适用于新高考新教材2024版高考生物二轮复习专题8生物技术与工程课件

这是一份适用于新高考新教材2024版高考生物二轮复习专题8生物技术与工程课件，共60页。PPT课件主要包含了落实主干知识，醋酸菌，巴氏消毒法，湿热灭菌法，稀释涂布平板法，细胞的全能性，细胞增殖，膜的流动性，细胞核的全能性，囊胚期等内容，欢迎下载使用。

【知识成串】 1.传统发酵技术——制作原理、发酵条件控制;2.培养基——选择培养基、鉴别培养基;3.植物组织培养——脱分化、再分化;4.动物细胞培养——培养条件;5.单克隆抗体的制备——两次筛选目的不同;6.基因工程载体——作为载体的条件;7.基因表达载体的构建——启动子、终止子。
1.(选择性必修3 P7正文)醋酸菌是好氧细菌,当O2、糖源都充足时能通过复杂的化学反应将糖分解成乙酸;当缺少糖源时则直接将乙醇转化为乙醛,再将乙醛变为乙酸。2.(选择性必修3 P10正文)获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。3.(选择性必修3 P16思考·讨论)尿素分解菌之所以能分解尿素,是因为它们能合成脲酶,脲酶催化尿素分解产生NH3,NH3可作为细菌生长的氮源。4.(选择性必修3 P18正文)利用稀释涂布平板法计数,统计的菌落数往往比活菌的实际数目少,这是因为当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落。
5.(选择性必修3 P27正文)单细胞蛋白是通过发酵获得了大量的微生物菌体。6.(选择性必修3 P62思考·讨论)胚胎移植实质上是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移。7.(选择性必修3 P81资料卡)农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞,并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。8.(选择性必修3 P84探究·实践)在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。9.(选择性必修3 P90正文)构建乳腺生物反应器时需要将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。
1.判断有关发酵工程说法的正误。(1)醋酸菌在无氧条件下利用乙醇产生乙酸。(　　)(2)在制作果酒、果醋时,适当加大接种量可以提高发酵速率、抑制杂菌生长繁殖。(　　)(3)发酵工程与传统发酵技术最大的区别是前者可以用微生物进行发酵。(　　)(4)对细菌进行计数能采用稀释涂布平板法,也能用平板划线法。(　　)(5)分解尿素的细菌在分解尿素时,可以将尿素转化为氨,使得培养基的酸碱度降低。(　　)(6)发酵工程的产品主要包括微生物的代谢产物、酶及菌体本身。(　　)
2.判断有关动植物细胞工程和胚胎工程说法的正误。(1)愈伤组织是外植体通过脱分化和再分化后形成的。(　　)(2)用纤维素酶和果胶酶水解法获得的植物原生质体失去了全能性。(　　)(3)植物体细胞杂交所获得的杂种植株的变异类型属于染色体变异。(　　)(4)动物细胞培养过程中需将动物细胞放于含95% O2和5% CO2的CO2培养箱中培养。(　　)(5)体外培养的动物细胞一类能悬浮在培养液中生长增殖,另一类需要贴附于某些基质表面才能生长增殖。(　　)(6)多种B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合筛选后,还需经克隆化培养和抗体检测,才能获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。(　　)(7)胚胎分割过程中,可取滋养层细胞做DNA分析,鉴定性别。(　　)
3.判断有关基因工程和蛋白质工程说法的正误。(1)限制酶能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的氢键断开。(　　)(2)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。(　　)(3)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,它是RNA聚合酶识别和结合的部分,有了它才能驱动DNA的复制过程。(　　)(4)转化是指目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(　　)(5)生殖性克隆人破坏了人类基因多样性的天然属性,不利于人类的生存和进化。(　　)
1.平板划线法在做第二次以及其后的划线操作时,总是从上一次划线的末端开始划线的原因是   　。 提示 划线后,线条末端细菌的数目比线条起始处要少,每次从上一次划线的末端开始,能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个微生物繁殖而来的菌落2.某同学在纯化土壤中的细菌时,发现培养基上的菌落连成了一片,可能的原因是   　。 提示 菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌
3.平板划线法不能用于测定活菌的数量的原因是     　。提示 由于在所划的线中,一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个活菌形成的菌落,而其他一些菌落往往由两个活菌或多个活菌繁殖而成,而在计数时一个菌落对应着一个活菌,这样在划线所得的平板中,菌落数目远低于活菌的实际数值,所以不能用平板划线法测定活菌数量4.作物脱毒时应选取哪些部位的组织进行组织培养?原因是　   　。提示 一般选取根尖或茎尖的分生区　植物顶端分生区附近的病毒极少,甚至无病毒,用该处细胞进行组织培养,能得到大量的脱毒苗
5.对囊胚阶段的胚胎进行分割时,要将内细胞团均等分割的原因是  　。提示 若分割时不能将内细胞团均等分割,会出现含内细胞团多的部分可以正常发育,少的部分发育受阻或发育不良,甚至不能发育等6.构建基因表达载体时,目的基因和载体分别使用两种限制酶切割,这样做的优点是    　。 提示 用两种不同的限制酶进行切割能够使目的基因和载体定向连接,避免目的基因和载体分别发生自身环化以及目的基因与载体的反向连接,提高连接的有效性7.蛋白质工程通过对基因的操作来实现对天然蛋白质进行改造,而不直接对蛋白质分子进行操作的原因是   　 。 提示 ①蛋白质具有十分复杂的空间结构,基因的结构相对简单,容易改造;②改造后的基因可以遗传给下一代,被改造的蛋白质无法遗传
8.若要使目的基因在受体细胞中表达,需要通过基因表达载体而不能直接将目的基因导入受体细胞,原因是   　。 提示 目的基因无复制原点;目的基因无表达所需的启动子9.科学家从某些无限增殖细胞的细胞质中分离出了无限增殖调控基因(prG),该基因能激发动物细胞分裂,这为单克隆抗体的制备提供了更多的思路。除教材提供的制备单克隆抗体技术外,请从不同的角度,再简要写出两种制备单克隆抗体的思路。 提示 通过基因工程向B淋巴细胞中导入prG;利用核移植技术将B淋巴细胞的细胞核移植到去核的能无限增殖的细胞中
10.设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图),请分别说明理由。
提示 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效,引物Ⅰ'自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
串联整合——明要点1.传统发酵技术与发酵工程(1)厘清四种传统发酵食品的制作技术
(2)泡菜腌制过程中,乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化
2.微生物的培养技术及应用(1)微生物培养中的无菌操作技术
(2)两种纯化细菌方法的比较
特别提醒 为了确定培养基的灭菌是否合格,微生物实验一般会设置空白对照,随机取若干灭菌后的空白平板培养基在适宜条件下培养一段时间,观察培养基上是否有菌落生成。
(3)微生物分离与计数的两个实例
3.发酵工程过程及其应用与传统发酵技术相比,大规模工业发酵能够通过菌种选育、控制发酵过程和分离提纯产品等过程批量生产发酵产品。其操作流程如下:
分层演练——拿高分角度1 围绕传统发酵技术及发酵工程应用,考查科学思维练真题·明考向1.(2023·山东卷)以下是以泡菜坛为容器制作泡菜时的4个处理:①沸盐水冷却后再倒入坛中;②盐水需要浸没全部菜料;③盖好坛盖后,向坛盖边沿的水槽中注满水;④检测泡菜中亚硝酸盐的含量。下列说法正确的是(　　)A.①主要是为了防止菜料表面的醋酸杆菌被杀死B.②的主要目的是用盐水杀死菜料表面的杂菌C.③是为了使气体只能从泡菜坛排出而不能进入D.④可检测到完整发酵过程中亚硝酸盐含量逐渐降低
