2024届苏教版高中生物一轮复习微生物的培养技术及应用课件

这是一份2024届苏教版高中生物一轮复习微生物的培养技术及应用课件，共60页。PPT课件主要包含了重温真题经典再现，限时强化练，微生物的基本培养技术，基础·精细梳理，疑难·精准突破，典例·精心深研，培养基的配制，纯净的培养物，防止杂菌污染，②灭菌方法及适用对象等内容，欢迎下载使用。
课标内容　(1)阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。(2)阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。(3)举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。(4)概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。(5)概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
微生物的选择培养和计数
考点一　微生物的基本培养技术
几种微生物的营养和能量来源
2.无菌技术(1)目的：获得______________。(2)关键：______________。(3)常见物品的消毒或灭菌方法①消毒方法及适用对象
3.微生物的纯培养酵母菌纯培养的操作步骤：
下图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析并回答下列问题：
(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是什么？_____________________________________________________________________________________________________________________________________。
获得图A效果的接种方法为稀释涂布平板法，获得图B效果的接种方法为平板划线法
(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)接种操作为什么一定要在火焰附近进行？__________________________。
最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌
火焰附近存在着无菌区域
(1)培养基要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。(2)要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。(3)倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。(4)平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
2.平板划线法操作步骤
(2)平板划线法操作中几次灼烧接种环的目的
1.(2022·南京三模)培养基是人们按照培养对象对营养物质的不同需求配制的营养基质。下列有关培养基的配制和使用的叙述，正确的是(　　)A.微生物培养基的组成成分必需含有碳源、氮源、水和无机盐B.用动、植物的体细胞进行细胞培养，均可用固体培养基C.接种前要了解固体培养基是否被污染可接种蒸馏水来培养检测D.使用过的微生物培养基应进行高压蒸汽灭菌处理后再丢弃
结合培养基的配制和无菌技术，考查科学思维
解析　微生物培养基不一定都含有碳源、氮源，如培养自养型微生物的培养基中不需加入碳源，分离自生固氮菌的培养基中不需加入氮源，A错误；动物的体细胞进行细胞培养用液体培养基，而植物的体细胞进行细胞培养用固体培养基，B错误；检测培养基是否被污染的方法是：将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生，C错误；使用过的微生物培养基应进行高压蒸汽灭菌处理后再丢弃，以防止杂菌污染环境，D正确。
2.(2023·河南名校联盟)“掌心对掌心，手心压手背，十指交叉摩，手握关节搓，拇指围轴转，指尖掌心揉，手腕别放过。”七步洗手法可以清除手部的污物和微生物，是预防新冠病毒感染的有效措施之一。某生物实验小组设计了“比较洗手前后手上细菌分布情况”的探究活动：各小组成员分别将拇指在甲组培养基上轻轻按一下，然后用肥皂将该手洗干净，再将洗净后的拇指在乙组培养基上轻轻按一下。将这两组培养基放入恒温培养箱中，在适宜温度下培养24小时后，统计两组培养基中菌落数目，请回答下列问题：
(1)该实验中用到的培养基中加入了牛肉膏、蛋白胨、NaCl和水，蛋白胨可以为微生物的生长提供________________等营养物质，为了使配制的溶液呈固体状态，还需要加入________。为了防止外来杂菌的入侵，可以将培养基放入盛有适量________的高压蒸汽灭菌锅内灭菌15～30 min。(2)实验中“将拇指在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养操作中的________，该操作应该在酒精灯火焰附近进行，原因是_____________________________________。
避免周围环境中的微生物污染培养基
