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2024年高考生物大一轮选择性必修3复习讲义：第49讲 基因工程的基本工具和基本操作程序
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这是一份2024年高考生物大一轮选择性必修3复习讲义：第49讲 基因工程的基本工具和基本操作程序，共31页。试卷主要包含了基因工程概述，重组DNA技术的基本工具，目的基因的检测与鉴定等内容，欢迎下载使用。
考点一 重组DNA技术的基本工具
1.基因工程概述
基因工程的理论基础
2.重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
①将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)DNA连接酶
①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
(3)载体
【情境推理·探究】
1.实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件是__________________________________________________
____________________________________________________(答出两点即可)。
提示 对靶细胞具有较高的转化效率，不能增殖，对细胞无害。
2.限制性内切核酸酶EcRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcRⅠ切割后所形成的黏性末端。
提示
3.软米基因会导致水稻稻米合成直链淀粉含量降低呈现软米特征，人们大多喜欢软米的口感，为获得高产软米粳型水稻，软米基因Weq \\al(mq,x)与蜡质基因Wx互为等位基因，序列长度相同均为557碱基对(bp)，但基因内部出现了限制酶NlaⅢ识别位点，用限制酶NlaⅢ处理不同植株的DNA片段，获得电泳图如下，分析可知含有纯合软米基因的植株为哪几个？(填植株编号)
软米基因检测结果
提示 1、4、5、9、10。
【重点难点·透析】
1.限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择Sma Ⅰ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma Ⅰ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcR Ⅰ两种限制酶。
2.标记基因的作用
标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞：
考向 围绕基因工程的基本工具，考查科学思维
1.(2023·江苏盐城调研)图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，ne表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是( )
A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA
B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
答案 D
解析 切割目的基因时，用BamH Ⅰ切割会破坏目的基因，只用PstⅠ切割目的基因和质粒载体，会出现目的基因和质粒的自身环化，或目的基因和质粒的反向连接，而用PstⅠ和Hind Ⅲ进行酶切，能确保目的基因和质粒的正向连接，并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因，A、C正确；在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因，至少需保留其中的一个，B正确；用Pst Ⅰ切割后，质粒上氨苄青霉素抗性基因被破坏了，导入重组质粒的大肠杆菌不可以在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。
2.(2021·全国乙卷，38)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
(1)常用的DNA连接酶有E.cliDNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中________酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA连接酶连接。上图中________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是________。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________；质粒DNA分子上有________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是___________________________________________________________________。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指_____________________________________
____________________________________________________________________。
答案 (1)EcR Ⅰ、Pst Ⅰ EcR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcR Ⅴ (2)磷酸二酯键 (3)自我复制 限制酶切割位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
(4)RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列
解析 (1)由题图可以看出，EcR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcR Ⅴ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E.cli DNA连接酶可用于连接黏性末端，T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。(2)DNA连接酶催化DNA链的5′端与另一DNA链的3′端生成磷酸二酯键。(3)复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中进行自我复制。质粒上有限制酶切割位点，该位点可被限制酶切开并使外源目的基因插入其中。若质粒DNA分子上有某种抗生素抗性基因，则可以用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(4)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
考点二 基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(2)利用PCR获取和扩增目的基因
①在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
②引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
③复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。
④真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
2.基因表达载体的构建——核心
提醒 启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别
3.将目的基因导入受体细胞
只有该步骤没涉及碱基互补配对原则
(1)农杆菌特点
①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的TDNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
(2)农杆菌转化法中的两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的TDNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的TDNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的TDNA导入受体细胞。
(3)导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
4.目的基因的检测与鉴定
【情境推理·探究】
1. 设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。
①第1组：__________________________________________________________；
②第2组：__________________________________________________________。
提示 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效；引物Ⅰ自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。
2.如果将某种抗性基因导入受体细胞后，仅一条染色体含抗性基因，该基因的传递遵循孟德尔分离定律。判断依据是______________________________________
____________________________________________________________________。
提示 仅一条染色体含有抗性基因，另一条没有其等位基因。
3.利用大肠杆菌可生产出人的胰岛素，联系前面各种细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的胰岛素，可用大肠杆菌吗？