解析 泡菜发酵过程利用的微生物主要是乳酸菌,故①主要是防止菜料表面的乳酸菌被杀死,A项错误;②的主要目的是营造无氧环境,B项错误;乳酸发酵为无氧发酵,向坛盖边沿的水槽中注满水的目的是防止外界空气进入泡菜坛,C项正确;泡菜制作过程中亚硝酸盐含量先升高后降低,D项错误。
2.(2023·山东卷改编)果酒的家庭制作与啤酒的工业化生产相比,共同点有(　　)A.都利用了酵母菌有氧呼吸产生酒精的原理B.都需要一定的有氧环境供发酵菌种繁殖C.发酵前都需要对原料进行灭菌D.发酵结束后都必须进行消毒以延长保存期
解析 果酒的家庭制作与啤酒的工业化生产都利用了酵母菌进行无氧呼吸产生酒精的原理,A项错误;发酵前期,均需要一定的有氧环境,使酵母菌大量繁殖,B项正确;果酒的家庭制作不需要对原料进行灭菌,C项错误;果酒的家庭制作不需要进行消毒,D项错误。
角度拓展 (1)啤酒的工业化生产中,焙烤是为了利用高温杀死大麦种子胚并进行灭菌。[2022·山东卷](　　)(2)葡萄酒制作过程中,随着发酵的进行发酵液中糖含量增加。[2021·山东卷](　　)(3)酸奶制作过程中,后期低温处理可产生大量乳酸杆菌。[2021·湖北卷](　　)(4)果酒、果醋和泡菜制作中利用的微生物都属于原核生物。[2021·海南卷](　　)
练模拟·提能力3.(2023·安徽马鞍山三模)下列关于传统发酵食品制作的叙述,正确的是(　　)A.泡菜、果酒和果醋的制作均需在无氧环境下进行B.酿酒中酵母菌的最适生长温度与酿醋中醋酸菌的最适生长温度不同C.泡菜腌制时,坛边沿水槽内有气泡是乳酸菌无氧呼吸产生CO2引起的D.果酒制作过程中,葡萄糖中的能量经酵母菌酒精发酵大部分以热能散失
解析 制作泡菜利用的微生物是乳酸菌,乳酸菌是厌氧型细菌,所以制作泡菜的过程须全程持续保持无氧环境;制作果酒利用的微生物是酵母菌,酵母菌要先通过有氧呼吸大量增殖,之后需保持无氧条件进行酒精发酵;参与果醋制作的醋酸菌是好氧菌,制作果醋需要有氧环境,A项错误。酿酒中酵母菌的最适生长温度与酿醋中醋酸菌的最适生长温度不同,后者温度较高,B项正确。泡菜腌制时,所需的菌种是乳酸菌,乳酸菌无氧呼吸的产物是乳酸,无CO2的产生,C项错误。果酒制作过程中,葡萄糖中的能量经酵母菌酒精发酵大部分存留在酒精中,D项错误。
4.(2023·山东潍坊二模)《礼记·月令》中记载:“仲冬之月……乃命大酋,秫稻必齐,曲糵必时,湛炽(清洁煮沸)必洁,水泉必香,陶器必良,火齐必得。兼用六物,大酋监之,毋有差贷。”这是一套比较完整的酿酒工艺流程,对于酿酒时节、原料选择等都有严格规定,更对我国酿酒技术的发展有着深远的影响。下列说法正确的是(　　)A.“秫稻必齐”可为酿酒提供丰富的糖,随着发酵的进行糖含量会升高B.为防止二次污染,应在“湛炽”后立即接种酿酒的酒曲C.“陶器必良”可以确保酵母菌产生酒精的同时避免醋酸的产生D.在适宜的温度下发酵,发酵液的温度并不会随发酵的进行而改变
解析 酿酒过程中,酵母菌进行无氧呼吸分解糖类产生酒精和CO2,糖含量下降,A项错误;在“湛炽”后立即接种酿酒的酒曲,会杀死酵母菌,应在冷却后加入酒曲,B项错误;“陶器必良”是为了有良好的容器从而控制好发酵过程气体条件(无氧条件),可以确保酵母菌产生酒精的同时避免醋酸的产生, C项正确;在发酵的过程中,酵母菌进行细胞呼吸,产生的热能会使发酵液的温度升高,D项错误。
角度2 围绕微生物的培养、分离与计数,考查理解能力和科学思维练真题·明考向5.(2023·山东卷)平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是(　　)A.不含氮源的平板不能用于微生物培养B.平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒C.接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃D.利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
解析 不含氮源的平板可用于固氮微生物的培养,A项错误;平板涂布时涂布器使用前通常用酒精消毒后通过火焰灼烧灭菌,B项错误;接种后未长出菌落的培养基需要经过高压蒸汽灭菌后丢弃,以防污染环境,C项错误;只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素,因此利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物,D项正确。
6.(2023·广东卷)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(图1)和选择培养基筛选原理来判断,下列最可能筛选到目标菌的条件组合是(　　)A.A点时取样、尿素氮源培养基B.B点时取样、角蛋白氮源培养基C.B点时取样、蛋白胨氮源培养基D.C点时取样、角蛋白氮源培养基
解析 本实验的目的是筛选能高效降解角蛋白的嗜热菌,因此既要耐高温,又要能够高效降解角蛋白,所以在C点取样,并且以角蛋白氮源培养基进行选择培养。
角度拓展 (1)防疫期间用石炭酸喷洒教室和用免洗酒精凝胶擦手都能达到灭菌目的。[2021·天津卷](　　)(2)涂布分离法和划线分离法均能得到单菌落,都可用于细胞计数。[2021·浙江卷](　　)(3)观察菌落的形态和颜色等可初步判断葡萄球菌。[2021·北京卷](　　)(4)为提高一株石油降解菌的净化能力,将菌涂布于石油为唯一碳源的固体培养基上,以致死率为90%的辐照剂量诱变处理,涂布用的菌浓度应控制在30~300个/mL。[2021·江苏卷](　　)(5)可使用平板划线法统计活细菌总数。[2020·天津卷](　　)
(6)为纯化菌种,在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌,培养结果如图所示。图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多,应从Ⅲ区挑取单菌落。[2020·江苏卷](　　)(7)通常在实验室培养微生物时,需要对所需的玻璃器皿进行灭菌,灭菌的方法有　　　　　　　　　　　　　　(答出2点即可)。[2022·全国卷乙] 
高压蒸汽灭菌、干热灭菌
(8)枯草芽孢杆菌为好氧微生物,液体培养时应采用　　　　(填“静置”或“摇床震荡”)培养。培养过程中抽样检测活菌数量时,应采用　　　　　　　　　(填“稀释涂布平板法”或“显微镜直接计数法”),其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　。[2022·河北卷]用稀释涂布平板法在培养基上看到的每一个菌落都来自一个活细胞,而显微镜直接计数法会将死亡的枯草芽孢杆菌也计算在内
练模拟·提能力7.(2023·江苏南京模拟)酿造酒生产中会产生一种潜在致癌物——氨基甲酸乙酯(EC),EC可被酸性脲酶分解。研究人员开展筛选高产酸性脲酶菌的实验,下表是该实验使用的两种选择培养基配方,其中尿素在高温下易分解,溴甲酚紫变色范围pH为5.2(浅黄)~6.8(紫红),酚红变色范围pH为6.8(黄)~8.4(红)。
下列相关叙述不正确的是(　　)A.培养基在100 kPa、121 ℃下湿热灭菌20 min,过滤除菌的尿素溶液要在灭菌后加入B.培养基加少量牛肉膏、蛋白胨、酵母膏和葡萄糖的目的是补充碳源和氮源C.分离菌种的主要步骤:接种污泥→富集培养→稀释涂布法初筛→划线法纯化→鉴定D.目的菌落周围在酸性培养基上应呈紫红色,且在中性培养基上呈红色
解析 对培养基进行灭菌常采用高压蒸气灭菌法,灭菌时需要在固体培养基加上封口膜后在压力为100 kPa、温度为121 ℃条件下灭菌15~30 min,冷却后再通过玻璃漏斗加入过滤除菌的尿素溶液,尿素在高温下易分解,不能在灭菌前加入,A项正确;加入牛肉膏、蛋白胨、酵母膏和葡萄糖可为微生物的培养提供碳源和氮源,B项正确;分离菌种的主要步骤为接种污泥(取样)→富集培养→稀释涂布法初筛→划线法纯化(筛选菌株)→鉴定,C项正确;分析题意可知,目的菌可使培养基中EC被酸性脲酶分解,使培养基中pH增大,从而使溴甲酚紫在酸性培养基中由浅黄色变为紫红色,但不能据此推断中性培养基的pH变化,故在中性培养基中不一定呈红色,D项错误。
8.(2023·河北模拟)酿酒酵母菌种的性能是决定果酒品质的重要因素。如图表示从土壤中筛选酿酒酵母的过程。下列叙述正确的是(　　)A.图示接种方法为稀释涂布平板法,据结果推测1 g土壤中酵母菌数最多为1.6×106B.分离、纯化酵母菌时,还可采用平板划线法且该方法也需要进行③步骤操作C.获得酿酒酵母纯培养物的关键是防止杂菌污染,故应对土壤、培养基及用具进行灭菌D.进行步骤⑤时,应用液体培养基培养④中的酵母菌,并检测酵母菌的数量和酒精含量
解析 图示接种方法为稀释涂布平板法,据结果推测1 g土壤中酵母菌数为1.6×106,该方法估算值低于真实数值,故1 g土壤中酵母菌数最少为1.6×106,A项错误;分离、纯化酵母菌时,还可采用平板划线法且该方法不需要进行③步骤操作,B项错误;对土壤灭菌可将其中的酿酒酵母杀死,将不能获得酿酒酵母的纯培养物,C项错误;用经过④纯化的菌种,需要检测酵母菌的数量和酒精含量,然后进行步骤⑤,D项正确。
