[高中生物一轮复习教学讲义  选修3]

第27讲 基因工程

考点一  基因工程的3种基本工具

1．基因工程的概念：指按照人类的意愿，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物新的遗传特性，从而创造出更符合人类需要的新的生物类型和生物产品。(外源基因在受体表达的原因三点：DNA结构相同；中心法则；密码子)

2．限制性核酸内切酶(限制酶)——“分子手术刀”

(1)来源及化学本质：主要是从原核生物中分离纯化出来的，化学本质是蛋白质。(原核生物中的限制酶：没有切割为点或者有切割位点但是被保护起来了 甲基化)

(2)功能：催化DNA中特定的磷酸二酯键断裂。

(3)作用特点：特异性，即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列，切割特定的位点。(回文序列)

(4)结果：产生黏性末端或平末端。(如图所示)。(命名：生物属名的头一个字母与种名的头两个字母什么型菌的第几个限制酶)

3．DNA连接酶——“分子缝合针”

(1)种类：E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。

(2)作用：将双链DNA片段缝合起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸间的磷酸二酯键。E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端；T4DNA连接酶能连接黏性末端和平末端

4．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

(1)类型

(2)具备条件：①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制；②有一个至多个限制酶的切割位点，以便于与外源基因连接；③具有标记基因，用于重组DNA的检测和鉴定；

(3)特点：可以在细胞中进行自我复制或整合到染色体DNA上随染色体DNA进行同步复制。

①所有的运载体都具有容易侵入受体细胞的特点，并且能够复制。

②天然质粒必须经过人工改造后才能作为载体。

③基因工程中的载体与细胞膜上参与物质运输的载体不同。基因工程中的载体通常是质粒，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等，其本质是DNA，能将目的基因导入受体细胞内；细胞膜上的载体是蛋白质，与细胞膜的功能有关。

5．限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等相关酶的分析比较

考点二  基因工程的操作流程

1．目的基因的获取

(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因(与生物抗逆性相关、与优良品质相关、与生物药物和保健品相关、与毒物降解相关)，也可以是具有调控作用的因子。

(2)获取方法：直接分离，从自然界中已有的物种中分离出来，如从基因文库中获取目的基因。

人工合成目的基因：常用的方法有化学合成法、反转录法、PCR扩增法。

①化学合成法：已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。

②反转录法：从供体细胞中分离出mRNA单链DNA合成目的基因。

(3)利用PCR技术扩增

PCR的反应过程及结果

2．基因表达载体的构建——基因工程的核心

3．将目的基因导入受体细胞

(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达其遗传特性的过程。

(2)常用的转化方法及其过程

①将目的基因导入植物细胞

4．目的基因的检测与鉴定

5．基因工程的应用

(1)植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力（如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等），以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。

(2)动物基因工程用于提高动物生长速度、改善畜产品的品质、用转基因动物生产药物、用转基因动物作器官移植的供体。

科学家将药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，通过显微注射等方法，导入哺乳动物的受精卵中，然后，将受精卵送入母体内，使其生长发育成转基因动物。转基因动物进入泌乳期后，可以通过分泌的乳汁来生产所需要的药品，因而称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。目前，科学家已在牛和山羊等动物乳腺生物反应器中表达出了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和α-抗胰蛋白酶等重要医药产品。

(3)基因工程药物：构建转基因工程菌，通过发酵获得。（胰岛素、干扰素）

(4)基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥作用。（并非全身细胞，而只是某些功能细胞中）

6．蛋白质工程

(1)概念：蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。

(2)蛋白质工程的基本途径：预期的蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找出相对应的脱氧核苷酸序列(基因)。

1．图1表示含有目的基因D的DNA片段长度(bp即碱基对)和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp Ⅰ、BamH Ⅰ、Mbo Ⅰ、Sma Ⅰ4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题。

(1)图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由__________连接。

(2)若用限制酶Sma Ⅰ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是________末端，其产物长度为__________________________________。