提示 不可用。大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的内质网、高尔基体等结构，无法对核糖体合成的肽链进行加工。
考向1 PCR技术及其应用
1.(2021·湖北卷，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是( )
A.增加模板DNA的量
B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间
D.提高复性的温度
答案 D
解析 PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间，有利于双链DNA解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生，B错误；延长延伸的时间，有利于合成新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生，C错误；在一定温度范围内，选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合，D正确。
2.(2022·全国乙卷，38)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题：
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT—PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是________________________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的____________________________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______________。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明________________________(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明_________________________________________________________。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是___________________
___________________________________________________________________。
答案 (1)逆转录酶(或反转录酶) (2)特异性核苷酸序列 复性(或退火) (3)曾感染新冠病毒，已康复 已感染新冠病毒，是患者 (4)获取目的基因→构建基因表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
解析 (1)以病毒RNA为模板合成cDNA是逆转录过程，这一过程需要的酶是逆转录酶(或反转录酶)。获得cDNA后可通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。(2)为确保PCR扩增获得的是特异性序列，从而确保新冠病毒核酸检测的准确性，设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行。PCR过程每次循环分为3步，即变性(超过90 ℃)→复性(50 ℃左右)→延伸(72 ℃左右)，其中温度最低的一步是复性(或退火)。(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明他体内没有新冠病毒，但曾感染新冠病毒，已经康复；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明他体内已感染新冠病毒，是患者。(4)基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
考向2 结合基因工程的基本操作程序，考查科学探究能力
3.(2022·广东卷，22)“绿水逶迤去，青山相向开。”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对______，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是__________________________________________，
终止子的作用是________________________________________________。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是_________________________________________________，
此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了______________，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于
___________________________________________________________________，
具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
答案 (1)引物 (2)作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞 终止转录，使转录在需要的地方停下来 (3)二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长 (4)废物的资源化 不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳
解析 (1)利用PCR技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结合后，耐高温的DNA聚合酶才能从引物的3′端延伸子链。(2)抗生素抗性基因是一种标记基因，其作用是将含有重组质粒的受体细胞筛选出来。终止子的作用是终止转录过程，使转录在需要的地方停下来。(3)重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，在这些酶蛋白的作用下，二氧化碳等气体大量用于合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致重组梭菌生长迟缓。(4)根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原料，实现了废物的资源化，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
4.(2023·中原名校联盟)某质粒上有Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题：
(1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是________；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为________。该方法中农杆菌的作用是_______________________________________________________。
(2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用Hind Ⅲ和Sal Ⅰ两种酶的好处是_________________________________________
________________________________________________________________。
(3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？________(填“是”或“否”)。为什么？_________________________________。
(4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。
答案 (1)Ti质粒 TDNA 感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上 (2)防止目的基因自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率；防止目的基因与质粒反向连接 (3)否 含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏
(4)
跳出题海 如何筛选出含有目的基因的受体细胞
(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如下图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
(2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。
(3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
考点三 DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定
(2)方法步骤
①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础
(2)PCR实验操作步骤
(3)电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300__nm的紫外灯下被检测出来。
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。
③电泳时，DNA的相对分子量越大，迁移速率越慢；DNA的相对分子量越小，迁移速率越快。
考向1 结合DNA的粗提取与鉴定，考查科学探究能力
1.(2023·江苏启东中学检测)如图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，下列相关叙述正确的是( )
A.图1中的溶液a是NaCl溶液