9.(2023·福建模拟)白地霉侵染是导致柑橘酸腐病的主要原因,实验证明桔梅奇酵母通过分泌普切明酸对白地霉具有生物防治能力。已知铁是真菌生长的必需元素,是胞内重要酶活性中心的组成部分。普切明酸是桔梅奇酵母产生的一种水溶性铁螯合剂,能快速在培养基中扩散并与其中的Fe3+形成稳定红色复合物。研究配制的含有不同浓度FeCl3的培养基如下表所示。实验结果为随FeCl3浓度增大,抑菌圈红色加深但变窄,如下图所示。
相关叙述正确的是(　　)A.蛋白胨和琼脂可以提供碳源、氮源、维生素B.白地霉采用了平板划线法,桔梅奇酵母采用了稀释涂布平板法C.结果表明,FeCl3浓度增大,普切明酸与Fe3+结合的数量减少D.抑菌圈变窄是由于桔梅奇酵母分泌的酶使普切明酸被分解
解析 琼脂是凝固剂的一种,并不是营养物质,不可以提供碳源、氮源、维生素,A项错误;白地霉采用了稀释涂布平板法,桔梅奇酵母的接种采用了平板划线法,B项错误;随培养基中FeCl3浓度的增加,普切明酸与Fe3+的结合增强,抑菌圈的红色加深,C项错误;普切明酸与Fe3+形成红色复合物,但随培养基中FeCl3浓度的增加,抑菌圈变窄,是由于桔梅奇酵母分泌的酶使普切明酸被分解,D项正确。
考点2 细胞工程和胚胎工程
串联整合——明要点1.植物细胞工程(1)熟记植物组织培养的四个关键点
(2)图解植物体细胞杂交的基本过程
特别提醒 (1)植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。(2)杂种植株的染色体数目通常是两亲本细胞染色体数目之和,杂种植株属于异源多倍体。(3)利用植物组织培养生产细胞产物时,有时只需将外植体培养到愈伤组织,从愈伤组织中获取产物。
2.动物细胞工程(1)图解动物细胞培养的过程
特别提醒 ①动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同。第一次:处理剪碎的组织,使其分散成单个细胞。第二次:使贴壁细胞从瓶壁上脱落下来,分散成单个细胞。②避免杂菌污染的措施:培养液及培养用具灭菌处理,加入一定量的抗生素,定期更换培养液。③区分原代培养和传代培养的关键为是否分瓶培养。
(2)厘清克隆动物培育流程
特别提醒 核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因。
(3)准确记忆单克隆抗体的“一过程两特点”①制备过程。②单克隆抗体的特点:能准确识别　　　　　　　　,与特定抗原发生特异性结合,并可以大量制备。 
3.胚胎工程(1)熟知胚胎工程的操作流程
(2)归纳胚胎工程中的三个“两”
分层演练——拿高分角度1 围绕植物细胞工程,考查科学思维和科学探究能力练真题·明考向1.(2023·山东卷)利用植物细胞培养技术在离体条件下对单个细胞或细胞团进行培养使其增殖,可获得植物细胞的某些次生代谢物。下列说法正确的是(　　)A.利用该技术可获得某些无法通过化学合成途径得到的产物B.植物细胞体积小,故不能通过该技术进行其产物的工厂化生产C.次生代谢物是植物所必需的,但含量少,应选择产量高的细胞进行培养D.该技术主要利用促进细胞生长的培养条件提高单个细胞中次生代谢物的含量
解析 若植物细胞的某些次生代谢物在体外无法通过化学途径合成,则可通过植物细胞培养技术获得,A项正确;虽然植物细胞体积小,但可通过植物细胞培养使其大量增殖,进而产生大量产物进行工厂化生产,B项错误;次生代谢产物不是植物生长所必需的,C项错误;植物细胞培养技术通过筛选高产细胞,对其培养使其大量增殖,进而获得其代谢物,该技术主要利用促进细胞增殖的培养条件提高细胞中次生代谢物的含量,D项错误。
2.(2023·广东卷)人参皂苷是人参的主要活性成分。科研人员分别诱导人参根与胡萝卜根产生愈伤组织并进行细胞融合,以提高人参皂苷的产率。下列叙述错误的是(　　)A.细胞融合前应去除细胞壁B.高Ca2+—高pH溶液可促进细胞融合C.融合的细胞即为杂交细胞D.杂交细胞可能具有生长快速的优势
解析 植物体细胞杂交第一步为制备原生质体,即去除细胞壁,A项正确。植物体细胞原生质体融合需要人工诱导,可以采取高Ca2+—高pH溶液进行诱导,B项正确。融合后形成的细胞有人参根—人参根细胞、胡萝卜根—胡萝卜根细胞、人参根—胡萝卜根细胞,只有人参根—胡萝卜根细胞才是杂交细胞,C项错误。由于胡萝卜根细胞的生长速度快,所以杂交细胞可能具有生长快速的优势,D项正确。
角度拓展 (1)菊花组织培养中用自然生长的茎进行组培须用适宜浓度的乙醇和次氯酸钠的混合液消毒。[2022·浙江卷](　　)(2)组织培养过程中也可无明显愈伤组织形成,直接形成胚状体等结构。[2021·江苏卷](　　)(3)在诱导形成愈伤组织阶段时通常选择茎尖、幼叶等作为外植体,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。[2020·天津卷]
细胞分化程度低,容易诱导产生愈伤组织
练模拟·提能力3.(2023·辽宁沈阳二模)人参是一种名贵中药材,其有效成分主要是人参皂苷,利用植物细胞培养技术生产人参皂苷的大致流程如下,下列叙述正确的是(　　)A.培养前对人参根切块要进行严格灭菌处理B.诱导后得到的①的分化程度高于外植体C.可用射线处理①获得人参皂苷高产的细胞D.进行细胞分离时常需要用胰蛋白酶处理①
解析 进行植物组织培养时,可以对外植体采用适宜方法进行消毒,但是不能灭菌处理,A项错误;由图分析可知,人参根切块(外植体)经诱导后形成了①愈伤组织,该过程为脱分化,脱分化后细胞的分化程度降低,全能性提高,因此诱导后得到的①的分化程度低于外植体,B项错误;可用射线处理①愈伤组织诱导其发生基因突变等可遗传变异,进而获得人参皂苷高产的细胞,C项正确;将愈伤组织分离成单个细胞时需要酶解植物细胞间的胞间层,胞间层的成分主要是果胶,故需用果胶酶,D项错误。
4.(2023·福建厦门模拟)甲植物具有由核基因控制的多种优良性状,远缘植物乙的细胞质中存在抗除草剂基因,科研人员通过以下途径培育出具有抗除草剂性状的优良品种丙。图中字母表示过程、数字序号表示细胞。下列相关叙述正确的是(　　)A.过程A应置于等渗溶液中处理,再将①②诱导融合成③B.过程B无需筛选鉴定,形成杂种细胞后即可接种到培养基中C.过程C、D采用固体培养基,添加激素的种类和比例相同D.杂种植株丙为二倍体,其产生的配子均含有抗除草剂基因
解析 过程A为去除细胞壁的过程,该过程应置于等渗溶液中处理,而后再利用诱导融合的方法将①②诱导融合成③,再生出细胞壁为杂种细胞,A项正确;过程B获得的融合细胞未必都是甲的细胞核和乙的细胞质融合形成的,因而需筛选鉴定,而后形成杂种细胞才可接种到培养基中,B项错误;过程C、D分别为脱分化和再分化过程,这些过程需要在固体培养基中诱导产生,两过程中添加激素的种类和比例不同,C项错误;杂种植株的抗除草剂基因位于细胞质中,而花粉几乎只有细胞核,故细胞质基因一般不会通过花粉遗传给后代,即杂种植株产生的雄配子中不一定含有抗除草剂基因,D项错误。
角度2 结合动物细胞工程技术,考查科学思维练真题·明考向5.(2023·湖南卷节选)研究人员通过肺上皮干细胞诱导生成肺类器官,可自组装或与成熟细胞组装成肺类装配体,如图所示。肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH以及________________________　　　　　　 　　(答出两点)等基本条件。肺类装配体形成过程中是否运用了动物细胞融合技术?　　　(填“是”或“否”)。 
适宜的气体环境和无菌、
解析 动物细胞培养除了需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH外,还需要适宜的气体环境和无菌、无毒的环境。题图中的肺类器官A和B不是动物细胞,所以肺类装配体形成过程中没有运用动物细胞融合技术。
6.(2023·湖北卷)某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体,以期快速检测该病毒,其主要技术路线如图所示。
回答下列问题。(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前,已免疫的脾细胞(含浆细胞)　　　　　　(填“需要”或“不需要”) 通过原代培养扩大细胞数量;添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合,该过程中PEG对细胞膜的作用是　　　　 　 　　　　　　　。(2)在杂交瘤细胞筛选过程中,常使用特定的选择培养基(如HAT培养基),该培养基对　　　　　　　　　　和　　　　 　　　　生长具有抑制作用。(3)单克隆抗体筛选中,将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交,其目的是  　。 
使细胞接触处的脂质分子重新排布,打开细胞膜,使细胞发生融合
融合的具有同种核的细胞