(3)统计甲、乙两组培养皿中的菌落，乙组中菌落数比甲少得多，实验结果说明肥皂洗手不能彻底清除手上的微生物。为避免手上微生物在无菌操作中污染培养基，洗过的手还应进行_____________________________________________等方法处理(答出1种即可)。(4)有同学认为乙中也有菌落产生，是因为培养过程受到杂菌污染，请你在本实验的基础上设计一个简单的方案验证他的猜想是否正确，并预期结果和结论。________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
酒精棉球擦拭双手、戴消毒手套
再加一个不接种的相同培养基(空白培养基)，与甲、乙在相同条件下培养，若该培养基上没有生长菌落，说明培养过程未被杂菌污染，猜想错误；若该培养基上生长菌落，说明培养过程中被杂菌污染，猜想正确
结合微生物的纯培养，考查科学探究能力
3.(2023·江苏南京调研)下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法正确的是(　　)
A.步骤①后需将培养基灭菌并调节pHB.步骤①②③操作时需要在酒精灯火焰附近进行C.步骤③到④的过程中，接种环共灼烧处理了5次D.图中步骤①结束后需倒置平板，④结束后不需要
解析　步骤①表示倒平板，培养基需要先调节pH后灭菌，冷却后倒平板，A错误；接种环在每次接种前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，所以步骤③到步骤④的过程中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，步骤③到步骤④的过程中共需灼烧接种环6次，C错误；步骤④操作结束后需在培养皿的底上做好标记并倒置后放入培养箱中进行培养，D错误。
4.(2022·江苏百校大联考)获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。下列有关无菌技术的叙述，正确的是(　　)A.操作者的双手清洁后，用无水乙醇擦拭消毒B.巴氏消毒法处理的食品不含微生物，可长期保存C.平板划线接种微生物时须在酒精灯火焰旁操作D.培养基、培养皿等均须采用干热灭菌法灭菌
解析　操作者的双手清洁后，用体积分数为75%的酒精擦拭消毒，不能用无水乙醇进行消毒，这是因为过高浓度的酒精会在细菌表面形成一层保护膜，阻止其进入细菌体内，难以将细菌彻底杀死，达不到消毒的目的，A错误；巴氏消毒法处理的食品因微生物未被彻底杀死，仍会有部分较耐热的细菌或细菌芽孢存在，故不能长期保存，B错误；平板划线接种微生物时须在酒精灯火焰旁操作，以保证接种时处于无菌的环境，防止杂菌污染，C正确；培养皿等玻璃器皿可采用干热灭菌法灭菌，培养基需要用湿热(高压蒸汽)灭菌法灭菌，D错误。
考点二　微生物的选择培养和计数
常见选择培养基举例①缺少氮源的培养基可以筛选能利用大气中N2的微生物。②含青霉素的培养基可淘汰细菌，筛选出真菌。③无有机碳源的培养基可筛选出自养微生物。　　　
2.稀释涂布平板法(1)系列稀释操作取1 mL菌液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
3.微生物的数量测定(1)利用稀释涂布平板法计数①为了保证结果准确，一般选择菌落数为______________的平板计数，并且在同一稀释度下，应至少对____个平板进行重复计数，并求平均值。②统计结果往往比实际值____。(2)利用显微镜直接计数①需用细菌计数板或血细胞计数板。②统计结果一般是________________的总和。
4.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验操作(1)实验原理
(3)实验结果分析与评价
1.利用稀释涂布平板法进行微生物数量测定时，统计的菌落数往往比活菌的实际数目要少，这是因为_______________________________________________________________________________________。
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
2.传统酒曲含有多种有助于酿酒的微生物，某同学想研究一种传统酒曲中所含的微生物，进行了实验。将酒曲制成悬液稀释到一定的倍数，接种到以淀粉为唯一碳源的培养基上，培养一段时间后，观察透明圈的大小，并从最大的透明圈中央挑取菌落并保存。有人说，实验中形成的菌落并不只是能分解淀粉的菌落，你是否同意他的说法？请说明你的理由。提示　同意。分解淀粉的微生物将淀粉分解后形成的有机物，可供不能分解淀粉的微生物生活。
3.土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论。提示　将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。
结合微生物的选择培养，考查科学思维
1.(2022·盐城时杨中学模拟)利用纤维素解决能源问题的关键是获取高性能的纤维素酶。某科学研究小组将产生纤维素酶的菌株，通过诱变处理获得能产生高性能纤维素酶的新菌株，下列叙述错误的是(　　)
A.操作前用70%左右的乙醇对双手进行消毒处理B.图中1号培养基中所显示的接种和计数的方法是平板划线法C.用1号培养基培养的目的是获得单个菌落D.由于诱变后的菌株突变方向是不定向的，因此需要用2号培养基进行筛选
解析　操作前用70%左右的乙醇对双手进行消毒处理，以避免杂菌污染，A正确；分析题图可知，图中1号培养皿中所显示的接种方法是平板划线法，但平板划线法不能用于计数，应用稀释涂布平板法进行计数，B错误；由题图可知，图中1号培养皿中所显示的接种方法是平板划线法，平板划线法分离菌株的目的是获得单个菌落，C正确；基因突变具有不定向性，故诱变后的菌株突变方向是不定向的，所以2号培养基应是以纤维素为唯一碳源的选择培养基，可以筛选出能分解纤维素的菌株，D正确。
