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高中生物人教版 (2019)选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序学案
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这是一份高中生物人教版 (2019)选择性必修3第2节 基因工程的基本操作程序学案，共22页。学案主要包含了目的基因的筛选与获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定，DNA片段的扩增及电泳鉴定等内容，欢迎下载使用。
必备知识·夯实双基
一、目的基因的筛选与获取
1．目的基因
(1)概念：用于改变__受体细胞性状__或获得__预期表达产物__等的基因。
(2)实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是__Bt抗虫蛋白基因__。
2．获取方法
特别提醒：引物是依据目的基因的已知序列设计而成的，其提供3′端，以便DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸连接。
二、基因表达载体的构建
1．构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中__稳定存在__，并且可以__遗传__给下一代。
(2)使目的基因能够__表达__和发挥作用。
2．基因表达载体的组成[填图]
3．基因表达载体的构建
首先用一定的__限制酶__切割载体，使它出现一个切口，然后用__同种__限制酶或__能产生相同末端__的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用__DNA连接酶__将目的基因片段拼接到载体的切口处。
三、将目的基因导入受体细胞
1．转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内__维持稳定__和__表达__的过程。
2．目的基因导入受体细胞的方法
(1)目的基因导入植物细胞
①花粉管通道法
Ⅰ．用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入__子房__中。
Ⅱ．在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借__花粉管通道__进入__胚囊__。
②农杆菌转化法
Ⅰ．农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染__双子叶__植物和__裸子__植物；农杆菌的Ti质粒上的__T－DNA__能够整合到所侵染细胞的__染色体DNA__上。
Ⅱ．转化方法：将目的基因插入农杆菌__Ti质粒的T－DNA__中，让农杆菌侵染植物细胞。
(2)目的基因导入动物细胞
①常用方法：__显微注射__法。
②常用受体细胞：__受精卵__。
(3)目的基因导入微生物细胞
①方法：用__Ca2＋__处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组表达载体导入其中。
②常用受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。
四、目的基因的检测与鉴定
1．分子水平检测
(1)通过__PCR__等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA。
(2)从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行__抗原—抗体__杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。
2．个体水平鉴定
包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。
五、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．实验基础
(1)PCR原理：利用了__DNA的热变性__原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
(2)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
(3)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的__大小和构象__等有关。
2．实验步骤
eq \x(\a\al(配制PCR,反应体系))→用__微量移液器__在微量离心管内依次加入PCR反应体系配方中的各组分，并离心
↓
eq \x(进行PCR)→设置好相关参数，将微量离心管放入__PCR仪__中进行反应
↓
eq \x(\a\al(配制琼脂,糖溶液))→根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，并加入适量__核酸染料__混匀
↓
eq \x(制备凝胶)→将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，插入合适大小的梳子，以形成__加样孔__，待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内
↓
eq \x(加样)→将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)的混合液缓慢注入凝胶的加样孔内(留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物)
↓
eq \x(电泳)→接通电源，进行电泳。待指示剂前沿迁移接近__凝胶边缘__时，停止电泳
↓
eq \x(\a\al(观察电泳,鉴定结果))→eq \x(取出凝胶置于紫外灯下观察和照相)
┃┃学霸记忆__■
1．基因工程的基本操作程序有：(1)目的基因的筛选与获取；(2)基因表达载体的构建；(3)将目的基因导入受体细胞；(4)目的基因的检测与鉴定。
2．PCR反应液中需要提供DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。
3．PCR反应中每次循环一般可分为变性、复性、延伸三步。
4．基因表达载体的构建是基因工程的核心，基因表达载体是载体的一种，除了目的基因外，它还必须有启动子、终止子以及标记基因等。
5．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法。
6．将目的基因导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法(Ca2＋处理法)。
7．分子水平的检测：检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中；检测目的基因是否转录出了mRNA；检测目的基因是否翻译出相应蛋白质。
8．目的基因的检测与鉴定也可以在个体生物学水平进行鉴定。
┃┃活学巧练__■
1．从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。(√)
2．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。(×)
3．基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。(×)
4．将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。(√)
5．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。(×)
6．可通过PCR等技术检测棉花的染色体上是否插入了Bt基因。(√)
思考：
1．PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在GC含量高时，对复性温度的设定有什么要求？说明理由。
提示：在引物的GC含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。
2．在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因？
提示：第3轮
3．农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？说明原因。
提示：能，可从双子叶植物中提取该化合物，再用该化合物处理单子叶植物细胞，然后就可用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细胞。
4．将目的基因导入动物的受体细胞除了受精卵外，还可以选择什么细胞？
