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第1章 发酵工程（考点串讲）-2023-2024学年高二生物下册期中期末专题高分突破
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这是一份第1章 发酵工程（考点串讲）-2023-2024学年高二生物下册期中期末专题高分突破，共13页。
[主干知识]
一、发酵与传统发酵技术
1．发酵：指人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。
2．传统发酵技术
直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术一般称为传统发酵技术。
二、腐乳、泡菜、果酒和果醋的制作原理
1．腐乳的制作
(1)菌种：酵母、曲霉、毛霉等，起主要作用的是毛霉。
(2)发酵原理：豆腐中的蛋白质经毛霉等微生物发酵分解成小分子的肽和氨基酸。
2．泡菜的制作
(1)菌种：乳酸菌。
eq \b\lc\{\rc\ (\a\vs4\al\c1(分布：广泛分布在空气、土壤、植物体表、人或动物的, 肠道内等,代谢类型：异养厌氧型,常见种类：乳酸链球菌和乳酸杆菌,利用：可用于乳制品的发酵、泡菜的腌制等))
(2)发酵原理：乳酸菌在无氧的情况下，将葡萄糖分解成乳酸。反应式：
C6H12O6eq \(――→,\s\up7(酶))2C3H6O3(乳酸)＋能量。
3．果酒的制作
(1)菌种：酵母菌。
eq \b\lc\{\rc\ (\a\vs4\al\c1(分布：含糖量较高的水果、蔬菜表面等,代谢类型：异养兼性厌氧型,最适生长温度：约为28 ℃酿酒酵母,利用：可用于酿酒、制作馒头和面包等))
(2)发酵原理：酵母菌在无氧条件下，进行酒精发酵，产生酒精。反应式：
C6H12O6eq \(――→,\s\up7(酶))2C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量。
4．果醋的制作
(1)菌种：醋酸菌。
eq \b\lc\{\rc\ (\a\vs4\al\c1(代谢类型：异养需氧型,最适生长温度：30～35 ℃,利用：可用于制作各种风味的\a\vs4\al(醋)))
(2)发酵原理
①当O2、糖源都充足时，醋酸菌能将糖分解成乙酸。
反应式：C6H12O6＋2O2eq \(――→,\s\up7(酶))2CH3COOH(乙酸)＋2H2O＋2CO2＋能量。
②当缺少糖源时，醋酸菌则将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为乙酸。反应式：
C2H5OH＋O2eq \(――→,\s\up7(酶))CH3COOH(乙酸)＋H2O＋能量。
三、制作泡菜、果酒和果醋的实验流程
1．制作泡菜的实验流程
2．制作果酒和果醋的实验流程
[易错辨析]
:
(1)传统发酵以混合菌种的液体发酵为主，通常是工厂式生产(×)
(2)制备泡菜时，盐水煮沸后可以立即使用(×)
(3)泡菜的制作前期需要通入氧气，后期应严格保持无氧条件(×)
(4)酵母菌是嗜温菌，所以果酒发酵所需的最适温度高于果醋发酵温度(×)
(5)为防止杂菌污染，要用无水乙醇擦拭发酵瓶(×)
(6)只有在糖源充足的情况下才能进行醋酸发酵(×)
(7)在利用葡萄发酵生产果酒的后期，加入醋酸菌即可产生醋酸(×)
第2节 微生物的培养技术及应用
[主干知识]
一、培养基
1．概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
2．种类(按物理性质分)
液体培养基eq \(――→,\s\up7(加入凝固剂，常用琼脂),\s\d5( ))固体培养基
3．营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
二、无菌技术
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染，无菌技术主要包括消毒和灭菌。二者的区别如下表所示。
三、微生物的纯培养
1．相关概念
(1)培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
(2)纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。
(3)纯培养：获得纯培养物的过程就是纯培养。
2．酵母菌的纯培养
四、选择培养基
1．微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2．选择培养基：在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
五、微生物的选择培养
eq \x(土壤取样)―→eq \x(梯度稀释)―→eq \x(涂布平板)―→eq \x(培养观察)
六、微生物的数量测定
1．稀释涂布平板法
(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)注意事项
①一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
②通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30～300、适于计数的平板。
③在同一稀释度下，应至少对eq \a\vs4\al(3)个平板进行重复计数，然后求出平均值。
④统计的菌落数往往比活菌的实际数目eq \a\vs4\al(少)。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
2．测定微生物数量的另一种常用方法：显微镜直接计数法。
七、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
2．实验设计
(1)土壤取样：铲去表层土，在距地表3～8 cm的土壤层取样。