2.(2022·扬州中学期初)民间传统酒曲中含有大量的微生物，现进行下述实验分离酒曲中的主要微生物。
(1)实验一：将酒曲用________制成悬液后，分别取不同稀释度的酒曲悬液用______________接种法接种到培养基上，经培养后根据________________________________________(写出三种)等菌落特征以统计不同微生物的菌落数，发现酒曲中主要有两类微生物，即酵母菌和霉菌。研究者发现在液体中酵母菌比霉菌生长快；而酸性培养基中酵母菌比细菌生长更适宜。据此设计实验二将酵母菌从酒曲中进行分离。
菌落的形状、大小、隆起程度和颜色
(2)实验二：用小刀切开曲块，挖取米粒大小一块投入酸性蔗糖豆芽汁培养液中，然后置于25 ℃培养箱中培养两天。上述实验操作中，需要灭菌的物品或材料有_________________。培养两天后，可见培养液变浑浊，这是因为________________________________。
(3)实验三：取浑浊的培养液1 mL转接到另一瓶酸性蔗糖豆芽汁培养液中并培养，如此重复多次。多次转接后，取稀释液用右图所示方法接种在蔗糖豆芽汁平板上。
微生物进行繁殖，数量增加
①如图所示接种方法为____________，使用该接种方法的目的是____________________________________________________________________。②与酸性蔗糖豆芽汁培养液成分相比，蔗糖豆芽汁平板培养基成分中少了乳酸，请简要解释不再需要添加乳酸的原因是__________________________________；_____________________________________________________________________同时培养基中添加了琼脂，这种成分改变的原因是_____________________________________________________________________。
利用酵母菌在酸性液体培养基中的生长优势，通过多次转接，已筛选出酵母菌，因此不必再用酸性培养液
通过平板划线法分离酵母菌，此操作需要在固体培养基上进行
解析　(1)酒曲中含有大量的微生物，用无菌水制成悬液后，再稀释成不同梯度的菌液，再通过稀释涂布平板法接种到培养基上，经培养后根据菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等菌落特征以统计不同微生物的菌落数。(2)实验过程中所使用的小刀、培养液均需要经过灭菌，以防止杂菌污染；培养两天后，由于微生物繁殖，数量增加，导致培养液变浑浊。(3)①图中平板上是连续划线，所以使用的接种方法为平板划线法。该接种方法的目的是分离出单个菌落。②由于利用酵母菌在酸性液体培养基中的生长优势，通过多次转接，已筛选出酵母菌，因此不必再用酸性培养液；此时通过平板划线法要分离酵母菌，此操作要在固体培养基上进行，因此添加琼脂，与酸性蔗糖豆芽汁培养液成分相比，蔗糖豆芽汁平板培养基中少了乳酸，多了琼脂。
3.(2022·广东卷，21)研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对中国南海科考中，中国科学家采集了某海域1 146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。
回答下列问题：(1)研究者先制备富集培养基，然后采用_______________________法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28 ℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养，除了稀释涂布平板法，还可采用__________法。据图分析，拟杆菌新菌株在以________为碳源时生长状况最好。(2)研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是____________________________________________________________________________________________________________(答一点即可)。
湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)
某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存(或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活)　
(3)藻类细胞解体后的难降解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系统组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是______________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有________。
拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行