提示：还可以将目的基因导入胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物体。
课内探究·名师点睛
知识点
目的基因的获取
1．目的基因
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因，主要是指编码蛋白质的基因。
2．获取方法
(1)从基因文库中获取。
(2)利用PCR技术扩增。
(3)通过化学方法人工合成。
3．PCR反应
(1)条件
①模板：DNA母链(目的基因所在的DNA片段)。
②酶：耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)。
③两种引物：分别与两条模板链相结合。
④原料：四种脱氧核苷酸。
(2)过程
(3)结果
上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
知识贴士
关于引物
①概念：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度一般为20～30个核苷酸。
②作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，见下图：
③eq \a\vs4\al(引物,类型)eq \b\lc\{(\a\vs4\al\c1(自然引物（细胞内的DNA复制）：主要为RNA,人工引物（PCR）：DNA单链（主要）或RNA))
┃┃典例剖析__■
典例1 下列有关PCR技术的叙述，错误的是( B )
A．PCR技术的原理是DNA半保留复制
B．变性过程中破坏的是磷酸二酯键
C．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的
D．延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸等，无需添加ATP
解析：PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术，A正确；变性过程是目的基因DNA受热变性后解聚为单链，破坏的是氢键，B错误；引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的，C正确；延伸过程中需要模板DNA、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等，无需添加ATP，D正确。
┃┃变式训练__■
1．用PCR扩增下面的DNA片段：
5′－GACCTGTGAATC……CATACGGGATTG－3′
3′－CTGGACACTTCG……GTATGCCCTAAC－5′
供选择的引物有：①5′－GACCTGTGGAAGC－3′、②5′－CATACGGGATTG－3′、③5′－GTATGCCCTAAC－3′、④5′－CAATCCCGTATG－3′共四种，应选择( D )
A．①② B．②③
C．③④ D．①④
解析：用PCR扩增DNA片段的过程中，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5′端→3′端延伸的，故引物的碱基序列应与每条模板链5′端的一段核苷酸链的碱基序列相同，即应以模板链5′端的一段脱氧核苷酸单链片段作为引物；由题干信息分析可知，5′端的碱基序列是5′－GACCTGTGAATC和5′－CAATCCCGTATG，故对应的引物为①5′－GACCTGTGGAAGC－3′和④5′－CAATCCCGTATG－3′，故选D。
知识点
基因表达载体的构建
1．目的
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2)使目的基因能够表达和发挥作用。
2．地位：基因工程的核心步骤。
3．基因表达载体的组成
4．过程
知识贴士
启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
(1)启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，与终止子一样都位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止。
(2)起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
┃┃典例剖析__■
典例2 在基因表达载体的构建中，下列说法不正确的是( B )
①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子
②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA
③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止
④所有基因表达载体的构建是完全相同的
⑤必须在细胞内进行
A．②③⑤B．①④⑤
C．①②⑤D．③④
解析：基因表达载体的构建是基因工程的核心内容，一个表达载体的组成，除了目的基因外，还有启动子、终止子和标记基因等，①错误；启动子是RNA聚合酶的结合位点，有了它才能驱动基因转录出mRNA，②正确；终止子控制着转录的结束，③正确；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，④错误；基因表达载体的构建必须在细胞外进行，⑤错误。②③正确，①④⑤错误。故选B。
┃┃变式训练__■
2．下图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，ne表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是( D )
A．图甲中的质粒用BamHⅠ切割后，含有4个游离的磷酸基团
B．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和BamHⅠ切割质粒和外源DNA
C．导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长
D．用PstⅠ和HindⅢ酶切，可以保证重组DNA序列的唯一性
解析：图甲中的质粒用BamHⅠ切割后，会打开一个切口，故有2个游离的磷酸基团，A错误；在构建重组质粒时，不能用BamHⅠ切割外源DNA，因为BamHⅠ会破坏目的基因，B错误；操作中获取目的基因时会用到PstⅠ，但甲中该酶会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基中生长，C错误；用PstⅠ和HindⅢ酶切，可以避免自身环化，保证重组DNA序列的唯一性，D正确。
知识点
目的基因导入受体细胞
1．导入的方法
2．目的基因在受体细胞中的位置不同会引起遗传上的差别
(1)图中a细胞减数分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因。
(2)图中b在进行细胞减数分裂时，细胞核中的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传性状的稳定性，细胞中目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
知识贴士
在将目的基因导入受体细胞之前，都必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。
┃┃典例剖析__■
典例3 农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞后，目的基因插入的位置是( B )
A．Ti质粒上B．受体细胞染色体DNA上
C．T－DNAD．农杆菌的拟核
解析：目的基因进入受体细胞后，要能正常表达，就必须插入受体细胞染色体DNA上。
┃┃变式训练__■
3．下列有关将目的基因导入受体细胞的叙述，正确的是( A )
A．将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法
B．原核生物有繁殖快、遗传物质少等特点，可用于生产各种有生物活性的蛋白质
C．基因枪法是将目的基因导入动物细胞中最为有效的方法
D．可将含有目的基因的植物病毒作为载体导入Ca2＋处理后的大肠杆菌细胞
解析：原核生物的细胞中没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质进行加工，故生产的蛋白质可能没有生物活性；将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射技术；植物病毒只侵染植物细胞。
知识点
目的基因的检测与鉴定
1．目的基因的检测与鉴定
2．不同分子检测原理的异同
(1)检测目的基因是否插入受体DNA中、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。检测原理都是碱基互补配对原则，只是被检测的物质不同，一个是转基因生物的基因组DNA，一个是转基因生物细胞内的mRNA。