通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞
(4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是　　　　　　。 
解析 (1)浆细胞是高度分化的细胞,已失去分裂能力,不能通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物质PEG可使细胞接触处的脂质分子重新排布,打开细胞膜,使细胞发生融合。(2)在杂交瘤细胞筛选过程中,用特定的选择培养基进行筛选,在该培养基上,未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡,只有融合的杂交瘤细胞才能生长。(3)单克隆抗体筛选中,将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交,是运用了抗原—抗体杂交技术,抗体检测呈阳性的细胞,即为所需的杂交瘤细胞。(4)DNA连接酶能连接DNA片段,脱氧核苷酸的磷酸基团位于5'端,—OH位于3'端,①②③脱氧核苷酸链两端的基团有误;DNA连接酶能催化合成磷酸二酯键,即将一条脱氧核苷酸5'端的磷酸基团与另一条脱氧核苷酸链的3'端的—OH相连,④符合题意。
角度拓展 (1)灭活的病毒可用于诱导动物细胞融合。[2021·辽宁卷](　　)(2)用特定的病毒免疫小鼠可制备单克隆抗体。[2021·辽宁卷](　　)(3)动物细胞培养中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离。[2021·浙江卷](　　)(4)单抗制备过程中通常将分离出的浆细胞与骨髓瘤细胞融合。[2021·山东卷](　　)
练模拟·提能力7.(2023·河北石家庄三模)下列关于动物细胞工程的叙述,错误的是(　　)A.进行动物细胞培养时,应置于5%CO2和95%空气的气体环境中B.诱导植物原生质体融合的方法均可用于诱导动物细胞融合C.进行核移植时,需用显微操作法去除处于MⅡ期的卵母细胞的细胞核D.进行核移植时,需用电融合法激活重构胚,使其完成分裂和发育进程
解析 用于动物细胞培养的二氧化碳培养箱中的气体成分为95%空气和5%CO2,5%CO2是为了维持培养液的pH,O2是细胞生活所必需的,A项正确;诱导动物细胞融合的方法有物理法(离心、振动)、化学法(聚乙二醇)、生物法(灭活的病毒),诱导植物原生质体融合的方法可分为物理法和化学法,诱导植物原生质体融合的方法均可用于诱导动物细胞融合,B项正确;进行核移植时,从卵巢采集的卵母细胞需在体外培养至MⅡ期再进行去核操作,目前动物细胞核移植技术普遍使用的去核方法是显微操作法,C项正确;核移植时,一般先用电融合法使供体和受体细胞融合,再用物理或化学方法激活重构胚,使其完成细胞分裂和发育进程,D项错误。
8.(2023·河北衡水二模)甲状旁腺激素(PTH)是调节钙磷代谢的主要激素之一,临床上可通过PTH来评估骨转换、肾脏疾病以及血液透析患者的预后。研究人员利用人PTH免疫小鼠制备抗PTH的单克隆抗体,以建立快速检测PTH的方法。下列说法错误的是(　　)A.利用人PTH免疫小鼠的目的是获得能产生抗PTH的抗体的B淋巴细胞B.诱导骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合后,再进行筛选才能获得杂交瘤细胞C.将从选择培养基上获得的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔即可生产单克隆抗体D.抗PTH的单克隆抗体用于检测血清PTH时,不与其他蛋白质激素相结合
解析 利用人PTH蛋白多次免疫小鼠的目的是刺激小鼠产生更多能分泌抗人PTH抗体的B淋巴细胞,A项正确;融合的细胞经过筛选才能获得杂交瘤细胞,进行筛选的原因是细胞的融合是随机的,反应体系中含有未融合的细胞、融合的具有同种核型的细胞以及杂交瘤细胞,B项正确;从培养基获得的杂交瘤细胞,还需要经过抗体检测和克隆化培养才能获得足够数量的能产生所需抗体的杂交瘤细胞,C项错误;由于抗体与抗原的特异性,抗PTH的单克隆抗体用于检测血清PTH时,不与其他蛋白质激素相结合,D项正确。
角度3 围绕胚胎工程及其应用,考查科学思维练真题·明考向9.(2023·广东卷)科学家采用体外受精技术获得紫羚羊胚胎,并将其移植到长角羚羊体内,使后者成功妊娠并产仔,该工作有助于恢复濒危紫羚羊的种群数量。此过程不涉及的操作是(　　)A.超数排卵B.精子获能处理C.细胞核移植D.胚胎培养
解析 体外受精需要进行超数排卵以获得更多的卵母细胞,并且要对精子进行获能处理,将受精卵培养至桑葚胚或囊胚时期再进行胚胎移植。该过程没有涉及细胞核移植。
角度拓展 (1)早期胚胎需移植到经同期发情处理的同种雌性动物体内发育成个体。[2021·江苏卷](　　)(2)从雄性奶牛中采集到的成熟精子遇到卵子即可进入卵子内。[2020·浙江卷](　　)(3)胚胎移植时需使用免疫抑制剂以避免代孕牛对植入胚胎的排斥反应。[2018·江苏卷](　　)
(4)[2022·全国卷]某牧场引进一只产肉性能优异的良种公羊,为了在短时间内获得具有该公羊优良性状的大量后代,该牧场利用胚胎工程技术进行了相关操作。①在体外受精前要对精子进行获能处理,其原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　 　　　　　;利用该公羊的精子进行体外受精需要发育到一定时期的卵母细胞,因为卵母细胞达到　　　　时才具备与精子受精的能力。 ②请以保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料进行操作,以获得具有该公羊优良性状的后代。主要的操作步骤是　　　　　　　　　　 　　　 　　　　　　　　　　　。
刚排出的精子必须在雌性生殖道内发生相应生理变化后才能获得受精能力
对受体母羊进行发情处理,合适的时间,将保存的囊胚移植入受体母羊的子宫
练模拟·提能力10.(2023·河北唐山三模)下列关于胚胎发育和胚胎移植技术的叙述,错误的是(　　)A.口服促性腺激素促进雌性动物超数排卵B.供体母牛需选用遗传性状优良、生产能力强的个体C.囊胚中的滋养层细胞将发育成胎膜和胎盘D.对供体和受体进行同期发情处理是胚胎移植成功的关键
解析 促性腺激素的化学本质为蛋白质,口服时促性腺激素会在消化液中被分解而失去作用,A项错误;为了保持优良特性,供体母牛需选用遗传性状优良、生产能力强的个体,B项正确;囊胚将来发育成胎儿的各种组织,其中的滋养层细胞将发育成胎膜和胎盘,C项正确;胚胎移植成功的关键是对供体和受体进行同期发情处理,使得处于相同的生理状态,D项正确。
11.(2023·辽宁丹东二模)世界首例猪肾移植人体手术成功,3天均未发生排异现象。这颗肾脏来自一头实施过基因编辑的猪。下图为基因编辑猪的培育流程,有关说法错误的是(　　)A.对1号猪进行基因编辑时,应在其基因组中导入某种调节因子以抑制抗原决定基因的表达,或设法除去抗原决定基因B.对2号猪使用促性腺激素使其超数排卵后,收集培养至MⅡ期的卵母细胞进行核移植C.重组细胞还需用电刺激、Ca2+载体、乙醇等方法激活,使其完成细胞分裂和发育进程D.图中的重组胚胎处于囊胚期,该时期的所有细胞都具有发育的全能性
解析 对1号猪进行基因编辑时,应在其基因组中导入某种调节因子以抑制抗原决定基因的表达,或设法除去抗原决定基因,才能在肾移植后防止排异反应,A项正确;2号猪是卵细胞供体,使用促性腺激素使其超数排卵后,收集培养至MⅡ期的卵母细胞进行去核,并用于核移植,B项正确;用物理或化学方法(如电刺激、Ca2+载体、乙醇和蛋白酶合成抑制剂等)激活重构胚,使其完成细胞分裂和发育进程,C项正确;囊胚期细胞出现分化,分化为内细胞团和滋养层,内细胞团的细胞具有发育的全能性,D项错误。
专项命题——重培优【从新情境角度命题】单克隆抗体的应用命题情境 双特异性抗体是指一个抗体分子可以与两个不同抗原或同一抗原的两个不同抗原表位相结合,目前最常利用杂交瘤杂交法来制备。长春花是原产于非洲东海岸的野生花卉,其所含的长春碱具有良好的抗肿瘤作用。图1是科研人员通过杂交—杂交瘤细胞技术(免疫的B淋巴细胞和杂交瘤细胞杂交技术)生产能同时识别癌胚抗原和长春碱的双特异性单克隆抗体的部分过程,图2是某双特异性抗体作用图。
【命题角度】(1)从新冠病毒感染者体内提取到S蛋白的RBD片段,多次注射到小鼠体内,目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　。一段时间后将获取的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,利用　　　　　　　筛选出杂交瘤细胞。(2)为选出能产生专一抗体的细胞,要从HAT培养基上筛选出杂交瘤细胞,然后将其稀释滴入多孔培养板中,使多孔培养板每孔中有　　　个细胞,然后筛选出抗体检测呈　　　　(填“阳性”或“阴性”)的细胞进行克隆化培养;该克隆化培养细胞具有的特点为　　　　　　　　　　　　　　　　。 (3)与直接使用抗肿瘤药物相比,将抗肿瘤药物与双特异性单克隆抗体结合后给药,对人体的副作用更小,原因是双特异性单克隆抗体能　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 