解析　(1)培养基通常采用湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)法进行灭菌。可以采用稀释涂布平板法或平板划线法，将单个微生物分散在固体培养基上，经过培养得到单菌落，从而获得纯种培养。分析题图可知，在以纤维素为碳源的培养基中，细胞数量最多，可推知拟杆菌新菌株在以纤维素为碳源时生长状况最好。(2)深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物质才能生存(或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活)，故将采集的样品置于各种培养基中培养，仍可能有很多微生物不能被分离筛选出来。(3)拟杆菌为异养生物，作为该生态系统的分解者，能将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行。(4)深海冷泉温度较低，故生活在其中的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，应具有耐低温的特性，才能高效降解多糖，保证拟杆菌的正常生命活动所需。
跳出题海　 两种纯化方法的比较
4.(多选)(2022·扬州考前调研B卷)根据食品安全国家标准(GB19645－2010)规定，每毫升合格的牛奶中细菌总数不超过50 000个。某兴趣小组利用恒温水浴锅对新鲜牛奶进行消毒后，进行细菌总数测定，主要步骤如下图所示。相关叙述正确的是( 　 　)
围绕微生物的分离和计数，考查科学思维和探究能力
A.步骤①中用巴氏消毒法对新鲜牛奶进行消毒，可以减少营养物质的损失B.步骤②对牛奶进行梯度稀释可以使聚集的微生物分散，便于在培养基表面形成单菌落C.步骤③中牛肉膏蛋白胨培养基要先高压蒸汽灭菌再调pH，以防止高温影响pH的稳定D.实验结束时培养基上的菌落可能不止一种，若平均菌落总数少于50个则表明消毒合格
解析　62～65 ℃30 min处理新鲜牛奶属于巴氏消毒法，可以杀死牛奶中的绝大多数微生物并且尽量减少食物中营养物质的损失，A正确；步骤②将牛奶进行梯度稀释的目的是使聚集在一起的微生物分散，便于能在培养基表面形成单个菌落，B正确；牛肉膏蛋白胨培养基配制时应先调pH再灭菌，C错误；由于生牛奶中的微生物可能不止一种，而牛肉膏蛋白胨培养基属于天然培养基，细菌、真菌等均可生长，因此，在实验中，培养基上可能不止出现一种菌落；依据样品液稀释1 000倍，接种液体积为1 mL，计算推测若平均菌落总数少于50个，则表明灭菌后牛奶中细菌总数不超过50 000个，灭菌合格，D正确。
5.(多选)(2022·苏州新区一中一模)如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的过程示意图，下列有关叙述错误的是(　　)
A.在配制步骤②③的培养基时，都应添加琼脂作凝固剂B.步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌分散，可以获得单细胞菌落C.步骤③采用稀释涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素D.步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，可通过溶液pH的变化大小来比较细菌分解尿素的能力
解析　②培养基是液体培养基，不需要添加琼脂，A错误；步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌通过稀释涂布平板法分散，获得单细胞菌落，B正确；步骤③筛选分解尿素的细菌，培养基中应以尿素为唯一氮源，不能加入牛肉膏蛋白胨(含有氮源)，C错误；步骤④鉴定细菌分解尿素的能力时，挑取③中不同种的菌落分别接种，分解尿素能力高的会产生更多NH3，溶液pH更高，所以可通过溶液pH的变化大小来比较细菌分解尿素的能力，D正确。
1.(2022·江苏卷，3)下列是某同学分离产脲酶菌的实验设计，不合理的是(　　)A.选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株B.在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源C.适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落D.可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌株
解析　农田或公园土壤中含尿素较多，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，所以可以利用这些地方的土壤作样品来分离产脲酶菌，A正确；产脲酶菌能分解利用尿素，其他菌不能，因此在利用选择培养基培养时需要以尿素作为唯一氮源，B正确；适当稀释样品可以降低菌的浓度，并有利于让粘连在一起的菌相互分离，易于在平板上涂布，形成单菌落，C正确；酚红是一种酸碱指示剂，由于尿素被脲酶分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，从而使酚红指示剂变红，D错误。
2.(多选)(2021·江苏卷，18)为提高一株石油降解菌的净化能力，将菌涂布于石油为唯一碳源的固体培养基上，以致死率为90%的辐照剂量诱变处理，下列叙述不合理的是(　　)A.将培养基分装于培养皿中后灭菌，可降低培养基污染的概率B.涂布用的菌浓度应控制在30～300个/mLC.需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，以确定最佳诱变时间D.挑取培养基上长出的较大单菌落，纯化后进行降解效率分析
