2024届高考生物一轮总复习第十二单元发酵工程第2讲微生物的培养技术及应用教师用书

第 2 讲　微生物的培养技术及应用


　　　　

1．培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质。(√)
2．消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害。(√)
3．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。(×)
4．选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。(×)
5．对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法。(×)
6．筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。(√)
7．分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使培养基的酸碱度降低。(×)
8．统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行统计。(×)
系统学习(一)　培养基及微生物的纯培养技术(释疑点)
　　　　　基础知识·全面掌握
1．培养基的配制
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。
(2)种类。
划分标准
种类
特点
用途
物理性质
液体培养基
不加凝固剂
工业生产
半固体培养基
加凝固剂，如琼脂
观察微生物的运动
固体培养基
微生物分离、鉴定，活菌计数
化学成分
天然培养基
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
合成培养基
培养基成分明确(用化学成分已知的化学物质制备)
微生物的分类、鉴定
用途
选择培养基
允许特定种类微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基
富集、分离出特定的微生物(如用以尿素为唯一氮源的培养基筛选尿素分解菌)
鉴别培养基
根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品
鉴别不同种类的微生物(如用伊红-亚甲蓝培养基鉴别饮用水中是否有大肠杆菌)
(3)成分。
各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
2．无菌技术
(1)含义：在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
(2)常用方法。
项目
消毒
灭菌
条件
较为温和的物理、化学或生物等方法
强烈的理化方法
结果
杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)
杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)
常用方法
煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法
湿热灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌
3.微生物的纯培养
(1)概念：由单一个体繁殖所获得的微生物群体是纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
(2)过程：包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。
(3)常用方法：平板划线法和稀释涂布平板法。
(4)实例——酵母菌的纯培养。

————————————■链教材资料·发展科学思维■————————————
1．(选择性必修3 P10旁栏思考)无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？
提示：还能有效避免操作者自身被微生物感染。
2．(选择性必修3 P12“探究·实践”思考分析)
(1)为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
提示：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面湿度也比较高，将平板倒置，既可以防止培养基表面的水分过快地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
(2)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
提示：不能。因为空气中的微生物可能在皿盖和皿底之间的培养基上滋生，可能会造成污染。
(3)平板划线法在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？目的是什么？
提示：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，第二次以及其后的划线从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。这样做的目的是将聚集的菌种逐步稀释分散以便获得单个菌落。
　　　　　　重难盲点·讲练疏通
——————————————————————————
培养基及消毒和灭菌
————————————————————————————————————————
1．培养基营养成分的作用

成分
含义
作用
碳源
提供碳元素的物质
构成生物体细胞的物质和一些代谢物，有些也是异养生物的能源物质
氮源
提供氮元素的物质
合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢物
无机盐
为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素和微量元素
是细胞的组成成分、生理调节物质、某些化能自养菌的能源，酶的激活剂等
水
生物体内含量很高的无机物
不仅是良好的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定
2.比较消毒和灭菌
方法
条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理、化学或生物方法
仅杀死物体表面或内部的部分微生物
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体，如牛奶
化学药剂消毒法
用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理化方法
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属用具
湿热灭菌法
培养基及容器
[对点练习]
1．大肠杆菌是寄生于人和动物肠道中的细菌，利用其代谢产物能与染料伊红-亚甲蓝反应，使菌落呈黑色的特性，从而将其鉴别出来。下表是其培养基配方，相关叙述错误的是(　 )
成分
蛋白胨
乳糖
磷酸二氢钾
X
蒸馏水
2%伊红水溶液
0.5%亚甲蓝水溶液
含量
10 g
10 g
2 g
20～30 g
1 000 mL
20 mL
13 mL