(3)若图1中虚线方框内的碱基对被T—A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子中分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶Sma Ⅰ完全切割，产物中共有________种不同长度的DNA片段。

(4)若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是____________。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加________________的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是______________。

[答案](1)脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖

(2)平　537 bp、790 bp、661 bp

(3)4

(4)BamH Ⅰ　抗生素B　同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接

[解析](1)题干中强调“一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基”，可通过画出DNA结构示意图解决。(2)Sma Ⅰ识别并切割的序列为CCC↓GGG，所以产生的末端为平末端，经Sma Ⅰ切割后，DNA片段会形成三个小的DNA片段，按切割位点算分别是：534＋3＝537(bp)；796－3－3＝790(bp)；658＋3＝661(bp)。(3)用Sma Ⅰ切割基因D，会形成537 bp、790bp、661 bp三种类型。题图1中虚线方框内C—G被T—A替换，失去了一个酶切位点，则会被切割成534＋796－3＝1 327(bp)和658＋3＝661(bp)两种类型。所以一共会得到537 bp、790 bp、1 327 bp、661 bp 4种类型的片段。(4)根据基因D和质粒的核苷酸序列可知，可选用BamH Ⅰ和Mbo Ⅰ进行切割，但Mbo Ⅰ会破坏掉两种抗生素抗性基因，因此只能用BamH Ⅰ进行切割。

2．下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：

(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于________态的大肠杆菌。

(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中________。

(3)若BamH Ⅰ酶切的DNA末端与Bcl Ⅰ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为________，对于该部位，这两种酶________(填“都能”、“都不能”或“只有一种能”)切开。

(4)若用Sau3A Ⅰ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。

[答案](1)Bcl Ⅰ和Hind Ⅲ　DNA连接　感受

(2)四环素　引物甲和引物丙

(3)　都不能　(4)7

[解析](1)选择的限制酶应在目的基因两端且在质粒中存在识别位点，故可以用来切割的限制酶为Bcl Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ，但由于BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ可能使质粒中的启动子丢失或破坏抗性基因，所以应选用Bcl Ⅰ、Hind Ⅲ两种限制酶切割。酶切后的载体和目的基因片段，通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入感受态的大肠杆菌中，使其增殖。(2)根据质粒上抗性基因，为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素。平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物需要与单链两端相应互补序列结合，故所用引物组成是图2中的引物甲和引物丙。(3)若BamH Ⅰ酶切的DNA末端和Bcl Ⅰ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为，由于两种酶均不能识别该部位的碱基对序列，所用两种酶都不能切开该部位。(4)根据Bcl Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ的酶切位点，Sau3A Ⅰ在质粒上有三个酶切位点，完全酶切可得到记为A、B、C三种片段，若部分位点被切开，可得到AB、AC、BC、ABC四种片段，所以用Sau3A Ⅰ切质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。

3．B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞(2n)和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。

据图回答：

(1)B基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中________(单选)。

A．含B基因的染色体缺失

B．DNA聚合酶失活

C．B基因发生基因突变

D．B基因的启动子无法启动转录

(2)从水稻体细胞或________中提取总RNA，构建________文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因(表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光)连接成融合基因(表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能)，然后构建重组表达载体。

(3)在过程①、②转化筛选时，过程________中T－DNA整合到受体细胞染色体DNA上，过程________在培养基中应加入卡那霉素。

(4)获得转基因植株过程中，以下鉴定筛选方式正确的是________(多选)。

A．将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交

B．以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交

C．以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交

D．检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光

(5)从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明______________________________________________。

[答案](1)D　(2)精子　cDNA　(3)②　①　(4)BCD　(5)B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚

