维素分解菌的数量时，所进行实验的一般基本思路是____________________________________________________________________________________________________________________________________。
(2)在系列稀释操作前，选择培养的一般目的是___________________________________________________________________。
将稀释范围适当放宽的稀释液，采
用稀释涂布平板法分别接种到鉴别培养基(用刚果红染色)，以保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数
以确保能够从样品中分离得到
所需要的微生物，增加纤维素分解菌的数量
(3)涂布接种时，转动培养皿的目的是_________________。
(4)在鉴别培养基上，菌落周围的透明圈大小可能与纤维素酶的_________有关。
解析 (1)第一次用稀释涂布平板法测定土样中纤维素分解菌的数量时，需要将稀释范围适当放宽的稀释液，采用稀释涂布平板法分别接种到鉴别培养基(用刚果红染色)，以保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。(2)选择培养的目的是确保能够从样品中分离得到所需要的纤维素分解菌，增加纤维素分解菌的数量。(3)涂布接种时，转动培养皿的目的是使菌液分布均匀。(4)该实验中的透明圈的大小与纤维素酶的量和活性有关。
跳出题海 两种纯化方法的比较
3.(2022·广东卷，21)研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对中国南海科考中，中国科学家采集了某海域1 146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。
围绕微生物的分离和计数，考查科学思维和探究能力
回答下列问题：(1)研究者先制备富集培养基，然后采用________________法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28 ℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养，除了稀释涂布平板法，还可采用_________法。据图分析，拟杆菌新菌株在以________为碳源时生长状况最好。(2)研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是________________________________________________________________________________________(答一点即可)。
某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质
才能生存(或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活)
(3)藻类细胞解体后的难降解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系统组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是_________________________________________________________________________________________________________________。(4)深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有________。
拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行
解析 (1)培养基通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。可以采用稀释涂布平板法或平板划线法，将单个微生物分散在固体培养基上，经过培养得到单菌落，从而获得纯种培养。分析题图可知，在以纤维素为碳源的培养基中，细胞数量最多，可推知拟杆菌新菌株在以纤维素为碳源时生长状况最好。(2)深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物质才能生存(或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活)，故将采集的样品置于各种培养基中培养，仍可能有很多微生物不能被分离筛选出来。(3)拟杆菌为异养生物，作为该生态系统的分解者，能将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行。(4)深海冷泉温度较低，故生活在其中的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，应具有耐低温的特性，才能高效降解多糖，保证拟杆菌的正常生命活动所需。
1.(2022·湖北卷，5)灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是( )A.动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行B.微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染C.为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌D.可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌
解析 动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行，A错误；动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染，保证无菌环境，而微生物的培养一般不能加入抗生素，B错误；一般用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，以防止杂菌污染，C错误；可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌，以防止杂菌污染，D正确。