A.培养基配方中X的成分可以是琼脂
B．该培养基中蛋白胨提供的主要营养有碳源、氮源和维生素
C．可采用干热灭菌法对该培养基灭菌
D．可利用培养基上菌落的特征来判断和鉴别大肠杆菌的存在
解析：选C　对培养基进行灭菌应该采用高压蒸汽灭菌法，C错误。
2．在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免细菌的污染。回答下列问题：
(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能________________。在照射前，适量喷洒________，可强化消毒效果。
(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是______________________________________________________________。
解析：(1)干热灭菌是指将灭菌物品放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃的热空气中维持2～3 h。能耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等，可采用干热灭菌的方法灭菌。(2)与煮沸消毒法相比，巴氏消毒法或高温瞬时消毒法可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且使牛奶的营养物质损失较少。(3)接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30 min，紫外线能破坏微生物的DNA结构，从而杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以强化消毒效果。(4)自来水通常是用氯气进行消毒的。(5)在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是锅内原有的冷空气没有排尽。
答案：(1)可以　(2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少　(3)破坏DNA结构　消毒液　(4)氯气　(5)未将锅内冷空气排尽
———————————————————————————
微生物的纯培养与平板划线操作
————————————————————————————————————————
1．培养物、纯培养物、纯培养辨析
培养物
接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体
纯培养物
由单一个体繁殖所获得的微生物群体
纯培养
获得纯培养物的过程
2.平板划线操作的注意事项
(1)灼烧接种环，待其冷却后才能蘸取菌液，以免温度过高杀死菌种。
(2)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个微生物繁殖而来的菌落。
(3)划线时最后一区不要与第一区相连。
(4)划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
(5)操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要将接种环进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的如下表：
项目
第一次操作
每次划线之前
划线结束
目的
杀死接种环上原有的微生物
杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少
杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
[对点练习]
3．下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是(　 )
A．微生物培养基中并不都必须添加碳源或氮源
B．倒平板时，应将打开的培养皿皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
C．接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧
D．实验结束后，带菌的培养基必须经灭菌处理后才能倒掉
解析：选B　倒平板时，用左手拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基(约10～20 mL)倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，B错误。
4．鲸死亡后会沉入海底，俗称“鲸落”。“鲸落”后期会形成一个以厌氧菌和硫细菌等为主体的生态系统。厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，同时产生一些硫化氢等硫化物。硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物。
请回答相关问题：
(1)培养微生物的培养基中一般都会含有水、无机盐、氮源和碳源，培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是________。要培养硫细菌，培养基中的成分需要特殊配制，主要体现在_________________________________________，这种培养基可以用来专一性培养硫细菌，所以称为________培养基。
(2)在分离“鲸落”中的微生物时要制备固体培养基，在倒平板操作后，将平板倒置，这样做的目的是__________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)为了研究“鲸落”中含有微生物的情况，需将“鲸落”提取物加水稀释，然后将稀释水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，这种方法称为________________。下面所示的四种菌落分布情况中，不可能由该方法得到的是________。

(4)若想得到“鲸落”中某目标菌种，可用平板划线法进行纯化。若下图甲是接种培养后的菌落分布图，对应的平板划线操作示意图为________。图甲中的③更易获得单菌落，判断依据是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。

解析：(1)厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，属于异养微生物，故培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是含碳有机物(或脂肪)。硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物，即硫细菌为自养生物，所以培养硫细菌的培养基中碳源必须是含碳无机物(或碳酸盐)，同时加入硫化物。这种人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基为选择培养基。(2)在制备固体培养基过程中，倒平板操作后将平板倒置的目的是防止培养皿皿盖上凝结的水珠落入培养皿造成污染，同时防止培养基中的水分过快发挥。(3)使用涂布器涂布接种微生物的方法为稀释涂布平板法。稀释涂布平板法接种的微生物会在培养基上形成均匀分布的菌落，而平板划线法接种的微生物在划线的起始部分菌落连在一起生长，由图可知，A、B、C均形成了均匀分布的单个菌落，是通过稀释涂布平板法接种得到的，而D中菌落是连在一起生长的，是通过平板划线法接种得到的。(4)图甲对应的平板划线操作示意图是图丙。图甲中③经过多次划线，每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，最后一次划线结束时更易获得单菌落。
答案：(1)含碳有机物(或脂肪)　碳源必须是含碳无机物(或碳酸盐)，同时加入硫化物　选择　(2)防止培养皿皿盖上凝结的水珠落入培养皿造成污染；防止培养基中的水分过快挥发　(3)稀释涂布平板法　D　(4)丙　每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，最后一次划线结束时更容易获得单菌落
系统学习(二)　微生物的选择培养和计数(释疑点)
　　　　　　基础知识·全面掌握
(一)微生物的选择培养
1．选择培养基
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
2．稀释涂布平板法
将菌液进行一系列的梯度稀释后，将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基表面，进行培养。
(1)系列稀释操作。
系列稀释：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应离酒精灯火焰1～2 cm。操作过程如下：