B.图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶
C.图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显
D.图2中试管1的作用是证明2(ml·L－1)的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色
答案 C
解析 图1所示操作为析出DNA，溶液a是研磨液过滤静置后得到的上清液，不是NaCl溶液，A错误；加入预冷的酒精的目的是析出DNA、去除溶于酒精的蛋白质等杂质，原理是DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精，B错误；图2所示操作中的错误是试管中的液面高于水浴的液面，导致试管受热不均匀，C正确；图2中试管1的作用是作为对照，排除NaCl溶液对实验结果的干扰，D错误。
考向2 结合DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查科学探究
2.利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，下列有关“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的相关叙述，错误的是( )
A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理
B.PCR利用了DNA的热变性原理
C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
答案 C
解析 PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，这样才能不破坏缓冲液中稳定性较差的成分，同样保护酶的活性不被破坏，C错误。
3.(2023·河北衡水调研)下列有关电泳的叙述，不正确的是( )
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C.进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
答案 C
解析 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳，即带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，A正确，C错误。
重温真题 经典再现
1.(2021·重庆卷，26)为了研究PDCD4基因对小鼠子宫内膜基质细胞凋亡的影响，进行了相关实验。
(1)取小鼠子宫时，为避免细菌污染，手术器具应进行________处理；子宫取出剪碎后，用________处理一定时间，可获得分散的子宫内膜组织细胞，再分离获得基质细胞用于培养。
(2)培养基中营养物质应有________________(填写两种)；培养箱中CO2浓度为5%，其主要作用是___________________________________________________。
(3)在含PDCD4基因的表达载体中，启动子的作用是___________________________________________________________________。
为了证明PDCD4基因对基质细胞凋亡的作用，以含PDCD4基因的表达载体和基质细胞的混合培养为实验组，还应设立两个对照组，分别为_____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
经检测，实验组中PDCD4表达水平和细胞凋亡率显著高于对照组，说明该基因对基质细胞凋亡具有________(填“抑制”或“促进”)作用。
答案 (1)灭菌(或消毒) 胰蛋白酶或胶原蛋白酶 (2)无机盐、葡萄糖、氨基酸、微量元素、促生长因子、血清或血浆 维持培养液的pH (3)RNA聚合酶的识别和结合位点，驱动转录出相应的mRNA 基质细胞悬浮液和空载体与基质细胞的混合培养液 促进
解析 (1)手术器具应灭菌或消毒处理；分散动物组织细胞用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理。(2)动物细胞培养基中的营养物质有无机盐、葡萄糖、氨基酸、微量元素、促生长因子、血清或血浆；培养箱中浓度为5%的CO2的主要作用是维持培养液的pH。(3)启动子的作用是被RNA聚合酶识别并结合，驱动基因转录出相应的mRNA。要证明PDCD4基因对基质细胞凋亡的作用，实验组是含有PDCD4基因的表达载体和基质细胞的混合培养液，为了能对比得出结果和排除载体本身与培养液的作用，对照组有两组，一组为等量的只含基质细胞的培养液，另一组为等量的空载体(载体上无PDCD4基因)和基质细胞的混合培养液。若实验组的细胞凋亡率高于对照组，说明PDCD4基因对基质细胞凋亡有促进作用。
2.(2022·湖北卷，24改编)“端稳中国碗，装满中国粮”，为了育好中国种，科研人员在杂交育种与基因工程育种等领域开展了大量的研究。二倍体作物M的品系甲有抗虫、高产等多种优良性状，但甜度不高。为了改良品系甲，增加其甜度，育种工作者做了如下实验：
【实验一】遗传特性及杂交育种的研究
在种质资源库中选取乙、丙两个高甜度的品系，用三个纯合品系进行杂交实验，结果如下表。
【实验二】甜度相关基因的筛选
通过对甲、乙、丙三个品系转录的mRNA分析，发现基因S与作物M的甜度相关。
【实验三】转S基因新品系的培育
提取品系乙的mRNA，通过基因重组技术，以Ti质粒为表达载体，以品系甲的叶片外植体为受体，培育出转S基因的新品系。
根据研究组的实验研究，回答下列问题：
(1)假设不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，则乙、丙杂交的F2中表现为甜的植株基因型有________种。品系乙基因型为________。若用乙×丙中F2不甜的植株进行自交，F3中甜∶不甜比例为________。
(2)下图中，能解释(1)中杂交实验结果的代谢途径有________。
(3)如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶(限制性核酸内切酶)酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用________________酶切割S基因的cDNA和载体。
(4)用农杆菌侵染品系甲叶片外植体，其目的是____________________________
__________________________________________________________________。
(5)除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外，能获得高甜度品系，同时保持甲的其他优良性状的育种方法还有________________(答出2点即可)。
答案 (1)①7 ②aabb ③1∶5 (2)①③ (3)XbaⅠ、HindⅢ (4)通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞 (5)单倍体育种、诱变育种
解析 (1)甲为纯合不甜品系，基因型为AAbb，根据实验一结果可推得乙基因型为aabb，丙基因型为AABB，乙、丙杂交的F2基因型有3×3＝9种，由于不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，F2中表现为甜的植株基因型有7种。若用乙×丙中F2不甜的植株进行自交，F3中不甜比例＝1/3＋2/3×3/4＝5/6，F3中甜∶不甜比例为1∶5。(2)不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，只有A导致不甜，当A与B同时存在时，表现为甜，故选①③。(3)为了成功构建重组表达载体，不破坏载体关键结构和目的基因，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用XbaⅠ、HindⅢ酶切割S基因的cDNA和载体。(4)用农杆菌侵染品系甲叶片外植体，可以通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞。(5)除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外，能获得高甜度品系，同时保持甲的其他优良性状的育种方法还有单倍体育种、诱变育种。
限时强化练
(时间：30分钟)
【对点强化】
考点一 重组DNA技术的基本工具
1.(2023·山东日照期中)四种限制酶的切割位点如图所示，下列叙述错误的是( )
A.上图中EcR Ⅰ、Pst Ⅰ两种酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA连接酶连接
B.图中Sma Ⅰ、EcR V两种酶切割后的DNA片段，可以用T4 DNA连接酶连接
C.DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段连接的化学键是磷酸二酯键
D.限制酶能识别特定的核苷酸序列，具有专一性，不同的限制酶切割不能产生相同的黏性末端
答案 D
解析 不同的限制酶切割也可能形成相同的黏性末端，D错误。
2.(2023·北京海淀区模拟)科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病毒番木瓜，Ti质粒结构模式图如图所示。下列叙述正确的是( )
A.农杆菌的TDNA与番木瓜基因发生重组
B.构建重组质粒需要限制酶和DNA聚合酶
C.含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性
D.转基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性
答案 A
解析 构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶，B错误；抗病毒蛋白基因C的插入位点位于四环素抗性基因内部，插入抗病毒蛋白基因C后，重组Ti质粒的四环素抗性基因被破坏，含重组Ti质粒的农杆菌不具有四环素抗性，C错误；转基因抗病番木瓜含有卡那霉素抗性基因，故转基因抗病番木瓜具有卡那霉素抗性，D错误。
考点二 基因工程的基本操作程序
3.(2023·北京民族大学附中期末)下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是( )