2.(2021·山东等级考试，14)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成脂肪酸和甘油并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色。下列说法错误的是( )A.甲菌属于解脂菌B.实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源C.可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比D.该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
解析 根据题意，甲、乙两种菌分别接种在醇溶青琼脂平板上，二者都能生存，甲周围呈现深蓝色，说明培养基的脂肪被分解为脂肪酸，使平板呈现深蓝色，脂肪的分解需要脂肪酶的催化，说明甲能够分泌脂肪酶，属于解脂菌，A正确；乙周围不变色，说明乙不能分泌脂肪酶分解脂肪，没有脂肪酸的产生，不能利用脂肪，但由于乙能在该培养基上生存，说明该培养基中除了脂肪作为碳源外，还存在别的碳源，否则乙不能在该培养基上生存，B错误；为了便于比较结果，可以将两种菌接种到同一平板的不同区域，C正确；菌落周围深蓝色的直径越大，说明解脂菌分泌脂肪酶的能力越强，D正确。
3.(2022·山东卷，14)青霉菌处在葡萄糖浓度不足的环境中时，会通过分泌青霉素杀死细菌，以保证自身生存所需的能量供应。目前已实现青霉素的工业化生产，关于该生产过程，下列说法错误的是( )A.发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖B.可用深层通气液体发酵技术提高产量C.选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中D.青霉素具有杀菌作用，因此发酵罐不需严格灭菌
解析 青霉菌处于葡萄糖浓度不足的环境中会通过分泌青霉素杀死细菌；发酵液中的碳源不宜使用葡萄糖，A正确；青霉菌的代谢类型为异养需氧型，可用深层通气液体发酵技术提高产量，B正确；选育出的高产青霉素菌株经扩大培养纯化后，才可接种到发酵罐中进行工业化生产，C正确；为了防止细菌、其他真菌等微生物的污染，获得纯净的青霉素，发酵罐仍需严格灭菌，D错误。
4.(2022·全国甲卷，37)某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。实验所用的培养基成分如下：
培养基Ⅰ：K2HPO4、MgSO4、NH4NO3、石油。培养基Ⅱ：K2HPO4、MgSO4、石油。操作步骤：
①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。回答下列问题：
(1)实验所用培养基中作为碳源的成分是__________。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成_____________________(答出2种即可)等生物大分子。(2)步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是__________。
DNA、RNA、蛋白质
(4)现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是__________，理由是______________________________________________________________________。
(3)为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示(“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示无透明圈)，推测该同学的实验思路是_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ __________。
在无菌条件下，将等量等浓度的A菌
液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力
A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有
添加氮源的培养基中也能生长
解析 (1)培养基的成分有碳源、氮源、无机盐和水等，从组成培养基的物质所含化学元素可知，作为碳源的成分是石油。生物大分子DNA、RNA、蛋白质都含有N元素，故氮源在菌体内可以参与合成这些物质。(2)由题意“资源和空间不受限制”可知，细菌数量的增长呈“J”形曲线，细菌每繁殖一代就是上一代的2倍，根据公式Nt＝N0·λt，λ＝2，繁殖n代后细菌的数量是N0·2n。(3)分析表格数据可知，实验的结果是：在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能力高于B菌株；在平板Ⅱ上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，根据实验的单一变量和对照原则，推测该同学的思路是：在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到
平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力。(4)由表格数据可知，在平板Ⅱ(无氮源的培养基)上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，所以要治理贫氮且被石油污染的土壤，应该选用A菌株，因为A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长。
考点一 微生物的基本培养技术1.(2023·江苏徐州调研)下列关于微生物培养的叙述，正确的是( )A.微生物在培养液中培养一段时间后用显微镜观察，可见到形成的菌落B.NH3可以作为硝化细菌的氮源和能源物质C.任何培养基都必须含有碳源、氮源、无机盐、水和琼脂D.某些细菌生长过程中需要额外补充营养物质，比如培养酵母菌时，要添加维生素