(2)涂布平板操作。
步骤
图示
操作
1

取0.1 mL菌液，滴加到培养基表面
2

将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
3

将沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布
4

用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液涂布均匀
(3)培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。
(二)微生物的数量测定
1．稀释涂布平板法
计数原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
计数标准
为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数
计数方法
通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30～300、适于计数的平板。在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值
2.显微镜直接计数法
计数原理
利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
优点
是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法
缺点
统计的结果一般是死菌数和活菌数的总和
3.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

————————————■链教材资料·发展科学思维■————————————
1．(选择性必修3 P18“相关信息”挖掘)血细胞计数板和细菌计数板的主要区别是什么？
提示：前者常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数；后者可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
2．(选择性必修3 P19“探究·实践”思考)利用稀释涂布平板法纯化分解尿素的细菌时，经培养后发现培养基上出现多种菌落，可能的原因有哪些？
提示：出现杂菌污染的可能原因：培养基制备过程中被杂菌污染；接种过程中，无菌操作不符合要求；系列稀释时，无菌操作不符合要求等。
　　　　　　重难盲点·讲练疏通
———————————————————————————
微生物选择培养的原理和方法
————————————————————————————————————————
1．选择培养的原理：根据不同微生物的特殊营养需求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。
2．三种选择培养方法的比较
方法
特点
举例
利用营养缺陷型选择培养基
通过控制培养基的营养成分，使营养缺陷型微生物不能正常生长
缺乏氮源时可以分离固氮微生物
利用加入某种化学物质
在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质对微生物产生的影响，抑制某些微生物生长，同时选择所需的微生物
加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌
利用培养条件
改变微生物的培养条件
将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物
[对点练习]
1．精氨酸营养缺陷型谷氨酸棒状杆菌缺乏将鸟氨酸转化为精氨酸的酶，不能在缺少精氨酸的培养基上生长，但可作为鸟氨酸发酵的优良菌种。如图为野生型谷氨酸棒状杆菌经诱变获得精氨酸营养缺陷型谷氨酸棒状杆菌并进行筛选的过程示意图，过程②将紫外线照射处理的菌液接种在某培养基上。培养至菌落不再增加时，平板上的菌落如图甲所示。过程③向培养基中添加某种物质继续培养得到如图乙所示平板。下列叙述正确的是(　 )

A．紫外线照射可导致谷氨酸棒状杆菌发生基因突变或染色体变异
B．图乙中菌落B为精氨酸营养缺陷型谷氨酸棒状杆菌
C．过程③向培养基中添加的某种物质是谷氨酸
D．过程②所用培养基是一种鉴别培养基
解析：选B　谷氨酸棒状杆菌为原核生物，其细胞中不含染色体，因此不会发生染色体变异，A错误；与图甲平板相比，图乙平板上菌落多，说明过程③向培养基中添加的某种物质是精氨酸，新出现的菌落为精氨酸营养缺陷型谷氨酸棒状杆菌，B正确，C错误；过程②所用培养基缺少精氨酸，只有能产生精氨酸的微生物才能生存，因此该培养基是一种选择培养基，D错误。
2．下表为某公司研发的一种培养大肠杆菌的培养基配方：
成分
蛋白胨
乳糖
蔗糖
K2HPO4
显色剂(伊红-亚甲蓝)
琼脂
含量/g
10.0
5.0
5.0
2.0
0.2
12.0
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL

请结合所学知识分析，下列相关叙述不正确的是(　 )
A．根据用途划分，该培养基属于鉴别培养基
B．若要分离能分解尿素的细菌，需将蛋白胨换成尿素
C．若还需鉴定分解尿素的细菌，需将伊红亚甲蓝换成酚红
D．该培养基中蛋白胨只是提供了氮源
解析：选D　伊红亚甲蓝是鉴定大肠杆菌的试剂，根据用途划分，该培养基属于鉴别培养基，A正确；若要分离能分解尿素的细菌，应以尿素为唯一氮源，需要将蛋白胨换成尿素，B正确；鉴定分解尿素的细菌，需要使用酚红指示剂。若培养基中存在分解尿素的细菌，其菌落周围会出现红色环带，这是由于尿素被分解产生的氨使pH升高，指示剂产生颜色变化，从而证明这一菌株以尿素为氮源，C正确；该培养基中蛋白胨主要提供了碳源、氮源、维生素，D错误。