(2)进行翻译水平的检测，通常以目的基因表达产物(蛋白质)作抗原，制备相应抗体，检测转基因生物的蛋白质，利用抗原与抗体特异性结合的原理。
(3)不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。
知识贴士
基因工程操作过程中碱基互补配对现象
基因工程操作过程中只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有碱基互补配对现象；第一步筛选与获取目的基因，用人工合成、PCR获取或基因文库获取，三种常用方法都涉及碱基互补配对；第二步基因表达载体的构建中DNA连接酶连接目的基因与质粒载体，第四步利用分子杂交的方法检测(DNA、mRNA)，也都存在碱基互补配对现象。
┃┃典例剖析__■
典例4 转基因抗虫棉培育过程中，下列有关目的基因检测与鉴定方法的叙述，错误的是( A )
A．检测抗虫基因是否导入——农杆菌转化法
B．检测抗虫基因是否转录——PCR技术
C．检测抗虫基因是否翻译——抗原—抗体杂交
D．检测抗虫蛋白生物功能——抗虫接种实验
解析：农杆菌转化法是将抗虫基因导入植物细胞的方法，不能用于检测目的基因是否导入受体细胞，A错误；可用PCR技术检测抗虫基因是否转录出mRNA，B正确；检测目的基因是否翻译成蛋白质，常用抗原—抗体杂交，C正确；检测抗虫蛋白生物功能，可在个体水平上进行抗虫接种实验，D正确。
┃┃变式训练__■
4．在判断抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子检测的是( A )
A．通过观察害虫吃棉叶是否死亡
B．检测目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带
C．检测目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带
D．检测目的基因表达产物蛋白质能否与特定抗体形成杂交带
解析：A项属于个体生物学水平的鉴定，不是分子检测。B、C两项为分子检测，利用分子杂交技术，观察目的基因及目的基因转录形成的mRNA能否与DNA探针进行杂交形成杂交带；D项也为分子检测内容，利用抗原—抗体杂交的原理，检测基因表达产物能否与特定抗体形成杂交带。
知识点
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．实验原理
(1)DNA片段的扩增：利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。
(2)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
(3)电泳鉴定：PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
2．操作步骤
(1)加样：按照PCR反应体系的配方将所有组分加入微量离心管中，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管底部。
(2)反应：将微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应(可参照下表内容进行设置)。
(3)制胶：根据待分离DNA片段的大小，制备琼脂糖凝胶。一般配制质量体积比为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。制好的凝胶放入电泳槽中，加电泳缓冲液，以没过凝胶1mm为宜。
(4)点样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
(5)电泳：待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
(6)观察：取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
3．注意事项
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
┃┃典例剖析__■
典例5 在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因表达载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述错误的是( D )
A．该载体最可能为环形DNA分子
B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C．限制酶R1与R2的酶切位点最短相距约200bp
D．限制酶切割时会导致作用位点的氢键和肽键断裂
解析：当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度约为800bp的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；两种限制酶同时切割时则产生长度约为600bp和200bp的两种DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距约200bp，C正确；限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点的磷酸二酯键，D错误。
┃┃变式训练__■
5．对禽流感的确诊，先用PCR技术将标本基因大量扩增，然后利用基因探针，测知待测标本与探针核酸的碱基异同。如图P表示禽流感病毒探针基因在凝胶的电泳标记位置，甲、乙、丙、丁是四份送检样品在测定后的电泳标记位置，哪份标本最有可能被确诊为禽流感( C )
A．甲B．乙
C．丙D．丁
解析：据图分析，图中P表示禽流感病毒探针基因在凝胶的电泳标记位置，甲、乙、丙、丁是四份送检样品在测定后的电泳标记位置，其中丙的电泳位置与P最接近，因此最有可能被确诊为禽流感。
指点迷津·拨云见日
一、细胞内DNA复制与PCR反应的比较
┃┃典例剖析__■
典例6 PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是( C )
①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA
②PCR过程不需要DNA聚合酶
③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的
④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制
A．③④ B．①②
C．①③ D．②④
解析：PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：一是PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA，长度通常为20～30个核苷酸；二是PCR过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。
二、DNA分子杂交技术
(1)原理：碱基互补配对原则。
(2)基因探针：用放射性同位素或荧光物质标记的目的基因。
(3)检测受体细胞是否含目的基因的具体过程：
┃┃典例剖析__■
典例7 下图为DNA分子杂交技术的应用，请分析后判断下图中两个物种亲缘关系更近的是( A )
解析：杂合双链区越长，说明两物种DNA中碱基序列相似度越高，而物种间碱基序列相似度越高，则其亲缘关系越近。通过分析比较可以看出物种甲和物种乙形成的杂合双链区最长，故两者的亲缘关系最近。
解疑答惑
从社会中来⇨P76
提示：转基因抗虫棉抗虫的机制是抗虫基因(Bt基因)来源于苏云金杆菌，Bt基因表达的蛋白质具有杀虫活性。当害虫食用转基因抗虫棉花的时候，同时摄入Bt基因产生的抗虫蛋白，当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。培育转基因抗虫棉的步骤有目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
旁栏思考1⇨P79
提示：用PCR不能直接扩增mRNA，DNA聚合酶识别的是双链DNA，mRNA为单链结构。应首先逆转录获得cDNA才能进行PCR。
旁栏思考2⇨P80
提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。
到社会中去⇨P83
1．提示：这是一个开放性的问题，需要查找资料来回答。随着田间监测数据的更新及新的科研论文发表，每年获得的证据是不一样的。要注意搜集科学、可靠的证据，如科研论文、权威的官方报道等。
2．提示：科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。
(1)基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性，包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。