解析　培养基应先灭菌再分装于培养皿中，A错误；涂布到平板上的菌落数在30～300个，涂布时菌液一般为0.1 mL，则涂布用的菌浓度应控制在300～3 000个/mL，B错误；需通过预实验考察辐射时间对存活率的影响，以确定最佳诱变时间，C正确；石油降解菌能分解石油获得碳源，形成菌落，挑取培养基上长出的较大单菌落，纯化后进行降解效率分析，以获得能高效降解石油的菌种，D正确。
3.(2020·江苏卷，19)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整B.图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落C.该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的D.菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
解析　倒平板后无需间歇晃动，A错误；图中Ⅰ区、Ⅱ区的细菌数量均太多，Ⅲ区的细菌数量较少，可从Ⅲ区挑取单菌落，B正确；Ⅲ区中存在单菌落，该实验结果能达到菌种纯化的目的，C错误；刚果红能与纤维素形成红色复合物，但不能和纤维素水解后的纤维二糖和葡萄糖形成红色复合物，因此菌落周围的纤维素被降解后，不能被刚果红染成红色，D错误。
4.(2019·江苏卷，12)下列关于微生物实验操作的叙述，错误的是(　　)A.培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌B.接种前后，接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧C.接种后的培养皿要倒置，以防培养污染D.菌种分离和菌落计数都可以使用固体培养基
解析　培养微生物的培养基一般用高压蒸汽灭菌法灭菌，微生物的接种工具，如接种针、接种环或其他金属用具一般通过酒精灯火焰灼烧来灭菌，A错误；接种前，接种环要在酒精灯火焰上进行灼烧，防止接种环上附着的微生物对实验结果造成干扰，接种后灼烧可以防止微生物扩散，对人造成危害，B正确；接种后的培养皿要倒置，防止冷凝水落入培养基造成污染，C正确；在固体培养基表面可形成单菌落，故菌种的分离和菌落的计数可以使用固体培养基，D正确。
5.(2021·山东等级考试，14)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成脂肪酸和甘油并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色。下列说法错误的是(　　)A.甲菌属于解脂菌B.实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源C.可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比D.该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
解析　根据题意，甲、乙两种菌分别接种在醇溶青琼脂平板上，二者都能生存，甲菌周围呈现深蓝色，说明培养基的脂肪被分解为脂肪酸，使醇溶青琼脂平板呈现深蓝色，脂肪的分解需要脂肪酶的催化，说明甲菌能够分泌脂肪酶，属于解脂菌，A正确；乙菌周围不变色，说明乙菌不能分泌脂肪酶分解脂肪，没有脂肪酸的产生，不能利用脂肪，但由于乙能在该培养基上生存，说明该培养基中除了脂肪作为碳源外，还存在别的碳源，否则乙不能在该培养基上生存，B错误；为了便于比较结果，可以将两种菌接种到同一平板的不同区域，C正确；菌落周围深蓝色的直径越大，说明解脂菌分泌脂肪酶的能力越强，D正确。
6.(2018·高考江苏卷，31)酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。如图所示为操作流程，请回答下列问题：
(1)配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的________，及时对培养基进行分装，并进行______________灭菌。(2)取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约________(在25 ℃、50 ℃或80 ℃中选择)的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。
(3)挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线。下列叙述合理的有________。a.为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌b.划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落c.挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量d.可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株