———————————————————————————
微生物计数的原理和方法
————————————————————————————————————————
1．平板划线法和稀释涂布平板法的比较
项目
平板划线法
稀释涂布平板法
关键操作
接种环在固体平板培养基表面连续划线
一系列的梯度稀释、涂布平板操作
菌体获得
在具有显著的菌落特征的区域中挑取单个的菌落
从适宜稀释度平板上的菌落中挑取单个的菌落
成功关键
(1)接种环的灼烧
①第一次划线前：杀死接种环上的微生物，避免污染培养物；②之后每次划线前：杀死上次划线后残留菌种，保证每次划线菌种来自上次划线末端；③划线结束后：杀死残留菌种，避免污染环境和感染操作者
(2)接种环灼烧之后，要冷却后再进行操作，以免温度太高杀死菌种
(3)划线时最后一次的划线不要与第一次的划线相连
(4)划线力度要适宜，避免将培养基划破
(1)稀释操作时：盛有9 mL无菌水的所有试管、移液管等均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离酒精灯火焰1～2 cm处
(2)涂布平板时
①涂布器用体积分数为70%的酒精消毒，取出时让多余酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃；②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精；③酒精灯与培养皿距离要合适，移液管管头不要接触任何物体
优点
可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落
既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
缺点
不能对微生物计数
操作复杂，需要涂布多个平板
2．两种微生物计数方法的比较
项目
间接计数法(稀释涂布平板法)
直接计数法(显微镜直接计数法)
原理
通过统计平板上的菌落数，推测出样品中大约含有多少活菌
在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量
公式
每毫升菌液中微生物细胞的数量＝×M
C：某稀释倍数下至少3个平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的菌液稀释液体积(mL)；
M：稀释倍数
每毫升原液所含细菌数＝每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
不能区分细胞死活
结果
比实际值偏小
比实际值偏大
[对点练习]
3．用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，对该实验有关叙述错误的是(　 )
A．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233
B．涂布了一个平板，统计的菌落数是230
C．设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度
D．统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，取其平均值作为该样品菌落数估计值
解析：选B　该实验中，至少要涂布3个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，求平均值，A、D正确；实验应设置对照实验和重复实验，排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度，B错误，C正确。
4．(2020·全国卷Ⅰ)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。

回答下列问题：
(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用____________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是________。甲、乙培养基均属于________培养基。
(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释________倍。
(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是______________________(答出1点即可)。
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：________________________________________________________________________。
(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即__________________________。
解析：(1)实验过程中，对盛有水或培养基的摇瓶进行灭菌时，常采用高压蒸汽灭菌法。据题图分析可知，乙培养基为固体培养基，与甲培养基相比，其特有的组分Y应是凝固剂琼脂。甲、乙培养基均只允许能利用物质S作为氮源和碳源的微生物生长，因此均为选择培养基。(2)据题意可知，假设至少将摇瓶M中的菌液稀释X倍，才能保证稀释后的100 μL菌液涂布的平板上长出的菌落数不超过200个，初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，则稀释之前100 μL菌液中有2×106个细菌，可得2×106×(1/X)＝200，则X＝104，因此至少应将摇瓶M中的菌液稀释104倍。(3)在筛选过程中，若培养基中S浓度过高，可能会导致细胞失水，进而抑制菌株的生长。(4)将含有能降解S的细菌的淤泥加入无菌水中，进行适当稀释后，利用稀释涂布平板法，取适量的菌液涂布到乙培养基上，在适宜条件下进行培养，一段时间后，统计菌落数，即可估算出淤泥中能降解S的细菌细胞数。(5)本实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌生长提供水、碳源、氮源和无机盐等营养物质。
答案：(1)高压蒸汽灭菌　琼脂　选择　(2)104　(3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长　(4)取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数　(5)水、碳源、氮源和无机盐