(2)田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。
(3)国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全性评价等。
练习与应用⇨P83
一、概念检测
1．(1)√
(2)× 提示：构建重组质粒要用到限制酶(用来在特定位点进行切割)和DNA连接酶(用来连接目的基因和载体)，不需要核酸酶。
(3)× 提示：目的基因成功导入受体细胞后不一定会表达，还需要进行检测和鉴定。
2．D 提示：延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种脱氧核苷酸。
二、拓展应用
1．提示：可能在自交繁殖过程中存在转基因的沉默或丢失现象。
2．提示：(1)psy和crlⅠ基因、pmi基因将目的基因送入受体细胞。
(2)不能，限制酶会将目的基因切断，破坏目的基因。
(3)维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β－胡萝卜素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β－胡萝卜素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β－胡萝卜素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广‘黄金大米’”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。
探究·实践⇨P84
结果分析与评价
1．提示：观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
2．提示：如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
训练巩固·课堂达标
1．将目的基因导入大豆茎尖分生区细胞和小鼠受精卵，常用的方法分别是( C )
A．显微注射法、农杆菌转化法B．显微注射法、花粉管通道法
C．农杆菌转化法、显微注射法D．花粉管通道法、显微注射法
解析：大豆是双子叶植物，农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物细胞常用的方法；显微注射法是将目的基因导入动物受精卵最常用的方法。
2．如图为形成cDNA的过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法正确的是( D )
A．催化①过程的酶是RNA聚合酶
B．催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高温
C．③过程需要解旋酶的作用
D．④过程需要冷却至50℃左右
解析：图中①过程为逆(反)转录，该过程需要逆转录酶(反转录酶)的催化，A错误；图中②⑤过程为DNA复制，这两个过程都需要DNA聚合酶的催化，其中⑤过程进行的温度是70～75℃，因此催化该过程的DNA聚合酶能耐高温，但催化②过程的酶可以不耐高温，B错误；③过程为高温解链，该过程不需要解旋酶，C错误；④为复性过程，需要冷却至50℃左右，D正确。
3．基因表达载体的构建所需要的条件是( B )
①同一种限制酶 ②具有某些标记基因的质粒 ③RNA聚合酶 ④目的基因 ⑤DNA连接酶 ⑥启动子 ⑦终止子
A．①②③④⑤⑥⑦ B．①②④⑤⑥⑦
C．②④⑥⑦D．①②④⑤
解析：构建基因表达载体是将目的基因与有关载体拼接起来，故所需要的条件除了目的基因和具有某些标记基因的质粒外，还需要同一种限制酶和DNA连接酶，启动子和终止子。
4．(不定项)如图为某种质粒的简图，小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，P为转录的启动部位。已知目的基因的两端有EcRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列有关叙述，错误的是( ABD )
A．将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，生成由两个DNA片段连接形成的产物有两种
B．DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来，形成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键
C．为了防止目的基因反向粘连和质粒自行环化，酶切时可选用的酶是EcRⅠ和BamHⅠ
D．能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞表明该目的基因已成功导入该细胞
解析：根据题意，目的基因的两端有EcRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，将含有目的基因的DNA用EcRⅠ酶切，会得到目的基因片段；根据质粒的简图可知，将质粒用EcRⅠ酶切，会得到与质粒周长等长的链状DNA；因此将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，可生成目的基因—目的基因片段、目的基因—质粒片段、质粒—质粒片段三种产物，A错误；DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来形成一个重组质粒，该过程形成四个磷酸二酯键，B错误；EcRⅠ和BamHⅠ的识别序列不同，获取目的基因和切割质粒时，同时选用EcRⅠ和BamHⅠ切割，目的基因两端形成的末端不同，切割开的质粒两端形成的末端不同，再用DNA连接酶连接，可以防止目的基因反向连接和质粒自身环化，C正确；题图显示，在构建基因表达载体的过程中质粒中的青霉素抗性基因和四环素抗性基因都不会被破坏，因此能在含青霉素和四环素的培养基中生长的受体细胞不能表明目的基因已成功导入该细胞，D错误。
新课程标准
核心素养
1．阐明基因工程的原理和基本操作程序。
2．针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。
3．尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
1．科学思维——结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。
2．科学探究——针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
知识导图
过程
说明
图解
变性
温度上升到90℃左右，双链DNA解聚为单链
复性
温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸
温度上升到72℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸
受体细
胞类型
方法
说明
特点
植物
细胞
农杆菌
转化法
将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达
经济、有效，适合于双子叶植物和裸子植物
花粉管
通道法
在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞→目的基因表达
简便、经济，我国科学家独创
动物
细胞
显微注
射法
目的基因片段受精卵的核内→将受精卵移植到雌性动物的输卵管或子宫内→使受精卵发育成转基因动物
将目的基因导入动物细胞的最有效的方法
微生物
细胞
Ca2＋处理法(感受态细胞法)
Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体与感受态细胞混合在缓冲液中→在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程
简便、经济、有效
循环程序
变性
复性
延伸
预变性
94℃，5min
/
/
30次
94℃，30s
55℃，30s
72℃，1min
最后1次
94℃，1min
55℃，30s
72℃，1min
项目
体内DNA复制
PCR反应
不同点
时期
细胞有丝分裂间期和减数第一次分裂前的间期
体外随时进行
场所
活细胞内
微量离心管内
酶
解旋酶、DNA聚合酶
耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)
解旋
在解旋酶的作用下，细胞提供能量，部分解开
加热至90℃以上时，双链全部解开，不需解旋酶
引物
一小段RNA
可以是RNA或单链DNA分子片段
合成子链
在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成
分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度在72℃左右
特点
边解旋边复制，半保留复制