刺激小鼠产生更多已免疫的B细胞
既能无限增殖,又能产生特异性抗体
将药物送到肿瘤部位,对肿瘤进行特异性杀伤
练真题·明考向1.(2022·山东卷)如图所示,将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子,在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体,简称双抗。下列说法错误的是(　　)A.双抗可同时与2种抗原结合B.利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞C.筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原D.同时注射2种抗原可刺激B细胞分化为产双抗的浆细胞
解析 双抗同时含有抗体1、2的部分结构,可与2种抗原结合,A项正确。根据抗体与抗原特异性结合的特点,利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞,B项正确。筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原,才能刺激机体产生2种B细胞,进而产生2种抗体,而不是刺激B细胞分化为产双抗的浆细胞,C项正确,D项错误。
练模拟·提能力2.人肌红蛋白(My)是早期诊断急性心肌梗死的生化标志物之一。双抗体夹心法是医学上常用的定量检测抗原的方法(如图所示),利用细胞工程技术制备的单克隆抗体能增强该过程的有效性。下列说法错误的是(　　)A.将My基因导入小鼠骨髓瘤细胞,制备不出抗My的单克隆抗体B.抗My的单克隆抗体可与My特异性结合,用于诊断急性心肌梗死C.固相抗体和酶标抗体均能识别待测抗原,这是由于两者结构相同D.加入酶标抗体的目的是通过测定酶促反应的产物量来判断待测抗原量
解析 My基因指导合成的是人肌红蛋白,将My基因导入小鼠骨髓瘤细胞,无法制备抗My的单克隆抗体,A项正确;抗My的单克隆抗体可与My特异性结合,用于诊断急性心肌梗死,B项正确;抗体与抗原的结合具有特异性,因此不同抗体可与同一抗原表面的不同部位结合,固相抗体和酶标抗体具有不同的结构,C项错误;由于抗体具有特异性,因此该检测方法中,酶标抗体的作用是与待测抗原结合,酶催化检测底物反应,可通过测定酶促反应的产物量来判断待测抗原量,D项正确。
串联整合——明要点1.基因工程的基本工具
2.理解掌握基因工程的操作步骤(1)目的基因的筛选与获取
特别提醒 ①从cDNA文库获取的目的基因不含启动子和终止子。②利用乳腺生物反应器生产药物时,应将目的基因与乳腺蛋白基因的启动子连接到一起。
(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建
特别提醒 启动子、终止子、起始密码子和终止密码子的关系启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)。终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA上)。
(3)将目的基因导入受体细胞
(4)目的基因的检测与鉴定
特别提醒 PCR技术不仅可用于获取和扩增目的基因,还能用于检测受体细胞中是否含有目的基因或检测受体细胞中的目的基因是否转录出mRNA。
脱氧核苷酸序列(基因)
分层演练——拿高分角度1 围绕基因工程的基本操作,考查理解能力练真题·明考向1.(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　)A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
解析 用一种限制酶切割,目的基因在质粒上可以正向或反向插入,进而导致基因转录产物的不同,A项正确。用一种限制酶切割后,质粒有可能发生自身环化,导致目的基因未能插入,B项正确。SphⅠ酶切会在重组质粒上产生特定的片段,通过DNA凝胶电泳技术可以分离和检测这些片段,从而确定重组质粒是否构建成功,C项正确。根据质粒图示,携带目的基因的受体菌需要同时具有AmpR和TetR基因才能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基中形成菌落,若用SphⅠ酶切,会破坏四环素抗性基因(TetR),D项错误。
2.(2023·广东卷)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变,筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。回答下列问题。(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确实由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与　　　　植株的种子大小相近。 (2)用PCR反应扩增DA1基因,用限制性内切核酸酶对PCR产物和　　　　　进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备　　　　　 　　。 
(3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株,用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交,将T1代种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了　 。②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约　　　　　%的培养基中幼苗继续培养。③将②中选出的T2代阳性植株　　　　　　　　(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到　　　%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。  
DA1基因和卡那霉素抗性基因
为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性内切核酸酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息见下图,在答题卡电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
解析 (1)根据题干信息可知,突变后的基因为隐性基因,则野生型DA1基因为显性基因,因此采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确实由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。(2)利用PCR技术扩增DA1基因后,应该用同种限制性内切核酸酶对PCR产物和载体进行切割,再用DNA连接酶将两者连接起来。在基因表达载体中,启动子位于目的基因的首端,终止子位于目的基因的尾端,因此为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备启动子和终止子。
(3)①将T0代植株的花序浸没在农杆菌(T-DNA上含有DA1基因和卡那霉素抗性基因)菌液中转化,再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上,在选择培养基上能够萌发并生长的阳性个体应该含有卡那霉素抗性基因,即表示其基因组中插入了DA1基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DA1基因,由于T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点,所以不确定是单一位点插入还是多个位点插入,若是单一位点插入,相当于一对等位基因的杂合子,其自交后代应该出现3∶1的性状分离比,即阳性率约75%的培养基中幼苗是单一位点插入的植株。
③将单一位点插入的T2代阳性植株自交,再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上,若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株,即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析,野生型和突变型基因片段的长度都是150 bp,野生型的基因上没有限制酶X的切割位点,而突变型的基因上有限制酶X的切割位点,结合图中的数据分析可知,电泳图中,野生型只有150 bp的条带,突变型有50 bp和100 bp的条带。