[课时验收评价]
1．下列关于微生物培养的说法，错误的是(　 )
A．倒平板时，培养基倒入培养皿后要立即倒置放置
B．实验中锥形瓶、培养皿常用干热灭菌法灭菌
C．用记号笔标记培养皿中菌落时应标记在皿底
D．纯化培养时，培养皿应倒置培养在恒温培养箱中
解析：选A　倒平板时，培养基倒入培养皿后需要等培养基凝固后，才能倒置放置，A错误。
2．(2022·湖北高考)灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是(　 )
A．动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行
B．微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染
C．为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌
D．可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌
解析：选D　动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行，A错误；动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染，保证无菌环境，而微生物的培养不能使用抗生素，B错误；一般用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，以防止杂菌污染，C错误；可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌，以防止杂菌污染，D正确。
3．平板划线法和稀释涂布平板法是常用的获取纯培养物的方法。下列相关叙述错误的是(　 )
A．两种纯化方法的核心都是要防止杂菌污染，保证培养物的纯度
B．用稀释涂布平板法进行微生物计数时，所得数据往往比实际值偏小
C．获取纯培养物的过程中，应根据微生物的种类调整培养基的pH
D．对10 mL土样样液稀释106倍后，取0.1 mL稀释液涂布，测得的菌落数分别为218、266、305，则该10 mL土样中目的菌数为2.63×1010个
解析：选D　用稀释涂布平板法统计微生物的数量时，一般选择菌落数在30～300的至少3个平板进行重复计数，求出平均值，D错误。
4．在分离、纯化大肠杆菌实验中，划线接种(甲)、培养结果(乙)如图。下列有关叙述错误的是(　 )

A．甲中a区域为划线的起始位置
B．接种前应对培养基进行高压蒸汽灭菌
C．连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落
D．接种过程中至少需要对接种环灼烧5次
解析：选A　每次划线的菌种来自上一区域的末端，因此划线的起始区域菌落最多。由图乙可知，图甲中的d区域菌落多，为划线的起始位置，A错误。
5．牛奶消毒及细菌检测实验的过程如图所示，下列相关叙述不正确的是(　 )

A．步骤①为巴氏消毒法，步骤②为系列梯度稀释，步骤③中的牛肉膏蛋白胨均可提供碳源、氮源
B．实验中对试管、培养皿的灭菌方法是干热灭菌，适用这种方法的是能耐高温且需要保持干燥的物品
C．实验中的培养基适宜的灭菌方法是高压蒸汽灭菌
D．实验中采用平板划线法计数，最可能导致实验结果偏低
解析：选D　平板划线法不能对微生物进行计数，D错误。
6．如图表示土壤中微生物为植物提供氮的过程，图中①②③分别代表相关物质，下列有关说法正确的是(　 )

A．①是N2、③是NH3，X代表的细菌异化作用类型是需氧型
B．①是NH3、②是NO，固氮菌在生态系统中属于消费者
C．②是NH3、③是NO，X代表的细菌以有机物作为碳源
D．在实验室培养固氮菌可用二氧化碳为碳源的无氮培养基
解析：选C　①是N2，②是NH3，③是NO，X代表土壤中的分解者，其异化作用方式可能是需氧型，以土壤中的有机物作为碳源，固氮菌在生态系统中属于消费者，A、B错误，C正确；在实验室培养固氮菌不能用二氧化碳为碳源的无氮培养基，D错误。
7．产脂肪酶的细菌可用于含油废水处理。科研人员用射线照射从土壤中分离的菌株，反复筛选后获得产酶能力提高的菌株，具体流程如图。下列相关叙述正确的是(　 )

A．步骤①取土壤样品溶于无菌水中制成菌悬液
B．步骤②的固体平板可以是以脂肪为唯一氮源的培养基
C．步骤②射线照射可引起细菌基因突变或染色体变异
D．步骤③透明圈越大的菌落，其脂肪酶活性一定越高
解析：选A　步骤①取土壤样品溶于无菌水中制成菌悬液，A正确；组成脂肪的化学元素有C、H、O，要筛选可以产生脂肪酶的细菌，需要用以脂肪作为唯一碳源的固体培养基，B错误；细菌是原核生物，没有成形的细胞核和染色体，不会发生染色体变异，C错误；透明圈大的菌落，酶活性不一定高，因此需要对初筛选的菌株进一步进行酶活性检测，D错误。
8．野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型菌株由于发生基因突变而无法合成某种氨基酸只能在完全培养基上生长，如图为纯化某氨基酸营养缺陷型突变株的部分流程图，数字代表培养基，a、b、c表示操作步骤。有关说法错误的是(　 )