A.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
B.③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上
C.④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
D.②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与
答案 A
解析 ⑤为转基因植物，只要表现出抗虫性状就说明转入的目的基因成功表达了，基因工程的原理是基因重组，属于可遗传变异，A正确；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的TDNA整合到植物细胞的染色体上，B错误；受体细胞的染色体上可能含抗虫基因，但不代表该基因就一定成功表达，因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状，C错误；基因表达载体的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与，D错误。
4.(2023·山东济宁联考)图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述错误的是( )
A.若通过PCR获取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙
B.图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ剪切
C.若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用Ca2＋转化法
D.在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达
答案 D
解析 通过PCR获取目的基因时，两种引物分别和目的基因的两条单链结合，并沿相反的方向合成子链，故选用引物甲和引物丙，A正确；由甲图可知，选用BamHⅠ会破坏两种抗性基因，结合乙图可确定应选择BclⅠ和HindⅢ剪切，B正确；将目的基因导入大肠杆菌常采用Ca2＋转化法，C正确；构建重组质粒时目的基因插入氨苄青霉素抗性基因中，故氨苄青霉素抗性基因被破坏不能表达，D错误。
【综合提升】
5.(2023·河南新乡模拟)赖氨酸是人体(成人)8种必需氨基酸之一，玉米中的赖氨酸含量比较低，其原因如图所示。通过基因工程中的定点诱变技术，将天冬氨酸激酶(AK)的第352位苏氨酸诱变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)的第104位天冬酰胺诱变成异亮氨酸，就可以使玉米叶片和种子中游离的赖氨酸分别提高5倍和2倍。回答下列问题：
(1)从“提升玉米种子中的赖氨酸含量”这一功能出发，预期构建出_____________________________________________________________________
的结构，再推测出DHDPS基因的序列，最终合成DHDPS基因，该技术属于________工程。
(2)利用________技术可在体外大量扩增DHDPS基因，此过程需要________酶，该酶能在高温条件下催化DNA子链的延伸。
(3)将DHDPS基因导入玉米细胞中需要借助________________的运输。为确保DHDPS基因能随玉米细胞的核DNA同步复制，需要将DHDPS基因插入玉米细胞的________________________上。
(4)借助________________技术，可将转基因玉米细胞培育成转基因植株。若要从个体水平上鉴定转DHDPS基因的玉米育种工作是否成功，需要测定
__________________________________________________________________。
答案 (1)二氢吡啶二羧酸合成酶(DHDPS) 蛋白质 (2)PCR 耐高温的DNA聚合 (3)基因表达载体 染色体DNA (4)植物组织培养 玉米种子中赖氨酸的含量
解析 (1)从“提升玉米种子中的赖氨酸含量”这一功能出发，预期构建出二氢吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)的结构，再推测出DHDPS基因的序列，最终合成DHDPS基因，该技术属于蛋白质工程。(2)通常采用PCR技术扩增目的基因，该过程中需要耐高温的DNA聚合酶的催化。(3)将目的基因导入玉米细胞中需要借助基因表达载体的运输。要想确保目的基因在玉米细胞中随核DNA同步复制，必须将目的基因插入玉米细胞的染色体DNA上。(4)将转基因玉米细胞培育成转基因植株可利用植物组织培养技术。若要从个体水平上鉴定转DHDPS基因的玉米育种工作是否成功，需要测定玉米种子中赖氨酸的含量。
6.(2023·黑龙江哈三中阶段考)口服α干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。如图1为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程。请回答下列问题：
图1
(1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
由于DNA复制时，子链只能由5′向3′方向延伸，因此可以从图2 A、B、C、D四种单链DNA片段中选取________作为引物。
图2
(2)步骤②用到的农杆菌Ti质粒的功能是_________________________________。
图1过程涉及的生物工程包括植物基因工程和________，后者利用了细胞________的原理。
(3)如果将干扰素基因导入哺乳动物的受精卵，早期胚胎培养至________阶段，然后进行胚胎移植，可从转基因动物分泌的乳汁中获得干扰素，人们把这种转基因动物称为________。
(4)干扰素体外保存相当困难，如果将其分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，就可在－70 ℃条件下保存半年，给广大患者带来福音。对蛋白质进行改造，应该直接对________进行操作。原因是_______________________________________
_______________________________________________________(答出2点即可)。
答案 (1)干扰素基因两端的部分核苷酸序列 B、C (2)将目的基因整合到受体细胞染色体DNA上 植物细胞工程 增殖 (3)桑葚胚或囊胚 乳房生物反应器(或乳腺生物反应器) (4)基因 蛋白质都是由基因编码的，改造了基因也就是对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以通过改造过的基因遗传下去；对基因进行改造比对蛋白质直接进行改造要容易操作，难度要小得多
解析 (1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是干扰素基因两端的部分核苷酸序列。因为DNA复制时，子链总是从5′向3′方向延伸，子链与模板链反向平行，所以利用PCR技术扩增干扰素基因时，可以从图2的A、B、C、D四种单链DNA片段中选取B和C片段作为引物。
(2)农杆菌的Ti质粒上的TDNA可将目的基因整合到受体细胞染色体DNA上。分析题图1可知，图示过程涉及的生物工程包括植物基因工程和植物细胞工程，后者利用了细胞增殖的原理。(3)通过基因工程得到的受精卵要在体外进行早期胚胎培养，一般培养至桑葚胚或囊胚阶段进行胚胎移植。转基因动物发育成熟后，可从转基因动物分泌的乳汁中获得干扰素，人们把这种转基因生物称为乳房生物反应器，也叫乳腺生物反应器。(4)对蛋白质进行改造，应该直接对基因进行操作，理由见答案。
7.(2023·云南名校联盟)干扰素是动物体内的一种蛋白质，几乎能抵抗所有病毒引起的感染，在新冠病毒的治疗过程中起到了重要作用。此外，干扰素还用于治疗乳腺癌、骨髓癌、淋巴癌等癌症。传统的生产方法是从人体血液中的白细胞中提取，产量很低。用基因工程方法让酵母菌生产人的干扰素，可以使产量大幅度提高。回答下列问题：
(1)基因工程的核心步骤是_____________________________________________，
该步骤需要用限制酶PstⅠ切割质粒和干扰素基因，已知Pst Ⅰ识别的核苷酸序列以及切割位点为CTGCA↓G，则PstⅠ切割干扰素基因和质粒产生的黏性末端为________，可以用________________(填“E.cliDNA连接酶”“T4DNA连接酶”或“E.cliDNA连接酶或T4DNA连接酶”)将切割后的黏性末端缝合在一起。
(2)酵母菌等微生物作为工程菌的优点有_________________________________
____________________________________________________________________
(答出两点即可)。将带干扰素基因的质粒导入酵母菌细胞常用Ca2＋处理细胞，使其成为________细胞。
(3)干扰素基因在酵母菌细胞中稳定存在并完成表达的过程叫________。检测干扰素基因在酵母菌中是否翻译出干扰素，常用的检测方法是________。
答案 (1)基因表达载体的构建 eq \a\vs4\al(—CTGCA,—G)
E.cli DNA连接酶或T4 DNA连接酶 (2)单细胞、繁殖快、遗传物质相对较少等 感受态 (3)转化 抗原—抗体杂交
解析 (1)基因工程的核心步骤是构建基因表达载体，根据Pst Ⅰ限制酶识别的序列和切割的位点可以判断其切割DNA产生的黏性末端为eq \a\vs4\al(—CTGCA,—G)，能够连接黏性末端的酶有E.cli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。(2)酵母菌等微生物作为工程菌的优点有单细胞、繁殖快、遗传物质相对较少等。将目的基因导入受体细胞，根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法，通常用Ca2＋处理微生物。(3)干扰素基因在酵母菌细胞中稳定存在并完成表达的过程叫转化。检测干扰素基因在酵母菌中是否翻译出干扰素，常用的检测方法是抗原—抗体杂交。
杂交组合
F1表型
F2表型
甲×乙
不甜
1/4甜、3/4不甜
甲×丙
甜
3/4甜，1/4不甜
乙×丙
甜
13/16甜、3/16不甜