(2)样品的稀释：测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养。
(3)微生物的培养与观察：细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d。每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
[易错辨析]
(1)所有的培养基中都要加入琼脂(×)
(2)微生物在液体培养基中生长可形成菌落(×)
(3)获得纯净微生物培养物的关键是防止杂菌污染(√)
(4)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用湿热灭菌法进行灭菌(×)
(5)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落(×)
(6)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类(×)
(7)稀释涂布平板法既能分离细菌，也能对细菌进行计数(√)
(8)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素(√)
(9)筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的唯一氮源(√)
发酵工程及其应用
[主干知识]
一、发酵工程的概念
发酵工程是指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。
二、发酵工程的基本环节
三、发酵工程的应用
1．在食品工业上的应用
(1)生产传统的发酵产品，如酱油和各种酒类。
(2)生产各种各样的食品添加剂，如柠檬酸和谷氨酸等。
(3)生产酶制剂，如α淀粉酶、β淀粉酶、果胶酶、氨基肽酶和脂肪酶等。
2．在医药工业上的应用
生产抗生素、多种氨基酸、激素和免疫调节剂等。
3．在农牧业上的应用
(1)生产微生物肥料，如根瘤菌肥、固氮菌肥等。
(2)生产微生物农药，如苏云金杆菌、白僵菌、井冈霉素等。
(3)生产微生物饲料，如单细胞蛋白。
4．在其他方面的应用
(1)利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等能源物质。
(2)嗜热菌、嗜盐菌可以用来生产洗涤剂，嗜低温菌有助于提高热敏性产品的产量。
[易错辨析]
(1)发酵是指利用微生物的生命活动来获得各种不同代谢产物的过程(×)
(2)发酵工程中，温度和pH的改变会影响微生物的代谢途径(√)
(3)单细胞蛋白就是从人工培养的微生物菌体中提取的蛋白质(×)
(4)发酵工程一般用半固体培养基(×)
本章重难点讲解
一、传统发酵技术中常用菌种的比较
二、果酒制作与果醋制作的比较
三、制作果酒和果醋的发酵装置分析
四、泡菜制作的注意事项
(1)泡菜坛的选择：应选择火候好、无裂纹、无砂眼、坛沿深、盖子吻合好的泡菜坛。
(2)盐水按水盐质量比为4∶1配制，煮沸冷却后待用。煮沸有两大作用，一是除去水中的氧气，二是杀灭盐水中的细菌。
(3)材料装至八成满时，再加入盐水至没过全部菜料，盖好坛盖。
(4)封坛时，坛盖边沿的水槽中要注满水，严格密封，以保证乳酸菌发酵所需的无氧环境，并注意在发酵过程中经常补水。
(5)注意控制温度、食盐水浓度和发酵时间。温度过高，食盐水浓度低于10%，腌制时间过短，会造成其他细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量升高。一般亚硝酸盐含量在泡菜腌制10 d后开始下降。食盐水浓度过高，会使泡菜口味不佳，甚至影响乳酸菌的发酵。
五、果酒和果醋制作成功的关键
六、泡菜腌制中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化
七、培养基配制的原则
(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。营养物质浓度过低不能满足微生物营养需要，过高对微生物的生长有抑制作用。
(3)pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同，如细菌的适宜pH为6.5～7.5、放线菌的适宜pH为7.5～8.5、真菌的适宜pH为5.0～6.0。为维持pH的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，常用的缓冲剂是磷酸氢二钾磷酸二氢钾。
八、培养基的成分
九、动物、微生物和绿色植物所需营养物质的比较
十、几种常用灭菌和消毒方法的比较
十一、倒平板操作的注意事项
(1)培养基要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。
(2)要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
(3)倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。
(4)平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，培养基表面的温度也较高，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分更快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
(5)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板不能用来培养微生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
(6)整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。
十二、平板划线操作的注意事项