练模拟·提能力3.(2023·福建厦门模拟)下表为四种限制酶所识别的核苷酸序列及相应的切割位置(箭头所指),
下列叙述正确的是(　　)A.①②③④可催化磷酸二酯键和氢键断裂,形成黏性末端B.①切出的DNA片段,只有用E.cli连接酶才能连接起来C.②③切出的末端连接后形成的片段,不能再被②或③识别切割D.构建基因表达载体时,用②③进行双酶切,可防止目的基因与载体的反向连接
解析 ①②③④均为限制酶,可催化磷酸二酯键的断裂,不能催化氢键的断裂,且均形成黏性末端,A项错误;①切出的DNA片段,带有黏性末端,用E.cli连接酶和T4 DNA连接酶均能连接起来,B项错误;②③切出的黏性末端相同,用DNA连接酶连接后形成的片段的碱基序列为5'-GGATCT-3' 3'-CCTAGA-5',因而不能再被②或③识别切割,C项正确;构建基因表达载体时,用②③进行双酶切,因为这两种限制酶切出的黏性末端是相同的,不能防止目的基因与载体的反向连接,D项错误。
4.(2023·河北衡水二模)盐胁迫会影响植物的生长,可用转基因技术提高植物的耐盐能力。mybx是响应盐胁迫的关键转录因子,其功能缺失突变体对150 mml/L的NaCl高度敏感。HKT1基因表达的Na+转运蛋白介导Na+从木质部导管到木质部薄壁细胞的运输,减少木质部的Na+含量,从而提高植物的耐盐能力。科研人员构建HKT1基因的表达载体获得HKT1基因表达菌体,构建过程如图所示。四种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题。
(1)将拟南芥细胞破碎提取RNA时,需要在溶液中加入　　　　　　　　,以防止RNA降解。过程③要选择合适的限制酶切割含HKT1基因的DNA片段,应选用的表中的限制酶是　　　　　 　。 (2)过程⑤将重组质粒导入大肠杆菌。在筛选含有HKT1基因的大肠杆菌时,除必要的营养物质,还需要在培养基中添加　　 　　。提取重组质粒A将其导入农杆菌,用农杆菌侵染拟南芥mybx突变体花序,农杆菌的作用是　  　。(3)检测转HKT1基因拟南芥mybx突变株是否表达出Na+转运蛋白时,可用　　　　　　　　技术进行检测。若Na+转运蛋白高度表达,还需要进一步鉴定其抗性程度,实验的思路是　  　。 将转基因突变株种植在施加了浓度为150 mml/L的NaCl溶液的土壤中,检测木质部薄壁细胞的含盐量和植株的生长状况
携带HKT1基因进入拟南芥细胞,并使HKT1基因在细胞内维持稳定和表达
解析 (1)提取RNA时,为防止RNA被RNA酶催化水解,需要加入RNA酶抑制剂;根据图中的HKT1基因两端的黏性末端序列,可知分别使用限制酶HindⅢ、Xh Ⅰ,可获得与HKT1基因两端的黏性末端相同的序列,有相同的黏性末端在进行基因表达载体的构建时能够进行碱基互补配对。(2)在构建重组质粒时,氨苄青霉素抗性基因被限制酶XhⅠ切割而失去功能,卡那霉素抗性基因正常,因此培养基中需要加入卡那霉素,以筛选含目的基因的受体细胞;利用农杆菌侵染将重组质粒导入受体细胞,农杆菌能够携带HKT1基因进入拟南芥细胞,并使HKT1基因在细胞内维持稳定和表达。(3)检测目的基因是否翻译成蛋白质采用抗原—抗体杂交技术;进一步鉴定其抗性程度是否与原本的高敏感不同,将转基因突变株种植在施加了浓度为150 mml/L的NaCl溶液的土壤中,检测木质部薄壁细胞的含盐量和植株的生长状况,可进一步鉴定其抗性程度。
角度2 借助蛋白质工程及其应用,考查生命观念和科学思维练真题·明考向5.(2022·湖南卷)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。回答下列问题。(1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是　　　　　,物质b是　　　　　。在生产过程中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是　　　　　　　　　。 
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有　　　　　　、　　　　 　　和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是　　　　　　　　　。 
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的　　　　　(填“种类”或“含量”)有关,导致其活性不同的原因是　  　。 
提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同,导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,简要写出实验设计思路:   　。 取三支试管,分别放入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素,再分别加入等量的同一动物的新鲜血液,静置一段时间后,观察三支试管中血液凝集情况
解析 (1)根据蛋白质工程的原理可知,物质a是多肽链,物质b是mRNA,由于密码子的简并性,密码子不同,合成的蛋白质空间构象也可能相同。(2)基因工程中获取目的基因的方法有PCR技术扩增、化学合成法、cDNA法以及从基因文库中获取等。PCR技术的原理是DNA双链复制。(3)根据图解可以看出,两种肽的含量差异不大,因此主要是种类的差异。导致两种酶解产物抗凝血活性不同的原因可能是提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同,导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。(4)取三支试管,分别放入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素,再分别加入等量的同一动物的新鲜血液,静置一段时间后,观察三支试管中血液凝集情况。
角度拓展 (1)将人胰岛素A链上1个天冬氨酸替换为甘氨酸,B链末端增加2个精氨酸,可制备出一种人工长效胰岛素。该胰岛素可通过基因工程方法生产。[2022·重庆卷](　　)(2)利用蛋白质工程技术在腈水合酶(N0)的α和β亚基之间加入一段连接肽,可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)。加入连接肽需要通过改造基因实现。[2021·辽宁卷](　　)
练模拟·提能力6.(2023·北京朝阳二模)利用蛋白质工程改造源于溶珊瑚弧菌的几丁质酶:保留该酶N端,在C端增加陆生真菌几丁质结合保守域,从而增加酶与底物的结合能力。改造后的酶活性显著高于市售几丁质酶。下列相关叙述错误的是(　　)A.几丁质是海洋中含量丰富的多糖之一B.溶珊瑚弧菌通过分泌几丁质酶获取氮源C.直接操作对象是溶珊瑚弧菌的几丁质酶基因D.表达改造后的几丁质酶需要借助于受体细胞
解析 几丁质也是一种多糖,又称为壳多糖,广泛存在于甲壳类动物和昆虫的外骨骼中,几丁质是仅次于纤维素的第二大可再生资源,也是海洋中含量丰富的多糖之一,A项正确;酶的作用是催化,溶珊瑚弧菌通过分泌几丁质酶,几丁质酶催化几丁质的水解,从而获取碳源,B项错误;蛋白质工程操作的对象为基因,结合题干可知直接操作对象是溶珊瑚弧菌的几丁质酶基因,C项正确;改造的为几丁质酶基因,改造后的基因需要表达,需要导入相应的受体细胞中,经转录翻译后合成相应蛋白质,D项正确。
7.(2023·湖南张家界二模)T4溶菌酶来源于T4噬菌体,是重要的工业用酶。科学家通过一定技术使T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱氨酸(异亮氨酸的密码子是AUU、AUC、AUA,半胱氨酸的密码子是UGU、UGC),于是在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键,从而使T4溶菌酶的耐热性得到了提高。下列叙述正确的是(　　)A.对T4溶菌酶的改造属于发酵工程的范畴B.参与新的T4溶菌酶合成的tRNA种类一定会发生改变C.改造后的T4溶菌酶中的二硫键的作用类似于DNA中的氢键D.上述改造通过替换T4溶菌酶DNA上的1个碱基对即可实现
解析 对蛋白质分子的设计和改造是通过蛋白质工程来实现的,故对T4溶菌酶的改造属于蛋白质工程的范畴,A项错误;改造前组成T4溶菌酶的氨基酸中含有异亮氨酸和半胱氨酸,改造后组成T4溶菌酶的氨基酸中可能仍含有异亮氨酸和半胱氨酸,因此参与其合成的tRNA种类可能不变,B项错误;改造后的T4溶菌酶多了一个二硫键,二硫键使T4溶菌酶的耐热性提高,DNA分子中氢键越多,热稳定性越强,二者作用类似,C项正确;要将T4溶菌酶的异亮氨酸变为半胱氨酸,两种氨基酸最接近的密码子是AUU和UGU,或AUC和UGC,至少相差两个碱基,由于DNA是双链结构,故对应的DNA上的碱基至少要替换2个碱基对才能实现对应氨基酸的转变,D项错误。