考点一 重组DNA技术的基本工具
1.基因工程概述
基因工程的理论基础
2.重组DNA技术的基本工具
(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
①将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)DNA连接酶
①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
(3)载体
【情境推理·探究】
1.实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具，除具备普通“质粒载体”的条件外，还应具有的条件是__________________________________________________
____________________________________________________(答出两点即可)。
提示 对靶细胞具有较高的转化效率，不能增殖，对细胞无害。
2.限制性内切核酸酶EcRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcRⅠ切割后所形成的黏性末端。
提示
3.软米基因会导致水稻稻米合成直链淀粉含量降低呈现软米特征，人们大多喜欢软米的口感，为获得高产软米粳型水稻，软米基因Weq \\al(mq,x)与蜡质基因Wx互为等位基因，序列长度相同均为557碱基对(bp)，但基因内部出现了限制酶NlaⅢ识别位点，用限制酶NlaⅢ处理不同植株的DNA片段，获得电泳图如下，分析可知含有纯合软米基因的植株为哪几个？(填植株编号)
软米基因检测结果
提示 1、4、5、9、10。
【重点难点·透析】
1.限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择Sma Ⅰ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma Ⅰ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcR Ⅰ两种限制酶。
2.标记基因的作用
标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞：
考向 围绕基因工程的基本工具，考查科学思维
1.(2023·江苏盐城调研)图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，ne表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是( )
A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA
B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
答案 D
解析 切割目的基因时，用BamH Ⅰ切割会破坏目的基因，只用PstⅠ切割目的基因和质粒载体，会出现目的基因和质粒的自身环化，或目的基因和质粒的反向连接，而用PstⅠ和Hind Ⅲ进行酶切，能确保目的基因和质粒的正向连接，并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因，A、C正确；在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因，至少需保留其中的一个，B正确；用Pst Ⅰ切割后，质粒上氨苄青霉素抗性基因被破坏了，导入重组质粒的大肠杆菌不可以在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。
2.(2021·全国乙卷，38)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
(1)常用的DNA连接酶有E.cliDNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中________酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA连接酶连接。上图中________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是________。
(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能________；质粒DNA分子上有________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是___________________________________________________________________。
(4)表达载体含有启动子，启动子是指_____________________________________
____________________________________________________________________。
答案 (1)EcR Ⅰ、Pst Ⅰ EcR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcR Ⅴ (2)磷酸二酯键 (3)自我复制 限制酶切割位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
(4)RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列
解析 (1)由题图可以看出，EcR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcR Ⅴ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E.cli DNA连接酶可用于连接黏性末端，T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。(2)DNA连接酶催化DNA链的5′端与另一DNA链的3′端生成磷酸二酯键。(3)复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中进行自我复制。质粒上有限制酶切割位点，该位点可被限制酶切开并使外源目的基因插入其中。若质粒DNA分子上有某种抗生素抗性基因，则可以用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(4)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
考点二 基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(2)利用PCR获取和扩增目的基因
①在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
②引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
③复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。
④真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
2.基因表达载体的构建——核心
提醒 启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别
3.将目的基因导入受体细胞
只有该步骤没涉及碱基互补配对原则
(1)农杆菌特点
①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的TDNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
(2)农杆菌转化法中的两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的TDNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的TDNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的TDNA导入受体细胞。
(3)导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
4.目的基因的检测与鉴定
【情境推理·探究】
1. 设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。
①第1组：__________________________________________________________；
②第2组：__________________________________________________________。
提示 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效；引物Ⅰ自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。
2.如果将某种抗性基因导入受体细胞后，仅一条染色体含抗性基因，该基因的传递遵循孟德尔分离定律。判断依据是______________________________________
____________________________________________________________________。
提示 仅一条染色体含有抗性基因，另一条没有其等位基因。
3.利用大肠杆菌可生产出人的胰岛素，联系前面各种细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的胰岛素，可用大肠杆菌吗？
提示 不可用。大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的内质网、高尔基体等结构，无法对核糖体合成的肽链进行加工。
考向1 PCR技术及其应用
1.(2021·湖北卷，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是( )
A.增加模板DNA的量
B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间
D.提高复性的温度
答案 D