体外迅速扩增
循环次数
受生物体自身控制
30多次
产物
完整DNA
DNA片段
相同点
原料
4种脱氧核苷酸(A、G、C、T)
复制原理
严格遵循碱基互补配对原则，半保留复制
模板
以DNA母链为模板
引物
都需要分别与两条模板链相结合的两种引物
必备知识·夯实双基
一、目的基因的筛选与获取
1．目的基因
(1)概念：用于改变__受体细胞性状__或获得__预期表达产物__等的基因。
(2)实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是__Bt抗虫蛋白基因__。
2．获取方法
特别提醒：引物是依据目的基因的已知序列设计而成的，其提供3′端，以便DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸连接。
二、基因表达载体的构建
1．构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中__稳定存在__，并且可以__遗传__给下一代。
(2)使目的基因能够__表达__和发挥作用。
2．基因表达载体的组成[填图]
3．基因表达载体的构建
首先用一定的__限制酶__切割载体，使它出现一个切口，然后用__同种__限制酶或__能产生相同末端__的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用__DNA连接酶__将目的基因片段拼接到载体的切口处。
三、将目的基因导入受体细胞
1．转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内__维持稳定__和__表达__的过程。
2．目的基因导入受体细胞的方法
(1)目的基因导入植物细胞
①花粉管通道法
Ⅰ．用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入__子房__中。
Ⅱ．在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借__花粉管通道__进入__胚囊__。
②农杆菌转化法
Ⅰ．农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染__双子叶__植物和__裸子__植物；农杆菌的Ti质粒上的__T－DNA__能够整合到所侵染细胞的__染色体DNA__上。
Ⅱ．转化方法：将目的基因插入农杆菌__Ti质粒的T－DNA__中，让农杆菌侵染植物细胞。
(2)目的基因导入动物细胞
①常用方法：__显微注射__法。
②常用受体细胞：__受精卵__。
(3)目的基因导入微生物细胞
①方法：用__Ca2＋__处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组表达载体导入其中。
②常用受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。
四、目的基因的检测与鉴定
1．分子水平检测
(1)通过__PCR__等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA。
(2)从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行__抗原—抗体__杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。
2．个体水平鉴定
包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。
五、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．实验基础
(1)PCR原理：利用了__DNA的热变性__原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
(2)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
(3)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的__大小和构象__等有关。
2．实验步骤
eq \x(\a\al(配制PCR,反应体系))→用__微量移液器__在微量离心管内依次加入PCR反应体系配方中的各组分，并离心
↓
eq \x(进行PCR)→设置好相关参数，将微量离心管放入__PCR仪__中进行反应
↓
eq \x(\a\al(配制琼脂,糖溶液))→根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，并加入适量__核酸染料__混匀
↓
eq \x(制备凝胶)→将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，插入合适大小的梳子，以形成__加样孔__，待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内
↓
eq \x(加样)→将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)的混合液缓慢注入凝胶的加样孔内(留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物)
↓
eq \x(电泳)→接通电源，进行电泳。待指示剂前沿迁移接近__凝胶边缘__时，停止电泳
↓
eq \x(\a\al(观察电泳,鉴定结果))→eq \x(取出凝胶置于紫外灯下观察和照相)
┃┃学霸记忆__■
1．基因工程的基本操作程序有：(1)目的基因的筛选与获取；(2)基因表达载体的构建；(3)将目的基因导入受体细胞；(4)目的基因的检测与鉴定。
2．PCR反应液中需要提供DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。
3．PCR反应中每次循环一般可分为变性、复性、延伸三步。
4．基因表达载体的构建是基因工程的核心，基因表达载体是载体的一种，除了目的基因外，它还必须有启动子、终止子以及标记基因等。
5．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法和花粉管通道法。
6．将目的基因导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法(Ca2＋处理法)。
7．分子水平的检测：检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中；检测目的基因是否转录出了mRNA；检测目的基因是否翻译出相应蛋白质。
8．目的基因的检测与鉴定也可以在个体生物学水平进行鉴定。
┃┃活学巧练__■
1．从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。(√)
2．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。(×)
3．基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。(×)
4．将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。(√)
5．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。(×)
6．可通过PCR等技术检测棉花的染色体上是否插入了Bt基因。(√)
思考：
1．PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在GC含量高时，对复性温度的设定有什么要求？说明理由。
提示：在引物的GC含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。
2．在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因？
提示：第3轮
3．农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？说明原因。
提示：能，可从双子叶植物中提取该化合物，再用该化合物处理单子叶植物细胞，然后就可用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细胞。
4．将目的基因导入动物的受体细胞除了受精卵外，还可以选择什么细胞？
提示：还可以将目的基因导入胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物体。
课内探究·名师点睛
知识点
目的基因的获取
1．目的基因
用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因，主要是指编码蛋白质的基因。
2．获取方法
(1)从基因文库中获取。
(2)利用PCR技术扩增。
(3)通过化学方法人工合成。