(4)步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和________供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1 000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血细胞计数板计数5个中方格中的细胞数，理论上________色细胞的个数应不少于________，才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。
解析　(1)配制培养基时，按照培养基配方准确称取各组分，之后溶解定容，再调节培养基的pH，一般情况下，采用高压蒸汽(湿热)灭菌法对培养基进行灭菌。(2)对培养基进行高压蒸汽灭菌后，需将温度降至50 ℃左右后倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。(3)在对酵母菌进行划线纯化时，为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌；且在划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落；本实验是为了获得能以工业废甲醇作为碳源的酵母，故在实验过程中可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株。(4)酵母菌是兼性厌氧型真菌，有氧条件下大量繁殖。酵母菌扩大培养时，需保证充足的营养和氧气供应。“用等体积台盼蓝染液染色”，即计数室中培养液体积实际只有0.1÷2＝0.05 mm3，设5个中方格中无色(活细胞不被台盼蓝染色)的细胞数目为x个，则3×109＝x/5×25×1 000×1 000÷0.05，解得x＝30。
考点一　微生物的基本培养技术1.(2023·江苏徐州调研)下列关于微生物培养的叙述，正确的是(　　)A.微生物在培养液中培养一段时间后用显微镜观察，可见到形成的菌落B.NH3可以作为硝化细菌的氮源和能源物质C.任何培养基都必须含有碳源、氮源、无机盐、水和琼脂D.某些细菌生长过程中需要额外补充营养物质，比如培养酵母菌时，要添加维生素
解析　微生物在固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落，A错误；硝化细菌可利用氧化NH3释放的能量合成有机物，B正确；培养基不一定都含有碳源、氮源，如培养自养微生物的培养基中不需加入碳源，分离自生固氮菌的培养基中，不需加入氮源，C错误；酵母菌不属于细菌，D错误。
2.(2022·南通大联考)微生物培养时常利用无菌技术避免杂菌的污染，相关叙述错误的是(　　)A.配制好的培养基应放入干热灭菌箱中进行干热灭菌B.实验中避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触C.接种前后的接种环都要在酒精灯火焰上进行灼烧D.实验结束后对实验室喷洒石炭酸同时配合紫外线照射
解析　对培养基灭菌的方法是高压蒸汽灭菌法，A错误；为避免杂菌污染，实验中应避免已灭菌处理的材料用具与周围物品接触，B正确；为了防止杂菌污染，每次接种前后，接种环都要进行灼烧灭菌，C正确；紫外线能破坏DNA结构，密闭空间内的空气常采用紫外线照射消毒，喷洒石炭酸同时配合紫外线照射可提高对密闭空间的消毒效果，D正确。
3.(2022·湖北卷，5)灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是(　　)A.动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行B.微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染C.为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌D.可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌
解析　动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行，A错误；动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染，保证无菌环境，而微生物的培养一般不能加入抗生素，B错误；一般用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，以防止杂菌污染，C错误；可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌，以防止杂菌污染，D正确。
考点二　微生物的选择培养和计数4.(2023·江苏盐城期中)餐厨垃圾中具有高效降解能力的微生物，可用于餐厨垃圾高效无害化处理。科研人员取一定量的餐厨样品，制备不同浓度的样品稀释液，并将样品接种于利用蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂配制的培养基表面进行培养并分离。下列分析正确的是(　　)A.牛肉膏主要为微生物提供氮源B.接种时需用力将菌种接种到培养基内C.稀释样品获得单个菌落以便判断菌种类型D.经过培养可筛选出有高效降解能力的微生物
解析　牛肉膏主要为微生物提供碳源、磷酸盐和维生素等，A错误；在培养基接种菌种时，应将菌种接入培养基表面，有利于其生长，如果用力接种会划破培养基，从而会影响菌株的生长，不能形成正常的特征形态，影响对菌落形态的观察及特征鉴别，B错误；该培养基为基本培养基，不能筛选出有高效降解能力的微生物，经过培养、筛选后还需要进行鉴定，才能选出有高效降解能力的微生物，D错误。