[解析](1)启动子是一段有特殊结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA。B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录，推测最可能的原因是卵细胞中B基因的启动子无法启动转录，D符合题意。(2)B基因在体细胞和精子中正常表达，说明在水稻的体细胞和精子中有B基因转录而来的mRNA。从水稻体细胞或精子中提取总RNA，反转录产生多种互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群体就叫做水稻的cDNA文库。(3)过程①是指含有目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌，过程②是指将含有重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上。为了检测含有目的基因的重组Ti质粒是否转入农杆菌，过程①需在培养基中加入卡那霉素。(4)DNA分子杂交是将转基因生物的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，将探针与基因组DNA杂交，看是否出现杂交带。将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交，不能用于筛选含目的基因的转基因植株，A错误；B－Luc融合基因中含有水稻B基因编码蛋白的序列和Luc基因，因此，以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交可达到实验目的，B正确；转基因植株卵细胞中的B基因能够转录出mRNA，因此以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交可达到实验目的，C正确；Luc基因表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光，因此检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光，可以达到实验目的，D正确。(5)一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，而在转基因植株中能发现由未受精的卵细胞发育形成的胚，说明B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚。

4．科学家将人的生长激素基因与pBR322质粒进行重组，得到的重组质粒导入牛的受精卵，使其发育为转基因牛，再通过细胞工程培育为转基因克隆牛。pBR322质粒含有两个抗生素抗性基因和5个限制酶切点(如图2)。将重组质粒导入大肠杆菌，并成功地在大肠杆菌中得以表达。请据图回答问题：

(1)图1中显示的人的生长激素基因是通过人工合成的，图中①过程需要的酶是________；与②过程比较，①过程所特有的碱基配对方式是________(用字母和箭头表示)。

(2)图1中的mRNA是从人体的________细胞中获取。

(3)重组质粒形成与否需要鉴定和筛选，方法是将重组质粒的DNA分子导入大肠杆菌，通过含抗生素的培养基进行培养，观察大肠杆菌的生长、繁殖情况进行判断，如图3所示：

①如果受体菌在培养基A上能生长、繁殖形成菌落，而不能在培养基B上生长、繁殖，则使用限制酶a的切点是图2中的____________，即目的基因插入了____________中。

②如果受体菌在培养基A上不能生长、繁殖形成菌落，而在培养基B上能生长、繁殖，则使用限制酶a的切点是图2中的________，即目的基因插入了________中。

③如果受体菌在培养基A和培养基B上都能生长、繁殖形成菌落，则使用限制酶a的切点是图2中的________。

[答案](1)逆转录酶　U→A　(2)垂体　(3)①切点3或切点4或切点5　抗四环素基因　②切点1　抗氨苄青霉素基因　③切点2

[解析](1)根据图1分析，目的基因是通过mRNA逆转录形成的，需要逆转录酶的催化。RNA中的碱基是A、U、C、G，DNA中的碱基是A、T、C、G，所以①过程中碱基配对方式是A→T、U→A、G→C、C→G。与②过程比较，①过程所特有的碱基配对方式是U→A。(2)根据题意，人的生长激素基因是目的基因，该基因表达产物由垂体细胞分泌，所以需要从垂体细胞中提取相应的mRNA。(3)①根据题意，受体菌能在含氨苄青霉素的培养基上生存，不能在含四环素的培养基上生存，所以限制酶切点位于四环素基因内部，由图可知，是切点3或切点4或切点5。②根据题意，受体菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生存，能在含四环素的培养基上生存，所以限制酶切点位于抗氨苄青霉素基因内部，由图可知，是切点1。③根据题意，受体菌在含氨苄青霉素和四环素的培养基上都能生存，所以限制酶切点不会位于抗氨苄青霉素基因及抗四环素基因内部，由图可知，是切点2。

5．随着现代科技的发展，基因工程获得了广泛应用，请回答下列问题：

(1)从基因文库中提取的目的基因需要通过PCR技术进行扩增，利用PCR技术扩增目的基因的原理是________________。PCR技术扩增目的基因的过程：变性→________________，该过程中需使用一种特殊的酶是____________________。

(2)构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代；同时，_________________________________________________。

(3)若将目的基因转入大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是_____________________________________________________________________。