(1)灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
(2)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个菌种繁殖而来的菌落。
(3)划线时最后一区不要与第一区相连。
(4)划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
(5)操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的如下表：
十三、选择培养基与鉴别培养基
十四、平板划线法和稀释涂布平板法的区别
十五、两种微生物计数方法的比较
十六、分离尿素分解菌操作中的注意事项
(1)在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。
(2)样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上最终有30～300个菌落，细菌一般为104、105、106倍的稀释液，放线菌一般为103、104、105倍的稀释液，真菌一般为102、103、104倍的稀释液。
(3)为排除非测试因素(培养基)的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。
(4)每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为实验重复，求其平均值，若其中有菌落数与其他实验差距悬殊的，需要对该平板进行重新制作。
(5)注意培养时间和温度，获取准确的菌落数。细菌：30～37 ℃，培养1～2 d；放线菌：25～28 ℃，培养5～7 d；霉菌(真菌)：一般在25～28 ℃，培养3～4 d。
(6)微生物的菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。仔细观察分离到的菌落，记录它们的特征。
十七、结果分析与评价
消毒
灭菌
概念
使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物
使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
适用对象
操作空间、操作者的衣着和手等
微生物培养的器皿、接种用具和培养基等
常用方法
煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药物消毒法和紫外线消毒法
湿热灭菌(其中高压蒸汽灭菌的效果最好)、干热灭菌、灼烧灭菌
微生物
酵母菌
醋酸菌
乳酸菌
分类
真核生物
原核生物
原核生物
代谢类型
异养兼性厌氧
异养需氧
异养厌氧
适宜温度
18～30 ℃
30～35 ℃
室温
发酵条件
前期需氧；后期不需氧
一直需氧
无氧
生殖方式
孢子生殖，适宜条件下出芽生殖
二分裂生殖
二分裂生殖
生产应用
酿酒、发面
酿醋
制作酸奶、泡菜
果酒制作
果醋制作
发酵菌种
酵母菌
醋酸菌
菌种来源
传统的葡萄酒酿造采用自然发酵，菌种主要是附着在葡萄皮上的野生型酵母菌
购买醋酸菌的菌种或从食醋中分离醋酸菌
发酵产物
酒精、二氧化碳
乙酸、水或二氧化碳
发酵条件
温度
一般控制在18～30 ℃
30～35 ℃
时间
10～12 d
7～8 d
氧气
初期需氧，
后期不需氧
始终需要氧
pH
最适pH为4.5～5.0
最适pH为5.4～6.0
制作原理
项目
说明
材料的选择与处理
选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄进行冲洗，再去除枝梗，以防葡萄汁流失及污染。冲洗以洗去灰尘为目的，以防洗去野生型酵母菌
防止发酵液被污染
①榨汁机和发酵瓶等器具用洗洁精清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒；
②清洗葡萄时要先清洗后除枝梗；
③发酵瓶排气管用曲颈管而不用直管
控制发酵条件
①葡萄汁装入发酵瓶时，要留有大约1/3的空间，目的是先让酵母菌进行有氧呼吸，快速繁殖，耗尽O2后再进行酒精发酵，并防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液的溢出；
②严格控制温度：18～30 ℃利于酵母菌的繁殖和酒精发酵；30～35 ℃利于醋酸菌的繁殖和果醋的发酵；
③充气：酒精发酵为无氧发酵，需关闭充气口；醋酸发酵为有氧发酵，需经充气口充气
发酵时期
乳酸菌数量
乳酸含量
亚硝酸盐含量
发酵初期
少(O2抑制乳酸菌活动)
少
增加(硝酸盐还原菌的作用)
发酵中期
最多(乳酸积累抑制其他菌活动)
增多
下降(硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解)
发酵后期
减少(乳酸积累，pH下降，抑制自身活动)
继续增多
下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制)
变化曲线
营养物质
定义
作用
主要来源
碳源
凡能提供碳元素的物质
构成生物体细胞的物质和一些代谢产物，有些也是异养生物的能源物质
无机碳源：NaHCO3、CO2等；
有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等
氮源
凡能提供氮元素的物质
合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物
无机氮源：N2、NH3、铵盐等；
有机氮源：尿素、牛肉膏等
生长因子
生长必不可少的微量有机物
是酶和核酸的组成成分
维生素、氨基酸、碱基等
水
—
不仅是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定
培养基、空气、代谢产物
无机盐