5.(2022·南通如皋适应性考试)为了检测冰激凌中的大肠杆菌含量是否超标。下列有关做法正确的是(　　)A.配制培养基，高压蒸汽灭菌后，调节pH到弱碱性B.将冰激凌溶化后，进行梯度稀释，再用平板划线法进行接种C.置于37 ℃恒温箱中培养12 h，统计培养基中长出来的菌落数D.该实验应设置未接种样品的空白对照，以检测培养基是否被污染解析　配制培养基时，应该先调节pH，A错误；平板划线法不能计数，所以要检测冰激凌中大肠杆菌是否超标，应该用稀释涂布平板法接种，B错误；应将培养基置于37 ℃恒温箱下培养24 h，C错误；为了检测培养基是否被污染，应该设置对照组，D正确。
6.(2022·江苏海门中学期末)野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基上生长，下图为纯化某氨基酸营养缺陷型突变株的部分流程图，①②③④代表培养基，A、B、C表示操作步骤，D、E为菌落。下列叙述错误的是(　　)
A.图中①②④为完全培养基，③为基本培养基B.A操作的目的是提高突变率，增加突变株的数量C.B的正确操作是用涂布器蘸取菌液后均匀地涂布在②表面D.经C过程原位影印及培养后，可从④中挑取D进行纯化培养
解析　野生型大肠杆菌菌株能在基本培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基上生长，根据题干信息和图形分析，图中①②④为完全培养基，③为基本培养基，A正确；紫外线可以提高突变的频率，A操作的目的是提高突变菌株的浓度，B正确；B操作是将菌液滴加到培养基表面，再用涂布器将菌液均匀的涂布在②表面，C错误；从图中可看出，D在基本培养基中无法生长，在完全培养基中可生长，说明D是氨基酸营养缺陷型突变株，故经C过程原位影印及培养后，可从④培养基中挑取D菌落进行纯化培养，D正确。
7.(多选)(2022·江苏如皋期末)研究人员从变质豆浆中分离腐败细菌，过程如下：取少量变质的豆浆在无菌条件下接种到培养基X上，一天后长出了S1、S2和S3三种菌落。下列说法正确的是(　　)A.所用培养基中的碳源为无机碳源，并需添加琼脂B.三种菌落的不同体现在颜色、形态、大小等方面C.接种前需将豆浆进行高压蒸汽灭菌，防止杂菌污染D.洗手后再用70%的酒精棉球擦拭双手，方可进行无菌操作
解析　腐败细菌为异养生物，所用培养基中的碳源为有机碳源，菌落是在固体培养基上获得的子细胞群体，因此需要在培养基中添加琼脂，A错误；腐败细菌在培养基X上长出三种菌落，菌落的不同主要体现在颜色、形态、大小等方面，B正确；需要从变质豆浆中分离腐败细菌，接种前不能将豆浆进行高压蒸汽灭菌，C错误；洗手后再用70%的酒精棉球擦拭双手进行消毒，方可进行无菌操作，D正确。
8.(多选)(2022·南通四模)酿造酒生产中会产生一种潜在致癌物——氨基甲酸乙酯(EC)，EC可被酸性脲酶分解。研究人员开展筛选高产酸性脲酶菌的实验，下表是该实验使用的两种选择培养基配方，其中尿素在高温下易分解，溴甲酚紫变色范围pH：5.2(浅黄)～6.8(紫红)，酚红变色范围pH：6.8(黄)～8.4(红)。下列相关叙述正确的是(　 　)
A.培养基在121 ℃下湿热灭菌15～30 min，过滤除菌的尿素溶液要在灭菌后加入B.培养基加少量牛肉膏、蛋白胨、酵母膏和葡萄糖的目的是补充碳源和氮源C.分离菌种的主要步骤：接种污泥→富集培养→稀释涂布法初筛→划线法纯化→鉴定D.目的菌落周围在酸性培养基上应呈紫红色，且在中性培养基上呈红色
解析　微生物灭菌时需要在固体培养基加上封口膜后在121 ℃条件下灭菌15～30 min，冷却后再通过玻璃漏斗加入过滤的尿素溶液，尿素在高温下易分解，不能在灭菌前加入，A正确；微生物培养的培养基中应加入水、碳源(提供碳元素的物质)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐，故可在培养基加少量牛肉膏、蛋白胨、酵母膏和葡萄糖，B正确；分离菌种的主要步骤：接种污泥(取样)→富集培养→稀释涂布法初筛→划线法纯化(筛选菌株)→鉴定，C正确；分析题意可知，目的菌可使培养基中EC被酸性脲酶分解，使培养基中pH增大，若使溴甲酚紫在酸性培养基中由浅黄色变为紫红色，则不会使培养基pH大于6.8，此pH条件下酚红在中性培养基中呈黄色，D错误。
9.(多选)(2022·无锡期末)E－Test法是一种用于确定抗菌药物最小抑菌浓度(MIC)的定量检测方法。其原理为将载有抗生素连续梯度浓度的塑料条(E－Test条)置于已接种待测菌液的琼脂平板上，从抑菌圈与E－Test条交界处可读出MIC值。下图是六种抗生素(①～⑥)对某细菌抑菌情况的测定结果，每个E－Test条上抗生素浓度范围均为0.016～256 μg/mL。下列相关叙述正确的是(　　)
A.检测时，将待测菌液采用稀释涂布平板法接种于琼脂平板培养基上B.该菌株对不同抗生素的敏感性大小为②>③>⑥>⑤>④>①C.部分抑菌圈内出现零散细小的菌落，可能是菌株出现了抗药性突变D.该菌株对抗生素④的MIC值应取1.0 μg/mL和256 μg/mL的中间数值
解析　检测时，将待测菌液采用稀释涂布平板法接种于琼脂平板培养基上，能够保证平板上各个区域的菌落数基本相当，A正确；该菌株对不同抗生素的敏感性不同，抑菌圈越大，说明该菌株对此种抗生素的敏感性越大，故其敏感性大小为①>④>⑤>⑥>③>②，B错误；部分抑菌圈内出现零散细小的菌落，说明这些菌落对该抗生素具有抗性，可能是菌株出现了抗药性突变，C正确；从结果可以看出，抗生素浓度在1.0 μg/mL时，几乎看不到抑菌圈，但抗生素浓度在256 μg/mL时，可以看到明显的抑菌圈，MIC值是指抗菌药物的最小抑菌浓度，故该菌株对抗生素④的MIC值应取接近于1.0 μg/mL的数值，D错误。