(4)我国科学家已培育出转基因抗虫棉，但由于抗虫基因插入宿主基因组的部位往往是随机的，有时候会出现一些意想不到的结果，因此，需检测抗虫棉的抗虫特性，可通过____________________(方法)在分子水平上进行检测，有时还需要进行个体生物学水平的检测，在个体水平的检测鉴定过程可简述为_____________________________________________________________________________________________________________。

[答案](1)DNA分子的复制　复性(或引物结合到互补DNA链)→延伸　热稳定的DNA聚合酶(或Taq酶)

(2)使目的基因能够表达和发挥作用

(3)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力弱

(4)抗原—抗体杂交　让害虫吞食转基因抗虫棉的叶片，观察害虫的存活情况，以确定抗虫棉是否具有抗虫性状

[解析](1)利用PCR技术扩增目的基因的原理是DNA分子的复制；PCR技术扩增目的基因的过程是：变性→复性→延伸，该过程中需要热稳定的DNA聚合酶(或Taq酶)。(2)构建基因表达载体的目的：一是使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代，二是有利于目的基因的表达和发挥作用。(3)感受态的大肠杆菌能吸收周围环境中的DNA分子。(4)抗虫特性的检测，在分子水平上可通过抗原—抗体杂交方法进行检测；在个体水平上，可让害虫吞食转基因抗虫棉的叶片，观察害虫的存活情况，以确定抗虫棉是否具有抗虫性状。

6．中国女科学家屠呦呦获2015年诺贝尔生理学或医学奖，她研制的抗疟药青蒿素挽救了数百万人的生命。研究人员已经弄清了青蒿细胞中青蒿素的合成途径(如图中实线方框内所示)，并且发现酵母细胞也能够产生合成青蒿酸的中间产物FPP(如图中虚线方框内所示)。

(1)根据图示代谢过程，科学家在培育能产生青蒿素的酵母细胞过程中，需要向酵母细胞中导入________基因。此过程构建的基因表达载体应该含有________识别和结合的部位，以驱动目的基因的转录，该部位称为启动子。

(2)实验发现，酵母菌细胞导入相关基因后，这些基因能正常表达，但酵母菌合成的青蒿素仍很少，根据图解分析原因可能是FPP还用于合成________，为提高酵母菌合成的青蒿素的产量，可通过________工程降低________酶的活性。

(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是：从预期蛋白质功能出发→设计预期的________→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的________序列。要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过改造________来完成。

[答案](1)ADS酶　RNA聚合酶　(2)固醇　蛋白质　ERG9　(3)蛋白质结构　脱氧核苷酸　基因

[解析](1)由图可知，酵母细胞能合成FPP合成酶，但不能合成ADS酶，即酵母细胞缺乏ADS酶基因。因此，需要向酵母细胞中导入ADS酶基因。启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点。(2)据虚线方框所示，合成青蒿素的中间产物FPP在酵母细胞内通过ERG9酶还可以转变为固醇，因此酵母菌合成的青蒿素仍很少。设计具有新的生物学功能或特性的蛋白质需要通过蛋白质工程；可通过蛋白质工程降低酵母细胞内ERG9酶的活性。(3)蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相应的脱氧核苷酸序列。对蛋白质的结构进行设计改造，最终必须通过对基因的修饰和合成来完成。

7

．如图为三种质粒和一个含目的基因的DNA片段，其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因，EcoR Ⅰ(0.7 kb)、Pvu Ⅰ(0.8 kb)等为限制酶及其切割位点与复制原点之间的距离。已知1 kb＝1 000个碱基对，请回答下列问题：

(1)片段D为目的基因中的某一片段，则DNA聚合酶和DNA连接酶的作用部位依次是________(填数字)。

(2)图中能作为目的基因运载体最理想的质粒是________(填“A”“B”或“C”)，请据图分析，其他两种质粒一般不能作为运载体的理由分别是____________、____________。

(3)用EcoR Ⅰ完全酶切目的基因和质粒B形成的重组质粒，并进行电泳观察，可出现长度分别为1.1 kb和________kb的两个片段，或者长度分别为________kb的两个片段。(重组质粒上目的基因的插入位点与EcoR Ⅰ的识别位点之间的碱基对忽略不计)