解析 微生物在固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落，A错误；硝化细菌可利用氧化NH3释放的能量合成有机物，B正确；培养基不一定都含有碳源、氮源，如培养自养微生物的培养基中不需加入碳源，分离自生固氮菌的培养基中，不需加入氮源，C错误；酵母菌不属于细菌，D错误。
2.(2022·海南卷，12)为探究校内植物园土壤中的细菌种类，某兴趣小组采集园内土壤样本并开展相关实验。下列有关叙述错误的是( )A.采样时应随机采集植物园中多个不同地点的土壤样本B.培养细菌时，可选有牛肉膏蛋白胨固体培养基C.土壤溶液稀释倍数越低，越容易得到单菌落D.鉴定细菌种类时，除形态学鉴定外，还可借助生物化学的方法
解析 采集植物园中土壤样本的原则之一是要随机采样，A正确；牛肉膏蛋白胨固体培养基中含有细菌生长所需的碳源、氮源、水、无机盐等，可用于细菌的培养，B正确；土壤溶液稀释倍数足够高时，才能将聚集的细菌分散开，有助于在培养基表面形成单菌落，C错误；不同种类细菌的理化特性一般不同，鉴定细菌种类时，除根据菌落特征进行形态学鉴定外，还可以借助生物化学的方法进行鉴定，D正确。
3.(2023·北京大学附中期末改编)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。下列相关叙述，错误的是( )A.玻璃和金属材质的实验器具可放入干热灭菌箱中干热灭菌B.接种前后的接种环都要在酒精灯的火焰上进行灼烧消毒C.没有将高压蒸汽灭菌锅内的冷空气排尽将影响培养基的灭菌效果D.喷洒石炭酸同时配合紫外线照射可提高对接种室的消毒效果
解析 在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌，一些金属材质的实验器具也可以灼烧灭菌，A正确；为了防止杂菌污染和感染操作者，每次接种前后，接种环都要进行灼烧灭菌，B错误；若未将高压蒸汽灭菌锅内的冷空气排尽，会因达不到规定温度而影响灭菌的效果，C正确；紫外线能破坏DNA结构，密闭空间常采用紫外线照射消毒，喷洒石炭酸同时配合紫外线照射可提高对接种室的消毒效果，D正确。
考点二 微生物的选择培养和计数4.(2023·江苏盐城期中)餐厨垃圾中具有高效降解能力的微生物，可用于餐厨垃圾高效无害化处理。科研人员取一定量的餐厨样品，制备不同浓度的样品稀释液，并将样品接种于利用蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂配制的培养基表面进行培养并分离。下列分析正确的是( )A.牛肉膏主要为微生物提供氮源B.接种时需用力将菌种接种到培养基内C.稀释样品获得单个菌落以便判断菌种类型D.经过培养可筛选出有高效降解能力的微生物
解析 牛肉膏主要为微生物提供碳源、磷酸盐和维生素等，A错误；在培养基接种菌种时，应将菌种接入培养基表面，有利于其生长，如果用力接种会划破培养基，从而会影响菌株的生长，不能形成正常的特征形态，影响对菌落形态的观察及特征鉴别，B错误；该培养基为基本培养基，不能选出有高效降解能力的微生物，经过培养、筛选后还需要进行鉴定，才能选出有高效降解能力的微生物，D错误。
5.(2023·江西九江质检)在筛选纤维素分解菌的培养基中加入刚果红染料，研究者观察到几个有透明圈的菌落。据图分析正确的是( )
A.透明圈内的刚果红染料已被分解B.菌落②中的菌株降解纤维素能力最强C.图中菌落可能是细菌也可能是真菌D.图中培养基可用牛肉膏、蛋白胨配制
解析 透明圈不显红色的原因是其中的纤维素已被分解，A错误；菌落①形成的透明圈直径与菌落直径之比最大，说明菌落①降解纤维素能力最强，B错误；根据题干信息不能判断图中菌落的微生物类型，可能是细菌也可能是真菌，C正确；图中培养基应以纤维素为唯一碳源，不可用牛肉膏、蛋白胨配制，D错误。
6.(2023·中原名校联盟)营养缺陷型菌株是野生型菌株经过人工诱变或自发突变失去合成某种生长因子的能力，只能在补充了相应的生长因子的基本培养基中才能正常生长的变异菌株。某研究小组对酵母菌用紫外线照射后将其接种到甲培养皿的培养基上，一段时间后将甲培养皿的菌落影印接种(不改变菌落位置)到乙、丙两培养皿的培养基中，进一步培养得到如下图所示结果。
下列分析正确的是( )A.接种到甲培养皿采用的是平板划线法B.甲、丙两培养皿中的培养基是基本培养基C.甲培养皿中菌落数目有可能比接种的酵母菌数少D.甲、乙、丙三个培养皿都可能存在营养缺陷型菌落
解析 甲培养皿的菌落均匀分布，接种方法应为稀释涂布平板法，A错误；甲、丙培养基菌落数目多，包括野生型酵母菌菌株和某种营养缺陷型酵母菌菌株，乙培养皿没有生长的菌株是某种营养缺陷型酵母菌菌株，故乙培养皿的培养基是基本培养基，甲和丙生长了同样的菌株，则甲和丙是加入了同种生长因子的培养基，B错误；由于基因突变具有不定向性，接种到甲培养皿的酵母菌可能还有其他营养缺陷型菌株，且有些菌落不一定由一个酵母菌形成，所以，甲培养皿中菌落数有可能比接种的酵母菌数少，C正确；乙培养皿的培养基是基本培养基，形成的菌落只可能是野生型菌落，D错误。
7.(2023·湖南长沙调研)某生物活动小组为探究当地农田土壤中分解尿素的细菌的数量，进行了随机取样、系列梯度稀释、涂布平板、培养、计数等步骤，实验操作过程如下：
请分析并回答下列问题：(1)该实验中含有琼脂的培养基从物理性质来说，属于________培养基，培养基中只选择了________作为唯一氮源。(2)分解尿素的细菌能产生________酶，将尿素分解为___________。(3)在采用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，需要进行梯度稀释的原因是_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ __________________。
只有在稀释度足够高时，聚集在一起的微生物才被分散成单个细胞，并形成单个菌落；但稀释度过高时，得到的平板菌落数太少，实验的偶然性太大。进行梯度稀释时，取菌落数为30～300个的平板进行计数，所得的实验结果最准确(合理即可)
(4)实验结果：6号试管涂布的三个平板的菌落数为550、501、688，7号试管涂布的三个平板的菌落数为58、73、97，8号试管涂布的三个平板的菌落数为8、15、28。该10 g土壤样品中含有分解尿素的细菌的估算数目是__________个。