A．①②④为完全培养基，③为基本培养基
B．a操作的目的是提高突变菌株的浓度
C．b操作可用涂布器蘸取菌液均匀的涂布在②表面
D．经c过程影印及培养后，可从④培养基中挑取D菌落进行纯化培养
解析：选C　结合题图信息分析可知，①②④为完全培养基，③为基本培养基，A正确；紫外线可用于诱导突变，提高突变的频率，故a操作的目的是提高突变菌株的浓度，B正确；b操作是先将菌液滴加到培养基表面，再用涂布器蘸取菌液均匀的涂布在②表面，C错误；由图可知，D菌落在基本培养基中无法生长，而在完全培养基上能够生长，这说明D菌落是氨基酸营养缺陷型菌株，故经c过程影印及培养后，可从④培养基中挑取D菌落进行纯化培养，D正确。
9．自生固氮菌是土壤中能独立固定空气中N2的细菌，将玉米种子用自生固氮菌拌种后播种，可显著提高产量并降低化肥的使用量。科研人员进行了土壤中自生固氮菌的分离和固氮能力测定的研究，部分实验流程如图1。回答下列问题：

(1)步骤①土样应取自当地表层土壤的原因是____________________________________；步骤②需充分振荡的主要目的是____________________________________。
(2)下表为两种培养基的配方，步骤④应选其中的________培养基，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
培养基类型
培养基组分
Ashby培养基
甘露醇(C6H14O6)、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl、K2SO4、CaCO3、蒸馏水、琼脂
LB培养基
蛋白胨、酵母提取物、NaCl、蒸馏水、琼脂
(3)步骤④所用的接种工具是__________，若在④的平板上统计的菌落平均数量为126个，则每克土壤中含有的固氮菌为____________个。
(4)将纯化的固氮菌置于完全培养液中扩大培养48小时，经离心后收集下层细胞并转移至特定培养基中进行固氮能力的测定，筛选出固氮能力最强的菌种CM12，为进一步鉴定其固氮能力，科研人员选用发芽一致的玉米种子进行3组盆栽实验，30天后测定土壤微生物有机氮含量，结果如图2。

注：CK为对照处理组；N为尿素处理组(每盆土壤中50 mL有氮全营养液，成分为在1 000 mL无氮植物营养液中加入0.12 g尿素)；CM12为自生固氮菌CM12处理组(每盆土壤浇50 mL接种自身固氮菌的无氮植物营养液)。
①对照组(CK)的处理为_____________________________________________________。
②实验结果表明：施用尿素处理和接种固氮菌CM12处理均能显著增加土壤微生物有机氮含量。与尿素处理组相比，CM12处理组土壤微生物有机氮含量增加了约__________%(保留1位小数)。
③自生固氮菌较共生固氮菌(如根瘤菌)的应用范围更广，原因是________________________________________________________________________。
解析：(1)步骤①土样应取自当地表层土壤的原因是在富含有机质的土壤表层，有更多的固氮菌生长；步骤②需充分振荡的主要目的是使土壤中的微生物充分释放到无菌水中。(2)由表格中培养基配方分析可知，步骤④应选其中的Ashby培养基，这是因为该培养基不含氮源具有选择作用，自生固氮菌可以利用空气中的氮气作为氮源，而LB培养基中的蛋白胨可以提供氮源，不具有选择作用。(3)由图1观察可知，步骤④平板中的菌落分布均匀，故所用的接种工具是涂布器，若在④的平板上统计的菌落的平均数量为126个，则每克土壤中含有的固氮菌为126÷0.1×104＝1.26×107(个)。(4)①设置对照组时需要排除无关变量对实验的影响，故对照组(CK)的处理为每盆土壤浇50 mL无氮植物营养液。②由柱形图分析可知，空白对照组中土壤微生物有机氮含量为10 mg·kg－1，尿素处理组的土壤微生物有机氮含量为12 mg·kg－1，而CM12处理组土壤微生物有机氮含量为22 mg·kg－1，故与尿素处理组相比，CM12处理组土壤微生物有机氮含量增加了(22－12)÷12×100%≈83.3%。③自生固氮菌较共生固氮菌(如根瘤菌)的应用范围更广，这是因为自生固氮菌能在土壤中独立固氮，不受宿主的限制。
答案：(1)在富含有机质的土壤表层，有更多的固氮菌生长　使土壤中的微生物充分释放到无菌水中　(2)Ashby　该培养基不含氮源具有选择作用，自生固氮菌可以利用空气中的氮气作为氮源，LB培养基中的蛋白胨可以提供氮源，不具有选择作用　(3)涂布器　1.26×107　(4)①每盆土壤浇50 mL无氮植物营养液　②83.3　③自生固氮菌能在土壤中独立固氮，不受宿主的限制