备课素材知识点：如何判断细胞的活性 高中生物人教版必修1

这是一份备课素材知识点：如何判断细胞的活性 高中生物人教版必修1，共5页。学案主要包含了染色计数法，克隆形成试验，比色法等内容，欢迎下载使用。
染色计数法是细胞培养中检查细胞死活最常用的方法，直接利用死细胞和活细胞对染料的不同亲和力，检查细胞活性，能在光学显微镜下观察到染色结果。可分为两类：死细胞着色法和活细胞着色法。使死细胞着色的常用染料有台盼蓝、苯胺黑、伊红Y。能使活细胞着色的常用染料有结晶紫、亚甲基蓝、甲苯胺蓝等。其中最常用的是台盼蓝染色法。细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色，而活细胞能阻止染料进入细胞内，故可以鉴别死细胞与活细胞。通过细胞计数可得出细胞的存活率。
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本染色法方便实用，价格低廉，操作简单。但是台盼蓝染色时，时间不宜过长，否则部分活细胞也会着色，会干扰计数。而且，细胞没有经过固定，形态不清晰。
2. 荧光染色法
一些荧光染料对死细胞和活细胞也有不同的作用效果，利用荧光显微镜检测细胞活性。如碘化丙啶（PI），被活细胞排斥但能穿透正在死亡或已经死亡细胞的细胞膜，因此活细胞不被染料上色，只有死细胞或凋亡细胞才能被染上红色。吖啶橙（AO）能透过质膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。溴乙锭（EB）仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。也可应用AO-EB双染法鉴定细胞死活。
这种检测方法相比传统的染料，具有灵敏度高，操作简便，结果容易分辨等特点，而且利用双染法还可以分辨活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞、死亡细胞。在细胞凋亡的检测上有很广泛的应用。
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缺点在于，要求特殊的仪器进行检测，如荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜或流式细胞仪。而且通过荧光染料具有毒性，操作时需要带手套。
二、克隆（集落）形成试验
克隆形成试验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续分裂增殖6次以上，其后代所组成的细胞群体，称为克隆或集落。一般情况，每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3~1.0mm3之间。通过计算克隆形成率，可对单个细胞的增殖潜力做定量分析。常见的方法有平板克隆形成试验、软琼脂形成试验等。
这种方法常见于抗肿瘤药物敏感性试验，肿瘤放射生物学试验等。虽然该方法比MTT和SRB法的敏感性更强。但是该方法较为繁琐并耗时，不适合同时监测大量样品，而且在手动计数过程中带有非常大的不确定性，特别是当形成的细胞克隆大小差异较大时，很难得到更有效、精确的数据。无分解能力的细胞也无法用该法检测活性。
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三、比色法
1.MTT法
又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Frmazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。MTT方法很简单、快捷、准确地测定细胞的增殖反应，而且能避免由于人为操作因素造成试验误差，大大地提高了实验结果的准确性和重现性。MTT方法目前大多用于检测培养细胞的生长和增殖、新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤细胞敏感性试验等。加之其价格低廉，成为目前各实验室检测细胞活性的首选方法之一。
2. Alamar Blue法
Alamar Blue是一种安全、稳定、易溶于水且对细胞无毒的新型染料，可通过荧光产生或颜色变化指示细胞的代谢。活细胞线粒体酶能够将蓝色的氧化形式Alamar Blue变成红色的还原形式，同时发生可量化的荧光变化，无活性的细胞不能还原Alamar Blue。荧光的强度或红色的强度反映了细胞增殖的程度，其颜色变化可用酶标仪测定；荧光变化可用荧光测定仪检测，激发波长530nm，散色波长590nm，使用荧光方法时具有更优秀的敏感性。在细胞浓度比较低的情况下，Alamar Blue法比MTT法具有更高的灵敏性。
3. 乳酸脱氢酶（LDH）释放法
LDH是活细胞浆内酶，当细胞损伤，细胞膜通透性变化时，会将LDH释放到培养液中。因此培养液中该酶的活性与被裂解的细胞数量成正比。由LDH催化的酶促反应在催化乳酸生成丙酮酸的过程中使氧化型辅酶I（NAD）变成还原型辅酶I（NADH+H），后者再通过递氢体一吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化四氯唑（INT），INT接受氢离子被还原成紫红色的化合物，酶标仪检测其OD值。与结晶紫染色法和MTT比色法进行灵敏度、重复性和相关性比较，该法简便，灵敏度高，敏感性、客观性、试剂成本及测定速度等都要优于结晶紫染色法和MTT比色法。
4. ATP含量测定法
内源性ATP是活体细胞最基本的能量来源，细胞死亡时，ATP迅速水解。因此，测定内源性ATP的含量可以及时反映细胞的活性和活细胞的数量。其原理是，活细胞在有氧和ATP的条件下，荧光酶催化荧光素发出荧光（波长为562nm），强度与ATP含量呈正相关。故所测得的荧光强度可间接反映出存活细胞量。
5.放射性检测法
细胞中的蛋白质的合成与细胞核内DNA的复制是细胞增殖的基本前提，通过测定细胞DNA和蛋白质的合成代谢状态，也可判断细胞的生活状态。检测蛋白质合成一帮用放射性核素35S-甲硫氨酸标记，检测DNA复制一般用3H-TdR标记，此方法又称为同位素掺入法。以3H-TdR掺入法为例，胸腺嘧啶脱氧核苷（TdR）是DNA合成的原料，因此3H-TdR加入细胞培养液后，可被活细胞摄取，细胞增殖越多，所掺入的3H-TdR量就越大。检测细胞的3H-TdR放射性强度就可反映出细胞活力及增殖状况。

细胞有活性意味着细胞结构与功能保持正常状态，可通过检测细胞内外特定活性成分分布及含量（膜结构与功能是否完好、活性蛋白能否合成、能量供应是否正常等）、DNA复制及细胞增殖等具体的指标作为判断细胞活性的依据。