解析 (1)琼脂可作为凝固剂，故从物理性质来说，含琼脂的培养基属于固体培养基。筛选分解尿素的细菌的选择培养基应以尿素为唯一氮源。(2)分解尿素的细菌产生的脲酶能将尿素分解为NH3和CO2。(3)在采用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，只有在稀释度足够高时，聚集在一起的微生物才被分散成单个细胞，并形成单个菌落；但稀释度过高时，得到的平板菌落数太少，实验的偶然性太大，所以需进行梯度稀释，取菌落数为30～300个的平板进行计数，实验结果最准确。
(4)由于平板计数的适宜值在30～300之间，所以应选择7号试管涂布的平板进行计数，其平均菌落数为(58＋73＋97)/3＝76个，据图可知，10 g土壤样品经梯度稀释至7号试管，稀释度为108倍，而不是107倍，因为在锥形瓶处已经稀释10倍，所以利用公式计算每克土壤样品中的菌落数：(C÷V)×M＝(76÷0.1)×108＝7.6×1010个，但要特别注意，此时求出的是1 g土壤中的微生物数量，所以该10 g土壤样品中含有分解尿素的细菌的数目是7.6×1010×10＝7.6×1011个。
8.(2023·湖北十堰模拟)自生固氮菌是土壤中能独立固定空气中N2的细菌，将玉米种子用自生固氮菌拌种后播种，可显著提高产量并降低化肥的使用量。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究，部分实验流程如下图。回答下列问题：
(1)步骤①土样应取自当地表层土壤的原因是_______________________________________________；步骤②需充分振荡的主要目的是____________________________________。
在富含有机质的土壤表层，有更
使土壤中的微生物充分释放到无菌水中
(2)下表为两种培养基的配方，步骤④应选其中的________培养基，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________。
该培养基不含氮源，具有选择作用，自生固氮菌可以利用空气中的氮气作为氮源，LB培养基中的蛋白胨可以提供氮源，不具有选择作用
(3)步骤④所用的接种工具是________，若在④的平板上统计的菌落的平均数量为126个，则每克土壤中含有的固氮菌为________个。
(4)将纯化的固氮菌置于完全培养液中扩大培养48小时，经离心后收集下层细胞并转移至特定培养基中进行固氮能力的测定，筛选出固氮能力最强的菌种CM12，为进一步鉴定其固氮能力，科研人员选用发芽一致的玉米种子进行3组盆栽实验，30天后测定土壤微生物有机氮含量，结果如图。
注：CK：对照处理组；N：尿素处理组(每盆土壤中50 mL有氮全营养液：成分为在1 000 mL无氮植物营养液中加入0.12 g尿素)；CM12：自生固氮菌CM12处理组(每盆土壤浇50 mL接种自生固氮菌的无氮植物营养液)。
②实验结果表明：施用尿素处理和接种固氮菌CM12处理均能显著增加土壤微生物有机氮含量。与尿素处理组相比，CM12处理组土壤微生物有机氮含量增加了约________%(保留1位小数)。③自生固氮菌较共生固氮菌(如根瘤菌)的应用范围更广，原因是______________________________________________。
自生固氮菌能在土壤中独立固氮，不受宿主的限制
①对照组（CK）的处理为______________________________________________。
每盆土壤浇50 mL无氮植物营养液
9.(2023·湖南邵阳模拟)植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将纤维二糖分解成葡萄糖。回答下列问题：(1)微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、________________四类，为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：
注：“＋”表示有，“－”表示无。
(2)据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是_______________________________________________________________________________________________。(3)据表判断，培养基乙________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是_________________________。(4)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成________色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。
纤维素分解菌选择培养基属于液体培养基，纤维素分解菌鉴别培
养基属于固体培养基(培养基中没有琼脂)
(5)纯化菌株时，通常使用的划线工具是________。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有___________________________________________________。
①接种环灼烧后未冷却；②划线未从第一区域末端开始
解析 (1)实验室培养微生物需要配制培养基，培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。(2)分析表格可知，培养基甲的配方中无琼脂，为液体培养基，不能用于分离和鉴别纤维素分解菌，纤维素分解菌鉴别培养基属于固体培养基。
(3)培养基乙没有纤维素粉，因此也不能用于分离和鉴别纤维素分解菌。(4)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成红色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的透明圈。(5)接种时常用接种环，平板划线法操作时要求将灼烧后的接种环冷却后再划线，否则会灼伤菌株甚至导致菌株死亡，划线时要从上一次划线的末端开始，这样接种环上才有菌株，因此若第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌，而第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落，可能的原因有接种环灼烧后未冷却或划线未从第一区域末端开始。