专项命题——重培优【从新教材角度命题】PCR技术及其应用命题要点 PCR技术是利用DNA半保留复制原理,在体外扩增DNA分子的一种分子生物学技术,主要用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。PCR技术应用广泛,是近几年高考试题的命题热点,其操作原理、过程和应用分析如下:
练真题·明考向1.(2023·浙江卷)某研究小组利用转基因技术,将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只,交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型,设计了引物1和引物2用于PCR扩增,PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是(　　)A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达B.翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白C.2号条带的小鼠是野生型,4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子
解析 由题图甲可知,启动子可以启动Gata3基因转录,GFP基因整合在了Gata3基因的下游,所以Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达,A项错误。因GFP基因整合在了Gata3基因的下游,故转录时先合成Gata3基因的mRNA再合成GFP基因的mRNA,翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白,B项正确。整合GFP基因后,核酸片段变长,2号个体只有大片段,是Gata3-GFP基因纯合子,4号个体只有小片段,是野生型,C项错误。用引物1和引物3进行PCR扩增,野生型小鼠不能得到扩增产物,杂合子和Gata3-GFP基因纯合子都只能扩增出大片段,无法区分纯合子和杂合子,D项错误。
2.(2023·山东卷)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示,其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是　　　　　　　。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有__________________________________(答出2个结构即可)。(2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物　　 　　。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的　　　　　　　　(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。 (3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了　　　　　　　　,条带2所检出的蛋白　　　　　(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。 
复制原点、标记基因、限制酶切割位点
F1和R2或者F2和R1
解析 (1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位;质粒作为载体,必须具备启动子、终止子、标记基因、复制原点和限制酶切割位点等。(2)为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,可对J基因和质粒中原部分序列进行PCR扩增,则可选择F1和R2或者F2和R1作为引物;据“J基因转录的模板链位于b链”可判断左端为b链的3'-端,引物F1的左端为5'-端,可推知引物F1与b链间碱基互补配对,其与图甲中J基因的a链相应部分的序列相同。(3)据图乙可知,条带1既可与抗J蛋白抗体结合,又可与抗V5抗体结合,可推测出现条带1证明该细胞内合成了J蛋白和V5蛋白,即表达了J-V5融合蛋白;条带2只用抗J蛋白抗体检测出现,而用抗V5抗体检测未出现,说明该细胞表达的是单一的J蛋白,而非J-V5融合蛋白,可推测该J蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
练模拟·提能力3.(2023·福建厦门模拟)下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况,①②③④表示相关物质,L、R表示方向。下列叙述正确的是(　　)A.②链从L到R的方向为3'→5',①②链均可作为子链合成的模板B.PCR过程需要通过解旋酶断开氢键,且为边解旋边复制C.以1个DNA为模板经3次循环需消耗8个引物③D.物质③的5'端添加了某序列,至少需经2次循环才可获得该序列的双链产物
解析 根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断,②链从L到R的方向为5'→3',图中①②链均可作为子链合成的模板,A项错误;PCR过程需要通过高温处理使双链中氢键断裂成为单链,并且是全部解旋后,与引物结合再复制,B项错误;以1个DNA为模板经3次循环产生的DNA分子数目为23=8,则需消耗引物③的数目为(8×2-2)÷2=7(个),C项错误;物质③的5'端添加了某序列,至少需经2次循环才可获得以该序列为模板合成的双链DNA产物, D项正确。
【从新情境角度命题】基因编辑技术及其应用命题情境 CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑,其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定的碱基序列互补,从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合,并在特定位点切割DNA。CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物,与传统的基因工程相比,其明显优点是避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。
【命题角度】(1)从功能上来看,CRISPR/Cas9系统相当于基因工程中的限制性内切核酸酶,该系统广泛存在于细菌中,其在细菌中的作用是　　 　　　。 切割外源DNA,使之失效,起到保护自身的目的(或抵抗外源DNA的入侵,保护自身或清除入侵病毒DNA)(2)CRISPR/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而“脱靶”的现象, sgRNA的识别序列越短,基因编辑的脱靶率就越高。请分析原因。sgRNA的识别序列短,特异性差,容易与其他DNA片段结合造成编辑出错
练真题·明考向4.(2021·海南卷)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术,Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”,在单链向导RNA(sgRNA)引导下,切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。(1)过程①中,为构建CRISPR/Cas9重组质粒,需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理,然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上,插入时所需要的酶是　　　　　　　　。 (2)过程②中,将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是　　　　　　　　。(3)过程③~⑤中,sgRNA与Cas9蛋白形成复合体,该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合,二者结合所遵循的原则是　　　 　　 　。随后,Cas9蛋白可切割　　　　　　 　序列。 
目标DNA特定的核苷酸
(4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp的基因,在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是　　　　　　　　　,基因敲除成功的判断依据是　　　　　　　　　。 (5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒,随后将其导入大肠杆菌细胞,通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中,构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内,将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程:   　。CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达,转录的产物是sgRNA,表达的产物是Cas9蛋白,二者形成复合体,该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合,从而将该蛋白酶基因插入到基因组DNA中