3．PCR反应
(1)条件
①模板：DNA母链(目的基因所在的DNA片段)。
②酶：耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)。
③两种引物：分别与两条模板链相结合。
④原料：四种脱氧核苷酸。
(2)过程
(3)结果
上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
知识贴士
关于引物
①概念：引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度一般为20～30个核苷酸。
②作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，见下图：
③eq \a\vs4\al(引物,类型)eq \b\lc\{(\a\vs4\al\c1(自然引物（细胞内的DNA复制）：主要为RNA,人工引物（PCR）：DNA单链（主要）或RNA))
┃┃典例剖析__■
典例1 下列有关PCR技术的叙述，错误的是( B )
A．PCR技术的原理是DNA半保留复制
B．变性过程中破坏的是磷酸二酯键
C．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的
D．延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸等，无需添加ATP
解析：PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术，A正确；变性过程是目的基因DNA受热变性后解聚为单链，破坏的是氢键，B错误；引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的，C正确；延伸过程中需要模板DNA、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等，无需添加ATP，D正确。
┃┃变式训练__■
1．用PCR扩增下面的DNA片段：
5′－GACCTGTGAATC……CATACGGGATTG－3′
3′－CTGGACACTTCG……GTATGCCCTAAC－5′
供选择的引物有：①5′－GACCTGTGGAAGC－3′、②5′－CATACGGGATTG－3′、③5′－GTATGCCCTAAC－3′、④5′－CAATCCCGTATG－3′共四种，应选择( D )
A．①② B．②③
C．③④ D．①④
解析：用PCR扩增DNA片段的过程中，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5′端→3′端延伸的，故引物的碱基序列应与每条模板链5′端的一段核苷酸链的碱基序列相同，即应以模板链5′端的一段脱氧核苷酸单链片段作为引物；由题干信息分析可知，5′端的碱基序列是5′－GACCTGTGAATC和5′－CAATCCCGTATG，故对应的引物为①5′－GACCTGTGGAAGC－3′和④5′－CAATCCCGTATG－3′，故选D。
知识点
基因表达载体的构建
1．目的
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2)使目的基因能够表达和发挥作用。
2．地位：基因工程的核心步骤。
3．基因表达载体的组成
4．过程
知识贴士
启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
(1)启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，与终止子一样都位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止。
(2)起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
┃┃典例剖析__■
典例2 在基因表达载体的构建中，下列说法不正确的是( B )
①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子
②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA
③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止
④所有基因表达载体的构建是完全相同的
⑤必须在细胞内进行
A．②③⑤B．①④⑤
C．①②⑤D．③④
解析：基因表达载体的构建是基因工程的核心内容，一个表达载体的组成，除了目的基因外，还有启动子、终止子和标记基因等，①错误；启动子是RNA聚合酶的结合位点，有了它才能驱动基因转录出mRNA，②正确；终止子控制着转录的结束，③正确；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，④错误；基因表达载体的构建必须在细胞外进行，⑤错误。②③正确，①④⑤错误。故选B。
┃┃变式训练__■
2．下图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，ne表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是( D )
A．图甲中的质粒用BamHⅠ切割后，含有4个游离的磷酸基团
B．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和BamHⅠ切割质粒和外源DNA
C．导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长
D．用PstⅠ和HindⅢ酶切，可以保证重组DNA序列的唯一性
解析：图甲中的质粒用BamHⅠ切割后，会打开一个切口，故有2个游离的磷酸基团，A错误；在构建重组质粒时，不能用BamHⅠ切割外源DNA，因为BamHⅠ会破坏目的基因，B错误；操作中获取目的基因时会用到PstⅠ，但甲中该酶会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基中生长，C错误；用PstⅠ和HindⅢ酶切，可以避免自身环化，保证重组DNA序列的唯一性，D正确。
知识点
目的基因导入受体细胞
1．导入的方法
2．目的基因在受体细胞中的位置不同会引起遗传上的差别
(1)图中a细胞减数分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因。
(2)图中b在进行细胞减数分裂时，细胞核中的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传性状的稳定性，细胞中目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
知识贴士
在将目的基因导入受体细胞之前，都必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。
┃┃典例剖析__■
典例3 农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞后，目的基因插入的位置是( B )
A．Ti质粒上B．受体细胞染色体DNA上
C．T－DNAD．农杆菌的拟核
解析：目的基因进入受体细胞后，要能正常表达，就必须插入受体细胞染色体DNA上。
┃┃变式训练__■
3．下列有关将目的基因导入受体细胞的叙述，正确的是( A )
A．将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法
B．原核生物有繁殖快、遗传物质少等特点，可用于生产各种有生物活性的蛋白质
C．基因枪法是将目的基因导入动物细胞中最为有效的方法
D．可将含有目的基因的植物病毒作为载体导入Ca2＋处理后的大肠杆菌细胞
解析：原核生物的细胞中没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质进行加工，故生产的蛋白质可能没有生物活性；将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射技术；植物病毒只侵染植物细胞。
知识点
目的基因的检测与鉴定
1．目的基因的检测与鉴定
2．不同分子检测原理的异同
(1)检测目的基因是否插入受体DNA中、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。检测原理都是碱基互补配对原则，只是被检测的物质不同，一个是转基因生物的基因组DNA，一个是转基因生物细胞内的mRNA。
(2)进行翻译水平的检测，通常以目的基因表达产物(蛋白质)作抗原，制备相应抗体，检测转基因生物的蛋白质，利用抗原与抗体特异性结合的原理。
(3)不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。
知识贴士
基因工程操作过程中碱基互补配对现象