10.(2022·广东中山调研)鲸死亡后会沉入海底，俗称“鲸落”。“鲸落”后期会形成一个以厌氧菌和硫细菌等为主体的生态系统。厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，同时产生一些硫化氢等硫化物，硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物。请回答相关问题：(1)培养微生物的培养基中一般都会含有水、无机盐、氮源和碳源，培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是____________________。要培养硫细菌，培养基中的成分需要特殊配制，主要体现在______________________________ ________________，这种培养基可以用来专一性培养硫细菌，所以称为_____培养基。
碳源必须是含碳无机物(或碳酸盐)，
(2)在分离“鲸落”中的微生物时要制备固体培养基，在倒平板操作后，将平板倒置，这样做的目的是___________________________________________________________________________。(3)为了研究“鲸落”中含有微生物的情况，需将“鲸落”提取物加水稀释，然后将稀释水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，这种方法称为________________。
下面所示的四种菌落分布情况中，不可能由该方法得到的是________。
防止培养皿盖上凝结的水珠落入培养皿造成污染；防
止培养基中水分过快挥发
(4)若想得到“鲸落”中某目标菌种，可用平板划线法进行纯化。若下图甲是接种培养后的菌落分布图，对应的平板划线操作示意图为________。图甲中的③更易获得单菌落，判断依据是_____________________________________________________________________________。
每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，最
后一次划线结束时更容易获得单菌落
解析 (1)厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，属于异养微生物，故培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是含碳有机物(或脂肪)。硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物.即硫细菌为自养生物，所以要培养硫细菌，培养基中的成分需要特殊配制，主要体现在碳源必须是含碳无机物(或碳酸盐)，同时加入硫化物。这种人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基称为选择培养基。
(3)使用涂布器涂布接种微生物的方法为稀释涂布平板法。稀释涂布平板法接种的微生物会在培养基上形成均匀分布的菌落，而平板划线法接种的微生物在划线的起始部分菌落连在一起生长，由图可知，A、B、C均形成了均匀分布的单个菌落，属于稀释涂布平板法接种的，而D中菌落是连在一起生长的，是通过平板划线法接种的。
11.(2022·重庆一中调研)大肠杆菌是寄生于人和动物肠道中的细菌，其代谢产物能与染料伊红美蓝反应，使菌落呈黑色。下面是其培养基配方：
回答下列问题：(1)该培养基中，蛋白胨为大肠杆菌提供的主要营养有________和维生素等。(2)在接种大肠杆菌前，需先将灭菌后的空白培养基放在恒温箱中培养一段时间，观察是否有菌落生成，其目的是________________________________________。
(3)为了检测严重污染的水体中大肠杆菌的数量，将水样适当稀释后，取样涂布在上述平板培养基中，应选择颜色为_________的菌落进行计数。该方法是通过统计平板上的菌落数来推测样品中的活菌数，其原理是_________________________________________________________________________________。
检测培养基制备是否合格(或灭菌是否彻底)
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌
(4)将1 mL水样稀释1 000倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为_____________。(5)除利用特定培养基选择鉴定某种细菌外，还可以依据______________________________对细菌进行初步的鉴定和分类。
解析 (1)蛋白胨主要为大肠杆菌提供氮源和维生素等。(2)为了检测培养基制备是否合格(或灭菌是否彻底)，在接种大肠杆菌前，需先将灭菌后的空白培养基放在恒温箱中培养一段时间，观察是否有菌落生成。(3)大肠杆菌的代谢产物能与培养基中的染料伊红美蓝反应，使菌落呈黑色，因此，为了检测严重污染水体中大肠杆菌的数量，将水样适当稀释后，取样涂布在上述平板培养基中，应选择颜色为黑色的菌落进行计数。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，因此可通过统计平板上的菌落数来推测样品中的活菌数。(4)将1 mL水样稀释1 000倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37，据此可得出每升水样中的活菌数为[(39＋38＋37)÷3]÷0.1×1 000×1 000＝3.8×108。(5)一般来说，在一定的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，因此可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的鉴定和分类。
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