1.2微生物的培养技术及应用（2） 课件人教版高中生物选修三ppt

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第2课时 微生物的选择培养和计数本节聚焦怎样运用生物与环境相适应的观点来理解选择培养的原理？如何通过调整培养基的配方来有目的地培养某种微生物？测定微生物数量的常用方法有哪些？1.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。2.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。3.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。学习目标 自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很难实现。该怎么办呢？选择培养基应运而生。从社会中来提供合适的营养和环境条件科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶1973年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的水生栖热菌，并从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。美国黄石公园那么，如何从众多的微生物中筛选出单一菌种？筛选原因：水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。选择培养基一筛选原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。概念：分离酵母菌、霉菌等真菌分离固氮菌分离自养型微生物③不加碳源的培养基②不加氮源的培养基①加入青霉素的培养基 尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。讨论：1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？设计一种选择培养基,用尿素作为唯一氮源,可以将分解尿素的细菌分离出来选择培养基配方的设计选择培养基一2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分基本相同。这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。【♣典例1】据培养基的配方表，回答下列问题：培养基一培养基二1.从物理性质看，两种培养基属于哪类？依据是什么？2.从用途上来讲，哪个属于选择培养基？将得到何种细菌？可获得能分解尿素的细菌。3.两种培养基中共有哪些成分？碳源、氮源、水、无机盐培养基二的碳源为_______，氮源为_______。葡萄糖尿素都属于固体培养基。依据是添加了凝固剂——琼脂培养基二1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物计数：测定分解尿素的细菌的数量稀释涂布平板法——将菌液进行一系列梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养。稀释涂布平板法（二）微生物的选择培养注意：稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。1.样品梯度稀释铲取土样，将样品装入纸袋中 将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。90mL无菌水9mL无菌水稀释涂布平板法操作过程1ⅹ101ⅹ1071ⅹ1061ⅹ1031ⅹ1021ⅹ1041ⅹ1051mL1mL1mL1mL1mL③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。移液枪3.取样涂布平板：⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。各浓度分别涂布3个平板（重复实验）恒温培养箱细菌一般选用104、105、106 稀释倍数的菌液进行涂布培养。 待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板 ，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。3.菌落培养稀释涂布平板法操作过程倒置通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散将菌液进行一系列的等比稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落接种环涂布器从最后划线的区域挑取稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落分离纯化菌种，获得单菌落①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数①都能分离纯化菌种②都是在固体培养基上进行的平板划线法 vs 稀释涂布平板法1.稀释涂布平板法2.显微镜直接计数法微生物的数量测定要求:微生物的数量测定1.稀释涂布平板法缺点:统计的菌落数往往比活菌的实际数目 . 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。【原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。】①通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30-300、适于计数的平板。②同一稀释度至少对3个平板进行重复计数，然后求平均值；偏小计数原理：思考：如何从平板上的菌落数推测出每克（每ml）样品中的菌落数？微生物的数量测定1.稀释涂布平板法注：C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml) M代表稀释倍数每克（每ml）样品中的菌落数＝(C÷V)×M【例】某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得三个平板上菌落数分别为220、230、252，那么每克样品中的细菌数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）。 2.34×109【例1】两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。1.甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2.乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。血细胞计数板：细菌计数板：微生物的数量测定2.显微镜直接计数法（计数板计数法）常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数对细菌等较小的细胞进行观察和计数；缺点:统计的菌数往往比活菌的实际数目 .偏大【原因：不能区分死菌和活菌。】微生物的数量测定1.稀释涂布平板法注：C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml) M代表稀释倍数每克（每ml）样品中的菌落数＝(C÷V)×M稀释涂布平板法:统计的菌落数往往比活菌的实际数目偏小.显微镜直接计数法:统计的菌数往往比活菌的实际数目偏大.【原因：不能区分死菌和活菌。】1.提出问题土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？利用以“尿素作为唯一碳源”的选择培养基，可以分离。2.做出假设3.实验设计实验步骤实验原理绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌。选择培养基①提供无机盐②调节pH①培养基的制备制备选择培养基（尿素为唯一氮源）制备牛肉膏蛋白胨培养基对照作用.验证选择培养基是否起到筛选作用思考1.为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？4.进行实验①碳源②提供能量②土壤取样A 取样地：酸碱度接近中性的潮湿土壤中。B 取样：铲去表层土（一般3cm左右）。 细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。4.进行实验③样品的稀释与涂布平板测土壤细菌数：一般用104、105、106稀释液。测土壤酵母菌数：一般用102、103、104稀释液。 不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300、适于计数的平板。选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养④微生物的培养与观察4.进行实验培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。观察：每隔 统计一次菌落数目，选取 时的记录作为结果。防止 。结果：一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。因培养时间不足而导致菌落数目遗漏24h菌落数目稳定土壤中分解尿素的细菌的鉴定:在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。呈碱性，遇酚红指示剂呈红色。①液体培养基可以直接看液体的变色情况；②固体培养基上可以观察菌落周围是否出现红色环带。二、拓展应用1.反刍动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。提示：反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡。①用“尿素为唯一氮源”的选择培养基进行培养②创造无氧环境进行培养练习与应用2.已知刚果红是一种染料，它可以与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。（1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌,请你给出详细的实验方案。（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？（3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。用“纤维素为唯一碳源”的选择培养基进行培养，并在培养基加入刚果红进行鉴别。纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等这是人工设置适合纤维素分解菌生存的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。透明带直径与菌落直径比值越大，说明分解纤维素的能力越 .强