(4)将分别用限制酶Pvu Ⅰ切开的质粒B溶液与目的基因溶液混合，加入DNA连接酶连接后，进行大肠杆菌受体细胞导入操作，之后，受体细胞的类型(对抗生素表现出抗性R或敏感性S，蓝白代表菌落颜色)包含________(多选)。

A．ApR、蓝色　　　　B．ApR、白色       C．ApS、蓝色        D．ApS、白色

(5)动物基因工程通常以受精卵作为受体细胞的根本原因是________。

A．受精卵能使目的基因高效表达

B．受精卵可发育成动物个体

C．受精卵基因组更易接受DNA的插入

D．受精卵体积较大，便于DNA导入操作

[答案](1)②、②　(2)B　质粒A缺少标记基因　质粒C在用和目的基因相同的限制酶切割时，复制原点会被破坏　(3)5.6　3.1和3.6(或3.6和3.1)　(4)A、B、D　(5)B

[解析](1)DNA聚合酶和DNA连接酶的作用部位均为磷酸二酯键，即图中部位②。(2)图中质粒A缺少标记基因；质粒C在用和目的基因相同的限制酶Pvu Ⅰ切割时，复制原点会被限制酶Pvu Ⅰ切割，会影响重组质粒的自主复制。因此，能作为目的基因运载体最理想的质粒是B。(3)根据题意，质粒长度为2.7 kb，目的基因长度为4.0 kb，所以重组质粒长度为6.7 kb，出现长度为1.1 kb的一个片段，则另一个片段长度为5.6 kb。若目的基因重组时倒置，可形成3.1 kb和3.6 kb的两个片段。(4)将分别用限制酶Pvu

 Ⅰ切开的质粒B溶液与目的基因溶液混合，加入DNA连接酶连接后，导入大肠杆菌的可能是普通质粒，也可能是重组质粒，也可能是目的基因自身连接的DNA环。如果导入的是普通质粒，受体细胞的类型为A(ApR、蓝色)；如果导入的是重组质粒，受体细胞的类型为B(ApR、白色)；如果导入的是目的基因自身连接环，受体细胞的类型是D(ApS、白色)。(5)动物基因工程通常以受精卵作为受体细胞的根本原因是受精卵可发育成动物个体。

8．胰岛素A、B链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。图1是该方法所用的基因表达载体，图2表示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程(融合蛋白A、B分别表示β­半乳糖苷酶与胰岛素A、B链融合的蛋白)。请回答下列问题：

图1

图2

(1)图1基因表达载体中没有标注出来的基本结构是__________。

(2)图1中启动子是________酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达；氨苄青霉素抗性基因的作用是________。

(3)构建基因表达载体时必需的工具酶有________。

(4)β­半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达，可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部，其意义在于________。

(5)溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键，用溴化氰处理相应的融合蛋白能获得完整的A链或B链，且β­半乳糖苷酶被切成多个肽段，这是因为________________。

(6)根据图2中胰岛素的结构，请推测每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量。你的推测结果是________，理由是____________________________________________________。

[答案](1)终止子　(2)RNA聚合　作为标记基因，将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来　(3)限制酶和DNA连接酶　(4)防止胰岛素的A、B链被菌体内蛋白酶降解　(5)β­半乳糖苷酶中含多个甲硫氨酸，而胰岛素A、B链中不含甲硫氨酸　(6)至少2个　两条肽链的一端各有一个游离的氨基，氨基酸R基团中可能还含有游离的氨基