基因工程操作过程中只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有碱基互补配对现象；第一步筛选与获取目的基因，用人工合成、PCR获取或基因文库获取，三种常用方法都涉及碱基互补配对；第二步基因表达载体的构建中DNA连接酶连接目的基因与质粒载体，第四步利用分子杂交的方法检测(DNA、mRNA)，也都存在碱基互补配对现象。
┃┃典例剖析__■
典例4 转基因抗虫棉培育过程中，下列有关目的基因检测与鉴定方法的叙述，错误的是( A )
A．检测抗虫基因是否导入——农杆菌转化法
B．检测抗虫基因是否转录——PCR技术
C．检测抗虫基因是否翻译——抗原—抗体杂交
D．检测抗虫蛋白生物功能——抗虫接种实验
解析：农杆菌转化法是将抗虫基因导入植物细胞的方法，不能用于检测目的基因是否导入受体细胞，A错误；可用PCR技术检测抗虫基因是否转录出mRNA，B正确；检测目的基因是否翻译成蛋白质，常用抗原—抗体杂交，C正确；检测抗虫蛋白生物功能，可在个体水平上进行抗虫接种实验，D正确。
┃┃变式训练__■
4．在判断抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子检测的是( A )
A．通过观察害虫吃棉叶是否死亡
B．检测目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带
C．检测目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带
D．检测目的基因表达产物蛋白质能否与特定抗体形成杂交带
解析：A项属于个体生物学水平的鉴定，不是分子检测。B、C两项为分子检测，利用分子杂交技术，观察目的基因及目的基因转录形成的mRNA能否与DNA探针进行杂交形成杂交带；D项也为分子检测内容，利用抗原—抗体杂交的原理，检测基因表达产物能否与特定抗体形成杂交带。
知识点
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．实验原理
(1)DNA片段的扩增：利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。
(2)电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
(3)电泳鉴定：PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
2．操作步骤
(1)加样：按照PCR反应体系的配方将所有组分加入微量离心管中，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管底部。
(2)反应：将微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应(可参照下表内容进行设置)。
(3)制胶：根据待分离DNA片段的大小，制备琼脂糖凝胶。一般配制质量体积比为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。制好的凝胶放入电泳槽中，加电泳缓冲液，以没过凝胶1mm为宜。
(4)点样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
(5)电泳：待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
(6)观察：取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
3．注意事项
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
┃┃典例剖析__■
典例5 在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因表达载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述错误的是( D )
A．该载体最可能为环形DNA分子
B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C．限制酶R1与R2的酶切位点最短相距约200bp
D．限制酶切割时会导致作用位点的氢键和肽键断裂
解析：当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度约为800bp的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；两种限制酶同时切割时则产生长度约为600bp和200bp的两种DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距约200bp，C正确；限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点的磷酸二酯键，D错误。
┃┃变式训练__■
5．对禽流感的确诊，先用PCR技术将标本基因大量扩增，然后利用基因探针，测知待测标本与探针核酸的碱基异同。如图P表示禽流感病毒探针基因在凝胶的电泳标记位置，甲、乙、丙、丁是四份送检样品在测定后的电泳标记位置，哪份标本最有可能被确诊为禽流感( C )
A．甲B．乙
C．丙D．丁
解析：据图分析，图中P表示禽流感病毒探针基因在凝胶的电泳标记位置，甲、乙、丙、丁是四份送检样品在测定后的电泳标记位置，其中丙的电泳位置与P最接近，因此最有可能被确诊为禽流感。
指点迷津·拨云见日
一、细胞内DNA复制与PCR反应的比较
┃┃典例剖析__■
典例6 PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是( C )
①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA
②PCR过程不需要DNA聚合酶
③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的
④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制
A．③④ B．①②
C．①③ D．②④
解析：PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：一是PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA，长度通常为20～30个核苷酸；二是PCR过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。
二、DNA分子杂交技术
(1)原理：碱基互补配对原则。
(2)基因探针：用放射性同位素或荧光物质标记的目的基因。
(3)检测受体细胞是否含目的基因的具体过程：
┃┃典例剖析__■
典例7 下图为DNA分子杂交技术的应用，请分析后判断下图中两个物种亲缘关系更近的是( A )
解析：杂合双链区越长，说明两物种DNA中碱基序列相似度越高，而物种间碱基序列相似度越高，则其亲缘关系越近。通过分析比较可以看出物种甲和物种乙形成的杂合双链区最长，故两者的亲缘关系最近。
解疑答惑
从社会中来⇨P76
提示：转基因抗虫棉抗虫的机制是抗虫基因(Bt基因)来源于苏云金杆菌，Bt基因表达的蛋白质具有杀虫活性。当害虫食用转基因抗虫棉花的时候，同时摄入Bt基因产生的抗虫蛋白，当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。培育转基因抗虫棉的步骤有目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
旁栏思考1⇨P79
提示：用PCR不能直接扩增mRNA，DNA聚合酶识别的是双链DNA，mRNA为单链结构。应首先逆转录获得cDNA才能进行PCR。
旁栏思考2⇨P80
提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。
到社会中去⇨P83
1．提示：这是一个开放性的问题，需要查找资料来回答。随着田间监测数据的更新及新的科研论文发表，每年获得的证据是不一样的。要注意搜集科学、可靠的证据，如科研论文、权威的官方报道等。
2．提示：科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。
(1)基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性，包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。
(2)田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。
(3)国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全性评价等。
练习与应用⇨P83
一、概念检测
1．(1)√