解析 PCR过程中，引物和模板不完全配对会形成非特异条带，增加模板DNA的量不会减少反应中非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间，有利于双链DNA解聚为单链，不能减少反应中非特异条带的产生，B错误；延长延伸的时间，有利于合成新的DNA链，但不能减少反应中非特异条带的产生，C错误；在一定温度范围内，选择较高的复性温度可减少引物和模板间的非特异性结合，D正确。
2.(2022·全国乙卷，38)新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题：
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA(核酸检测)可以采取RT—PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是________________________，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的____________________________________来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是______________。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测(检测体内是否有新冠病毒抗体)，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明________________________(答出1种情况即可)；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明_________________________________________________________。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是___________________
___________________________________________________________________。
答案 (1)逆转录酶(或反转录酶) (2)特异性核苷酸序列 复性(或退火) (3)曾感染新冠病毒，已康复 已感染新冠病毒，是患者 (4)获取目的基因→构建基因表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
解析 (1)以病毒RNA为模板合成cDNA是逆转录过程，这一过程需要的酶是逆转录酶(或反转录酶)。获得cDNA后可通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。(2)为确保PCR扩增获得的是特异性序列，从而确保新冠病毒核酸检测的准确性，设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行。PCR过程每次循环分为3步，即变性(超过90 ℃)→复性(50 ℃左右)→延伸(72 ℃左右)，其中温度最低的一步是复性(或退火)。(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明他体内没有新冠病毒，但曾感染新冠病毒，已经康复；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明他体内已感染新冠病毒，是患者。(4)基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。
考向2 结合基因工程的基本操作程序，考查科学探究能力
3.(2022·广东卷，22)“绿水逶迤去，青山相向开。”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业)为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如图)设计一对______，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是__________________________________________，
终止子的作用是________________________________________________。
(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是_________________________________________________，
此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
(4)这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了______________，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于
___________________________________________________________________，
具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
答案 (1)引物 (2)作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞 终止转录，使转录在需要的地方停下来 (3)二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长 (4)废物的资源化 不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳
解析 (1)利用PCR技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结合后，耐高温的DNA聚合酶才能从引物的3′端延伸子链。(2)抗生素抗性基因是一种标记基因，其作用是将含有重组质粒的受体细胞筛选出来。终止子的作用是终止转录过程，使转录在需要的地方停下来。(3)重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，在这些酶蛋白的作用下，二氧化碳等气体大量用于合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致重组梭菌生长迟缓。(4)根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术，以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原料，实现了废物的资源化，体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看，该技术生产丙酮的过程不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
4.(2023·中原名校联盟)某质粒上有Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题：
(1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是________；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为________。该方法中农杆菌的作用是_______________________________________________________。
(2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用Hind Ⅲ和Sal Ⅰ两种酶的好处是_________________________________________
________________________________________________________________。
(3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？________(填“是”或“否”)。为什么？_________________________________。
(4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。
答案 (1)Ti质粒 TDNA 感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上 (2)防止目的基因自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率；防止目的基因与质粒反向连接 (3)否 含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏
(4)
跳出题海 如何筛选出含有目的基因的受体细胞
(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如下图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
(2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。
(3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
考点三 DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定
(2)方法步骤
①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础
(2)PCR实验操作步骤
(3)电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300__nm的紫外灯下被检测出来。
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。
③电泳时，DNA的相对分子量越大，迁移速率越慢；DNA的相对分子量越小，迁移速率越快。
考向1 结合DNA的粗提取与鉴定，考查科学探究能力
1.(2023·江苏启东中学检测)如图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，下列相关叙述正确的是( )