[解析](1)基因表达载体中应具有启动子、目的基因、终止子、标记基因和复制原点。(2)启动子是转录过程中RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达。图中的氨苄青霉素抗性基因充当了标记基因，可用含有氨苄青霉素的培养基筛选含有重组质粒的大肠杆菌。(3)构建基因表达载体时，需要用同种限制酶分别切割目的基因和载体，然后用DNA连接酶将目的基因和载体连接。(4)胰岛素肽链上具有蛋白酶的切割位点，会导致胰岛素被菌体内的蛋白酶降解，而通过融合表达将切割位点隐藏在内部可防止胰岛素的A、B链被菌体内的蛋白酶降解。(5)根据溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键，并结合β­半乳糖苷酶被切成多个肽段，获得了完整的胰岛素A链、B链这一信息，可以推测β­半乳糖苷酶中必然含有多个甲硫氨酸，胰岛素A链、B链不含甲硫氨酸。(6)每一条肽链的两个末端分别含有一个氨基和一个羧基，某些氨基酸的R基中也可能含有氨基。

9．嗜热土壤芽孢杆菌产生的β－葡萄糖苷酶(BglB)是一种耐热纤维素酶。为使其在工业生产中更好地应用，开展了以下试验。如图为质粒限制酶酶切图谱，下表为几种限制酶的识别序列及酶切位点。请回答下列问题：

(1)通常情况下，获得的目的基因需要进行扩增，最简便的方法是________技术。

(2)分析上图，可选择________和________两种不同的限制酶切割质粒，以防止质粒自身环化。质粒被切割后，可用________将其与目的基因连接。在动物基因工程中将目的基因导入受体细胞时通常的方法是________。

(3)大肠杆菌不能降解纤维素，但转入上述建构好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力，这是因为_____________________________________________

_______________________________________________________________。

(4)蛋白质工程是第二代基因工程，它的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→________→________→找到相对应的脱氧核苷酸序列。

[答案](1)PCR　(2)Nde Ⅰ　BamH Ⅰ　DNA连接酶　显微注射法

(3)转基因的大肠杆菌分泌出有活性的BglB酶

(4)设计预期的蛋白质结构　推测应有的氨基酸序列

10．七岁的哈桑因LAMB

3基因突变而患有交界型大疱性表皮松解症，他的皮肤变得像纸一样脆弱，轻微磕碰就会受伤且伤口难以愈合，该病同时还伴有多种炎症，时刻威胁着他的生命。科学家通过基因治疗对其皮肤进行改造拯救了哈桑，治疗过程如图所示。请回答下列问题：

(1)该基因治疗中的目的基因是____________________，可以根据该基因的____________________设计引物，利用PCR技术扩增目的基因片段，PCR技术中使用的酶为______________________________________________________________________。

(2)逆转录病毒在宿主细胞中能够合成“整合酶”，它能切开DNA双链的特定区域，便于目的基因与宿主DNA整合。整合酶的作用类似于基因工程工具中的____________。逆转录病毒一般只感染处于________状态的细胞，以便其将相应的遗传信息整合到宿主DNA上。

(3)过程③中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是________________________________________________________________。

基因治疗过程中，最大的风险是可能导致癌症，原因是______________________________。

[答案](1)未突变的LAMB3基因　脱氧核苷酸序列(或碱基对序列或遗传信息)　热稳定的(或耐高温的)DNA聚合酶(或Taq酶)

(2)限制性核酸内切酶(或限制酶)　分裂

(3)维持培养液的pH　目的基因的插入可能会使原癌基因或抑癌基因发生突变(答案合理即可)

[解析](1)分析图示可知，该基因治疗中的目的基因是未突变的LAMB3基因，利用PCR技术扩增目的基因片段时，可以根据该基因的脱氧核苷酸序列来设计相应的引物，该技术中使用的酶为热稳定的DNA聚合酶。(2)逆转录酶存在于逆转录病毒中，“整合酶”能切开DNA双链的特定区域，便于目的基因与宿主DNA整合，因此整合酶的作用类似于基因工程工具中的限制性核酸内切酶。逆转录病毒只有在细胞分裂时，才能将其相应的遗传信息整合到宿主DNA上，所以一般只感染处于分裂状态的细胞。(3)细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，以维持培养液的pH。逆转录病毒会把基因随机插入基因组里，如果使原癌基因或抑癌基因发生突变，则可能会导致细胞癌变。