(2)× 提示：构建重组质粒要用到限制酶(用来在特定位点进行切割)和DNA连接酶(用来连接目的基因和载体)，不需要核酸酶。
(3)× 提示：目的基因成功导入受体细胞后不一定会表达，还需要进行检测和鉴定。
2．D 提示：延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种脱氧核苷酸。
二、拓展应用
1．提示：可能在自交繁殖过程中存在转基因的沉默或丢失现象。
2．提示：(1)psy和crlⅠ基因、pmi基因将目的基因送入受体细胞。
(2)不能，限制酶会将目的基因切断，破坏目的基因。
(3)维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β－胡萝卜素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β－胡萝卜素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β－胡萝卜素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广‘黄金大米’”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。
探究·实践⇨P84
结果分析与评价
1．提示：观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
2．提示：如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
训练巩固·课堂达标
1．将目的基因导入大豆茎尖分生区细胞和小鼠受精卵，常用的方法分别是( C )
A．显微注射法、农杆菌转化法B．显微注射法、花粉管通道法
C．农杆菌转化法、显微注射法D．花粉管通道法、显微注射法
解析：大豆是双子叶植物，农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物细胞常用的方法；显微注射法是将目的基因导入动物受精卵最常用的方法。
2．如图为形成cDNA的过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法正确的是( D )
A．催化①过程的酶是RNA聚合酶
B．催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高温
C．③过程需要解旋酶的作用
D．④过程需要冷却至50℃左右
解析：图中①过程为逆(反)转录，该过程需要逆转录酶(反转录酶)的催化，A错误；图中②⑤过程为DNA复制，这两个过程都需要DNA聚合酶的催化，其中⑤过程进行的温度是70～75℃，因此催化该过程的DNA聚合酶能耐高温，但催化②过程的酶可以不耐高温，B错误；③过程为高温解链，该过程不需要解旋酶，C错误；④为复性过程，需要冷却至50℃左右，D正确。
3．基因表达载体的构建所需要的条件是( B )
①同一种限制酶 ②具有某些标记基因的质粒 ③RNA聚合酶 ④目的基因 ⑤DNA连接酶 ⑥启动子 ⑦终止子
A．①②③④⑤⑥⑦ B．①②④⑤⑥⑦
C．②④⑥⑦D．①②④⑤
解析：构建基因表达载体是将目的基因与有关载体拼接起来，故所需要的条件除了目的基因和具有某些标记基因的质粒外，还需要同一种限制酶和DNA连接酶，启动子和终止子。
4．(不定项)如图为某种质粒的简图，小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，P为转录的启动部位。已知目的基因的两端有EcRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列有关叙述，错误的是( ABD )
A．将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，生成由两个DNA片段连接形成的产物有两种
B．DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来，形成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键
C．为了防止目的基因反向粘连和质粒自行环化，酶切时可选用的酶是EcRⅠ和BamHⅠ
D．能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞表明该目的基因已成功导入该细胞
解析：根据题意，目的基因的两端有EcRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，将含有目的基因的DNA用EcRⅠ酶切，会得到目的基因片段；根据质粒的简图可知，将质粒用EcRⅠ酶切，会得到与质粒周长等长的链状DNA；因此将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，可生成目的基因—目的基因片段、目的基因—质粒片段、质粒—质粒片段三种产物，A错误；DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来形成一个重组质粒，该过程形成四个磷酸二酯键，B错误；EcRⅠ和BamHⅠ的识别序列不同，获取目的基因和切割质粒时，同时选用EcRⅠ和BamHⅠ切割，目的基因两端形成的末端不同，切割开的质粒两端形成的末端不同，再用DNA连接酶连接，可以防止目的基因反向连接和质粒自身环化，C正确；题图显示，在构建基因表达载体的过程中质粒中的青霉素抗性基因和四环素抗性基因都不会被破坏，因此能在含青霉素和四环素的培养基中生长的受体细胞不能表明目的基因已成功导入该细胞，D错误。
新课程标准
核心素养
1．阐明基因工程的原理和基本操作程序。
2．针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。
3．尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
1．科学思维——结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。
2．科学探究——针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
知识导图
过程
说明
图解
变性
温度上升到90℃左右，双链DNA解聚为单链
复性
温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸
温度上升到72℃左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸
受体细
胞类型
方法
说明
特点
植物
细胞
农杆菌
转化法
将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达
经济、有效，适合于双子叶植物和裸子植物
花粉管
通道法
在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞→目的基因表达
简便、经济，我国科学家独创
动物
细胞
显微注
射法
目的基因片段受精卵的核内→将受精卵移植到雌性动物的输卵管或子宫内→使受精卵发育成转基因动物
将目的基因导入动物细胞的最有效的方法
微生物
细胞
Ca2＋处理法(感受态细胞法)
Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体与感受态细胞混合在缓冲液中→在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程
简便、经济、有效
循环程序
变性
复性
延伸
预变性
94℃，5min
/
/
30次
94℃，30s
55℃，30s
72℃，1min
最后1次
94℃，1min
55℃，30s
72℃，1min
项目
体内DNA复制
PCR反应
不同点
时期
细胞有丝分裂间期和减数第一次分裂前的间期
体外随时进行
场所
活细胞内
微量离心管内
酶
解旋酶、DNA聚合酶
耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)
解旋
在解旋酶的作用下，细胞提供能量，部分解开
加热至90℃以上时，双链全部解开，不需解旋酶
引物
一小段RNA
可以是RNA或单链DNA分子片段
合成子链
在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成
分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度在72℃左右
特点
边解旋边复制，半保留复制
体外迅速扩增
循环次数
受生物体自身控制
30多次
产物
完整DNA
DNA片段
相同点
原料
4种脱氧核苷酸(A、G、C、T)
复制原理
严格遵循碱基互补配对原则，半保留复制
模板
以DNA母链为模板
引物
都需要分别与两条模板链相结合的两种引物
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