10.(2023·湖南长沙调研)某生物活动小组为探究当地农田土壤中分解尿素的细菌的数量，进行了随机取样、系列梯度稀释、涂布平板、培养、计数等步骤，实验操作过程如下：
请分析并回答下列问题：(1)该实验中含有琼脂的培养基从物理性质来说，属于________培养基，培养基中只选择了________作为唯一氮源。
(2)分解尿素的细菌能产生________酶，将尿素分解为____________。(3)在采用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，需要进行梯度稀释的原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ 。(4)实验结果：6号试管涂布的三个平板的菌落数为550、501、688，7号试管涂布的三个平板的菌落数为58、73、97，8号试管涂布的三个平板的菌落数为8、15、28。该10 g土壤样品中含有分解尿素的细菌的估算数目是_________个。
只有在稀释度足够高时，聚集在一起的微生物才被分散成单个细胞，并形成单个菌落；但稀释度过高时，得到的平板菌落数太少，实验的偶然性太大。进行梯度稀释时，取菌落数为30～300个的平板进行计数，所得的实验结果最准确(合理即可)
解析　(1)琼脂可作为凝固剂，故从物理性质来说，含琼脂的培养基属于固体培养基。筛选分解尿素的细菌的选择培养基应以尿素为唯一氮源。(2)分解尿素的细菌产生的脲酶能将尿素分解为NH3和CO2。(3)在采用稀释涂布平板法对微生物进行计数时，只有在稀释度足够高时，聚集在一起的微生物才被分散成单个细胞，并形成单个菌落；但稀释度过高时，得到的平板菌落数太少，实验的偶然性太大，所以需进行梯度稀释，取菌落数为30～300个的平板进行计数，实验结果最准确。(4)由于平板计数的适宜值在30～300之间，所以应选择7号试管涂布的平板进行计数，其平均菌落数为(58＋73＋97)/3＝76个，据图可知，10 g土壤样品经梯度稀释至7号试管，稀释度为108倍，而不是107倍，因为在锥形瓶处已经稀释10倍，所以利用公式计算每克土壤样品中的菌落数：(C÷V)×M＝(76÷0.1)×108＝7.6×1010个，但要特别注意，此时求出的是1 g土壤中的微生物数量，所以该10 g土壤样品中含有分解尿素的细菌的数目是7.6×1010×10＝7.6×1011个。
11.(2022·全国甲卷，37)某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。实验所用的培养基成分如下：
培养基Ⅰ：K2HPO4、MgSO4、NH4NO3、石油。培养基Ⅱ：K2HPO4、MgSO4、石油。操作步骤：①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；②液体培养基Ⅰ、Ⅱ中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。
(1)实验所用培养基中作为碳源的成分是__________。培养基中NH4NO3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成___________________(答出2种即可)等生物大分子。
DNA、RNA、蛋白质
(2)步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是__________。(3)为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示(“＋”表示有透明圈，“＋”越多表示透明圈越大，“－”表示无透明圈)，推测该同学的实验思路是______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 。
在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力　
(4)现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是__________，理由是_______________________________________________________________________________。
A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长
解析　(1)培养基的成分有碳源、氮源、无机盐和水等，从组成培养基的物质所含化学元素可知，作为碳源的成分是石油。生物大分子DNA、RNA、蛋白质都含有N元素，故氮源在菌体内可以参与合成这些物质。(2)由题意“资源和空间不受限制”可知，细菌数量的增长呈“J”形曲线，细菌每繁殖一代就是上一代的2倍，根据公式Nt＝N0·λt，λ＝2，繁殖n代后细菌的数量是N0·2n。(3)分析表格数据可知，实验的结果是：在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能力高于B菌株；在平板Ⅱ上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，根据实验的单一变量和对照原则，推测该同学的思路是：在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，