解析 (1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶,限制酶负责切割,DNA连接酶负责连接,因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒,需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理,然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上,插入时所需要的酶是DNA连接酶。(2)大肠杆菌是原核生物,属于微生物,将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。(3)根据题意可知,在CRISPR/Cas9基因编辑技术中,sgRNA是根据靶基因设计的向导RNA,能准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助sgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于sgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现sgRNA与目标DNA特定序列的特定识别,进而定位;由此可见,Cas9在功能上属于限制酶,可切割目标DNA特定的核苷酸序列。
(4)可利用DNA分子杂交技术判断基因敲除是否成功,若不出现杂交带,则说明基因敲除成功。(5)根据图示可知:CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达,转录的产物是sgRNA,表达的产物是Cas9蛋白,二者形成复合体,该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合,从而将该蛋白酶基因插入到基因组DNA中。
练模拟·提能力5.(2023·山西校联考模拟)CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术,可用于基因敲除、定向基因突变和插入外源DNA分子。CRISPR具有靶向特异性,这是由两部分决定的,一部分是向导RNA和靶DNA之间的碱基配对,另一部分是Cas9蛋白复合体和一个短DNA序列(PAM序列),序列通常在靶DNA的3'末端作用。Cas9内切酶是一种RNA引导的内切核酸酶,用于通过产生序列特异性双链断裂进行基因组编辑,向导RNA则作用于体内一种称为RNA编辑的后转录修饰过程中。下图为借助CRISPR/Cas9基因编辑技术插入外源基因的过程图,回答下列问题。
(1)CRISPR是在细菌DNA中发现的一些重复序列,外来病毒DNA往往会被整合到这段序列附近并转录出向导RNA以引导Cas9内切酶切割病毒DNA。细菌细胞中的　　　　　　　也能起到类似Cas9内切酶的作用,使脱氧核苷酸之间的　　　　　　　断开。Cas9内切酶　　　　(填“会”或“不会”)切割细菌自身DNA,原因是　   　。转录产生的向导RNA来自病毒DNA序列,能与病毒DNA碱基互补配对,引导Cas9内切酶切割病毒DNA 
(2)在对目的细胞进行基因编辑时,需要构建含Cas9蛋白基因和设计好的向导RNA基因的　　　　　并导入受体细胞内,使其在细胞中表达出Cas9蛋白和向导RNA,并进入细胞核发挥作用。研究发现,即便向导RNA与目的序列完全互补,在PAM序列突变的情况下也无法引导Cas9内切酶,结合上图推测PAM序列的作用是　  　。 PAM序列通过与靶DNA的3'末端特异性结合后才能使CRISPR/Cas9发挥作用
(3)真核细胞的DNA被切割后,会发生修复连接,便有可能实现连人供体DNA分子。若要利用CRISPR/Cas9技术敲除实验动物某个致病基因获得正常细胞,试提出操作思路:  　 。 测定致病基因上游和下游的序列并设计好对应向导RNA和PAM序列,将两种表达载体都导入受体细胞,对致病基因的上游和下游都进行切割,修复后有一定概率得到致病基因被敲除的正常细胞
解析 (1)细菌细胞中的限制性内切核酸酶与Cas9内切酶类似,都能使脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开;Cas9内切酶不会切割细菌自身DNA分子,根据信息,病毒DNA整合到CRISPR序列后才会转录出向导RNA以指导Cas9内切酶特异性切割病毒DNA。(2)导入受体细胞前需要构建基因表达载体(基因工程的核心步骤)。分析题意可得,向导RNA与目的序列在序列上是完全互补的,在PAM序列突变的情况下也无法引导Cas9内切酶,结合图示可推测,PAM是通过与靶DNA的3'末端特异性结合后才能使CRISPR/Cas9发挥作用。(3)结合题干信息,DNA分子会发生修复连接以一定概率连入供体DNA分子。若要实现敲除目的基因,可测定致病基因上游和下游的序列并设计好对应向导RNA和PAM序列,将两种表达载体都导入受体细胞,对致病基因的上游和下游都进行切割,修复后有一定概率得到致病基因被敲除的正常细胞。
长句表达(六)　基因工程类大题突破
(2022·山东卷)某种类型的白血病由蛋白P引发,蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解,药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理,需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽,连接在P或P△的氨基端,使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合,但不影响P或P△的功能。　(1)为构建重组载体,需先设计引物,通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是______________________________________　　　　　　　　。为使PCR产物能被限制酶切割,需在引物上添加相应的限制酶识别序列,该限制酶识别序列应添加在引物的　　　　(填“3'端”或“5'端”)。 
能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后,与编码FLAG的序列形成一个融合基因,如图甲所示,其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后,融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析,出现该问题的原因是____________________________________　　　　　　　　　　　 　　　　　　。修改扩增P基因时使用的带有EcRⅠ识别序列的引物来解决该问题,具体修改方案是　    　 。 
P基因编码链的第一个碱基与EcRⅠ识别
序列的最后两个碱基编码一个氨基酸,导致mRNA的密码子被错位读取
在引物中的EcRⅠ识别序列3'端添加1个碱基
(3)融合蛋白表达成功后,将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质,分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测,检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC,由①②③组结果的差异推测,药物A的作用是　　　　　　　　　　　　　;由②④组或③⑤组的差异推测, P△中缺失的特定序列的作用是　  　 。 
增强FLAG-P与UBC的结合
(4)根据以上结果推测,药物A治疗该病的机理是  　 。药物A通过增强P与UBC结合促进P降解 
(2)逻辑推理与论证。
原理阐释类1.目前在PCR反应中使用TaqDNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是 　 。提示 Taq DNA聚合酶热稳定性高,而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活2.若要使目的基因在受体细胞中表达,需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞,原因是  　。提示 目的基因无复制原点;目的基因无表达所需的启动子