A.图1中的溶液a是NaCl溶液
B.图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶
C.图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显
D.图2中试管1的作用是证明2(ml·L－1)的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色
答案 C
解析 图1所示操作为析出DNA，溶液a是研磨液过滤静置后得到的上清液，不是NaCl溶液，A错误；加入预冷的酒精的目的是析出DNA、去除溶于酒精的蛋白质等杂质，原理是DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精，B错误；图2所示操作中的错误是试管中的液面高于水浴的液面，导致试管受热不均匀，C正确；图2中试管1的作用是作为对照，排除NaCl溶液对实验结果的干扰，D错误。
考向2 结合DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查科学探究
2.利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增，下列有关“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验的相关叙述，错误的是( )
A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理
B.PCR利用了DNA的热变性原理
C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
答案 C
解析 PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，应放在冰块上缓慢融化，这样才能不破坏缓冲液中稳定性较差的成分，同样保护酶的活性不被破坏，C错误。
3.(2023·河北衡水调研)下列有关电泳的叙述，不正确的是( )
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C.进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
答案 C
解析 DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳，即带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，A正确，C错误。
重温真题 经典再现
1.(2021·重庆卷，26)为了研究PDCD4基因对小鼠子宫内膜基质细胞凋亡的影响，进行了相关实验。
(1)取小鼠子宫时，为避免细菌污染，手术器具应进行________处理；子宫取出剪碎后，用________处理一定时间，可获得分散的子宫内膜组织细胞，再分离获得基质细胞用于培养。
(2)培养基中营养物质应有________________(填写两种)；培养箱中CO2浓度为5%，其主要作用是___________________________________________________。
(3)在含PDCD4基因的表达载体中，启动子的作用是___________________________________________________________________。
为了证明PDCD4基因对基质细胞凋亡的作用，以含PDCD4基因的表达载体和基质细胞的混合培养为实验组，还应设立两个对照组，分别为_____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
经检测，实验组中PDCD4表达水平和细胞凋亡率显著高于对照组，说明该基因对基质细胞凋亡具有________(填“抑制”或“促进”)作用。
答案 (1)灭菌(或消毒) 胰蛋白酶或胶原蛋白酶 (2)无机盐、葡萄糖、氨基酸、微量元素、促生长因子、血清或血浆 维持培养液的pH (3)RNA聚合酶的识别和结合位点，驱动转录出相应的mRNA 基质细胞悬浮液和空载体与基质细胞的混合培养液 促进
解析 (1)手术器具应灭菌或消毒处理；分散动物组织细胞用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理。(2)动物细胞培养基中的营养物质有无机盐、葡萄糖、氨基酸、微量元素、促生长因子、血清或血浆；培养箱中浓度为5%的CO2的主要作用是维持培养液的pH。(3)启动子的作用是被RNA聚合酶识别并结合，驱动基因转录出相应的mRNA。要证明PDCD4基因对基质细胞凋亡的作用，实验组是含有PDCD4基因的表达载体和基质细胞的混合培养液，为了能对比得出结果和排除载体本身与培养液的作用，对照组有两组，一组为等量的只含基质细胞的培养液，另一组为等量的空载体(载体上无PDCD4基因)和基质细胞的混合培养液。若实验组的细胞凋亡率高于对照组，说明PDCD4基因对基质细胞凋亡有促进作用。
2.(2022·湖北卷，24改编)“端稳中国碗，装满中国粮”，为了育好中国种，科研人员在杂交育种与基因工程育种等领域开展了大量的研究。二倍体作物M的品系甲有抗虫、高产等多种优良性状，但甜度不高。为了改良品系甲，增加其甜度，育种工作者做了如下实验：
【实验一】遗传特性及杂交育种的研究
在种质资源库中选取乙、丙两个高甜度的品系，用三个纯合品系进行杂交实验，结果如下表。
【实验二】甜度相关基因的筛选
通过对甲、乙、丙三个品系转录的mRNA分析，发现基因S与作物M的甜度相关。
【实验三】转S基因新品系的培育
提取品系乙的mRNA，通过基因重组技术，以Ti质粒为表达载体，以品系甲的叶片外植体为受体，培育出转S基因的新品系。
根据研究组的实验研究，回答下列问题：
(1)假设不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，则乙、丙杂交的F2中表现为甜的植株基因型有________种。品系乙基因型为________。若用乙×丙中F2不甜的植株进行自交，F3中甜∶不甜比例为________。
(2)下图中，能解释(1)中杂交实验结果的代谢途径有________。
(3)如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶(限制性核酸内切酶)酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用________________酶切割S基因的cDNA和载体。
(4)用农杆菌侵染品系甲叶片外植体，其目的是____________________________
__________________________________________________________________。
(5)除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外，能获得高甜度品系，同时保持甲的其他优良性状的育种方法还有________________(答出2点即可)。
答案 (1)①7 ②aabb ③1∶5 (2)①③ (3)XbaⅠ、HindⅢ (4)通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞 (5)单倍体育种、诱变育种
解析 (1)甲为纯合不甜品系，基因型为AAbb，根据实验一结果可推得乙基因型为aabb，丙基因型为AABB，乙、丙杂交的F2基因型有3×3＝9种，由于不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，F2中表现为甜的植株基因型有7种。若用乙×丙中F2不甜的植株进行自交，F3中不甜比例＝1/3＋2/3×3/4＝5/6，F3中甜∶不甜比例为1∶5。(2)不甜植株的基因型为AAbb和Aabb，只有A导致不甜，当A与B同时存在时，表现为甜，故选①③。(3)为了成功构建重组表达载体，不破坏载体关键结构和目的基因，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用XbaⅠ、HindⅢ酶切割S基因的cDNA和载体。(4)用农杆菌侵染品系甲叶片外植体，可以通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞。(5)除了题中所示的杂交育种和基因工程育种外，能获得高甜度品系，同时保持甲的其他优良性状的育种方法还有单倍体育种、诱变育种。
限时强化练
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【对点强化】
考点一 重组DNA技术的基本工具
1.(2023·山东日照期中)四种限制酶的切割位点如图所示，下列叙述错误的是( )
A.上图中EcR Ⅰ、Pst Ⅰ两种酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA连接酶连接
B.图中Sma Ⅰ、EcR V两种酶切割后的DNA片段，可以用T4 DNA连接酶连接
C.DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段连接的化学键是磷酸二酯键
D.限制酶能识别特定的核苷酸序列，具有专一性，不同的限制酶切割不能产生相同的黏性末端
答案 D
解析 不同的限制酶切割也可能形成相同的黏性末端，D错误。
2.(2023·北京海淀区模拟)科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病毒番木瓜，Ti质粒结构模式图如图所示。下列叙述正确的是( )
A.农杆菌的TDNA与番木瓜基因发生重组
B.构建重组质粒需要限制酶和DNA聚合酶
C.含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性
D.转基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性
答案 A
解析 构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶，B错误；抗病毒蛋白基因C的插入位点位于四环素抗性基因内部，插入抗病毒蛋白基因C后，重组Ti质粒的四环素抗性基因被破坏，含重组Ti质粒的农杆菌不具有四环素抗性，C错误；转基因抗病番木瓜含有卡那霉素抗性基因，故转基因抗病番木瓜具有卡那霉素抗性，D错误。
考点二 基因工程的基本操作程序
3.(2023·北京民族大学附中期末)下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是( )
A.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
B.③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上
C.④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
D.②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与
答案 A
解析 ⑤为转基因植物，只要表现出抗虫性状就说明转入的目的基因成功表达了，基因工程的原理是基因重组，属于可遗传变异，A正确；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的TDNA整合到植物细胞的染色体上，B错误；受体细胞的染色体上可能含抗虫基因，但不代表该基因就一定成功表达，因此不能确定⑤是否表现出抗虫性状，C错误；基因表达载体的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与，D错误。
4.(2023·山东济宁联考)图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述错误的是( )
A.若通过PCR获取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙
B.图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ剪切
C.若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用Ca2＋转化法
D.在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达
答案 D
解析 通过PCR获取目的基因时，两种引物分别和目的基因的两条单链结合，并沿相反的方向合成子链，故选用引物甲和引物丙，A正确；由甲图可知，选用BamHⅠ会破坏两种抗性基因，结合乙图可确定应选择BclⅠ和HindⅢ剪切，B正确；将目的基因导入大肠杆菌常采用Ca2＋转化法，C正确；构建重组质粒时目的基因插入氨苄青霉素抗性基因中，故氨苄青霉素抗性基因被破坏不能表达，D错误。
【综合提升】
5.(2023·河南新乡模拟)赖氨酸是人体(成人)8种必需氨基酸之一，玉米中的赖氨酸含量比较低，其原因如图所示。通过基因工程中的定点诱变技术，将天冬氨酸激酶(AK)的第352位苏氨酸诱变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)的第104位天冬酰胺诱变成异亮氨酸，就可以使玉米叶片和种子中游离的赖氨酸分别提高5倍和2倍。回答下列问题：
(1)从“提升玉米种子中的赖氨酸含量”这一功能出发，预期构建出_____________________________________________________________________
的结构，再推测出DHDPS基因的序列，最终合成DHDPS基因，该技术属于________工程。
(2)利用________技术可在体外大量扩增DHDPS基因，此过程需要________酶，该酶能在高温条件下催化DNA子链的延伸。
(3)将DHDPS基因导入玉米细胞中需要借助________________的运输。为确保DHDPS基因能随玉米细胞的核DNA同步复制，需要将DHDPS基因插入玉米细胞的________________________上。
(4)借助________________技术，可将转基因玉米细胞培育成转基因植株。若要从个体水平上鉴定转DHDPS基因的玉米育种工作是否成功，需要测定
__________________________________________________________________。
答案 (1)二氢吡啶二羧酸合成酶(DHDPS) 蛋白质 (2)PCR 耐高温的DNA聚合 (3)基因表达载体 染色体DNA (4)植物组织培养 玉米种子中赖氨酸的含量
解析 (1)从“提升玉米种子中的赖氨酸含量”这一功能出发，预期构建出二氢吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)的结构，再推测出DHDPS基因的序列，最终合成DHDPS基因，该技术属于蛋白质工程。(2)通常采用PCR技术扩增目的基因，该过程中需要耐高温的DNA聚合酶的催化。(3)将目的基因导入玉米细胞中需要借助基因表达载体的运输。要想确保目的基因在玉米细胞中随核DNA同步复制，必须将目的基因插入玉米细胞的染色体DNA上。(4)将转基因玉米细胞培育成转基因植株可利用植物组织培养技术。若要从个体水平上鉴定转DHDPS基因的玉米育种工作是否成功，需要测定玉米种子中赖氨酸的含量。
6.(2023·黑龙江哈三中阶段考)口服α干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。如图1为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程。请回答下列问题：
图1
(1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
由于DNA复制时，子链只能由5′向3′方向延伸，因此可以从图2 A、B、C、D四种单链DNA片段中选取________作为引物。
图2
(2)步骤②用到的农杆菌Ti质粒的功能是_________________________________。
图1过程涉及的生物工程包括植物基因工程和________，后者利用了细胞________的原理。
(3)如果将干扰素基因导入哺乳动物的受精卵，早期胚胎培养至________阶段，然后进行胚胎移植，可从转基因动物分泌的乳汁中获得干扰素，人们把这种转基因动物称为________。
(4)干扰素体外保存相当困难，如果将其分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，就可在－70 ℃条件下保存半年，给广大患者带来福音。对蛋白质进行改造，应该直接对________进行操作。原因是_______________________________________
_______________________________________________________(答出2点即可)。
答案 (1)干扰素基因两端的部分核苷酸序列 B、C (2)将目的基因整合到受体细胞染色体DNA上 植物细胞工程 增殖 (3)桑葚胚或囊胚 乳房生物反应器(或乳腺生物反应器) (4)基因 蛋白质都是由基因编码的，改造了基因也就是对蛋白质进行了改造，而且改造过的蛋白质可以通过改造过的基因遗传下去；对基因进行改造比对蛋白质直接进行改造要容易操作，难度要小得多
解析 (1)步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是干扰素基因两端的部分核苷酸序列。因为DNA复制时，子链总是从5′向3′方向延伸，子链与模板链反向平行，所以利用PCR技术扩增干扰素基因时，可以从图2的A、B、C、D四种单链DNA片段中选取B和C片段作为引物。
(2)农杆菌的Ti质粒上的TDNA可将目的基因整合到受体细胞染色体DNA上。分析题图1可知，图示过程涉及的生物工程包括植物基因工程和植物细胞工程，后者利用了细胞增殖的原理。(3)通过基因工程得到的受精卵要在体外进行早期胚胎培养，一般培养至桑葚胚或囊胚阶段进行胚胎移植。转基因动物发育成熟后，可从转基因动物分泌的乳汁中获得干扰素，人们把这种转基因生物称为乳房生物反应器，也叫乳腺生物反应器。(4)对蛋白质进行改造，应该直接对基因进行操作，理由见答案。
7.(2023·云南名校联盟)干扰素是动物体内的一种蛋白质，几乎能抵抗所有病毒引起的感染，在新冠病毒的治疗过程中起到了重要作用。此外，干扰素还用于治疗乳腺癌、骨髓癌、淋巴癌等癌症。传统的生产方法是从人体血液中的白细胞中提取，产量很低。用基因工程方法让酵母菌生产人的干扰素，可以使产量大幅度提高。回答下列问题：
(1)基因工程的核心步骤是_____________________________________________，
该步骤需要用限制酶PstⅠ切割质粒和干扰素基因，已知Pst Ⅰ识别的核苷酸序列以及切割位点为CTGCA↓G，则PstⅠ切割干扰素基因和质粒产生的黏性末端为________，可以用________________(填“E.cliDNA连接酶”“T4DNA连接酶”或“E.cliDNA连接酶或T4DNA连接酶”)将切割后的黏性末端缝合在一起。
(2)酵母菌等微生物作为工程菌的优点有_________________________________
____________________________________________________________________
(答出两点即可)。将带干扰素基因的质粒导入酵母菌细胞常用Ca2＋处理细胞，使其成为________细胞。
(3)干扰素基因在酵母菌细胞中稳定存在并完成表达的过程叫________。检测干扰素基因在酵母菌中是否翻译出干扰素，常用的检测方法是________。
答案 (1)基因表达载体的构建 eq \a\vs4\al(—CTGCA,—G)
E.cli DNA连接酶或T4 DNA连接酶 (2)单细胞、繁殖快、遗传物质相对较少等 感受态 (3)转化 抗原—抗体杂交
解析 (1)基因工程的核心步骤是构建基因表达载体，根据Pst Ⅰ限制酶识别的序列和切割的位点可以判断其切割DNA产生的黏性末端为eq \a\vs4\al(—CTGCA,—G)，能够连接黏性末端的酶有E.cli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。(2)酵母菌等微生物作为工程菌的优点有单细胞、繁殖快、遗传物质相对较少等。将目的基因导入受体细胞，根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法，通常用Ca2＋处理微生物。(3)干扰素基因在酵母菌细胞中稳定存在并完成表达的过程叫转化。检测干扰素基因在酵母菌中是否翻译出干扰素，常用的检测方法是抗原—抗体杂交。
杂交组合
F1表型
F2表型
甲×乙
不甜
1/4甜、3/4不甜
甲×丙
甜
3/4甜，1/4不甜
乙×丙
甜
13/16甜、3/16不甜
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