为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素和微量元素
是细胞的组成成分、生理调节物质、某些化能自养菌的能源、酶的激活剂等
无机化合物
营养物质
动物
(异养型)
微生物
绿色植物
(自养型)
异养型
自养型
碳源
糖类、脂肪、蛋白质等
糖、醇、有机酸等
二氧化碳、碳酸盐等
二氧化碳、碳酸盐等
氮源
蛋白质或其降解产物等
蛋白质或其降解产物、有机氮化物、无机氮化物
无机氮(硫)化物
无机氮化物
能源
与有机碳源相同
与有机碳源相同
氧化无机物或利用光能
利用光能
灭菌和消毒种类
主要方法
应用范围
灼烧灭菌
酒精灯火焰灼烧
微生物接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，以及接种过程中的试管口或瓶口等
干热灭菌
干热灭菌箱160～170 ℃加热2～3 h
玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等，凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品
湿热灭菌
高压蒸汽灭菌锅内100 kPa、121 ℃维持15～30 min
培养基及多种器材、物品
煮沸消毒法
100 ℃煮沸5～6 min
家庭餐具等生活用品的消毒
巴氏消毒法
62～65 ℃消毒30 min或80～90 ℃处理30 s～1 min
牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体
紫外线消毒
30 W紫外灯照射30 min
接种室、接种箱、超净工作台
化学药物
消毒
用体积分数为70%～75%的酒精、碘酒涂抹，来苏尔喷洒等
用于皮肤、伤口、动植物组织表面的消毒和空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等的消毒
第一次操作
每次划线之前
划线结束
目的
杀死接种环上原有的微生物
杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少
杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
项目
选择培养基
鉴别培养基
特殊成分
加入某种化学物质
加入某种指示剂或化学药品
目的
抑制或阻止其他微生物生长，促进目的微生物生长
与微生物的代谢产物或培养基中的成分发生特定反应
用途
培养、分离出特定微生物
鉴别不同的微生物
举例
培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素作唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌
可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈黑色)
比较项目
平板划线法
稀释涂布平板法
关键操作
接种环在固体培养基表面连续划线
①一系列的梯度稀释
②涂布平板操作
注意事项
每次划线前后均需灼烧接种环
稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加稀释度的范围
菌体获取
在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
优点
可根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落
既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
缺点
不能对微生物计数
操作复杂，需要涂布多个平板
平板示意图
比较项目
间接计数法(稀释涂布平板法)
直接计数法
(显微计数法)
原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式
每克样品中的菌落数＝eq \f(C,V)×M
C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数
每毫升原液所含细菌数：每小格内平均细菌数400×104×稀释倍数
缺点
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
不能区分细胞死活
结果
比实际值偏小
比实际值偏大
内容
现象
结论
有无杂菌污染的判断
对照的培养皿中无菌落生长
未被杂菌污染
培养基中菌落数偏高
被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高
培养基中混入其他氮源
选择培养基的筛选作用
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目
选择培养基具有筛选作用
样品的稀释操作
得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板
操作成功
重复组的结果
若选取同一种土样，统计结果应接近
[主干知识]
一、发酵与传统发酵技术
1．发酵：指人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。
2．传统发酵技术
直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术一般称为传统发酵技术。
二、腐乳、泡菜、果酒和果醋的制作原理
1．腐乳的制作
(1)菌种：酵母、曲霉、毛霉等，起主要作用的是毛霉。
(2)发酵原理：豆腐中的蛋白质经毛霉等微生物发酵分解成小分子的肽和氨基酸。
2．泡菜的制作
(1)菌种：乳酸菌。
eq \b\lc\{\rc\ (\a\vs4\al\c1(分布：广泛分布在空气、土壤、植物体表、人或动物的, 肠道内等,代谢类型：异养厌氧型,常见种类：乳酸链球菌和乳酸杆菌,利用：可用于乳制品的发酵、泡菜的腌制等))
(2)发酵原理：乳酸菌在无氧的情况下，将葡萄糖分解成乳酸。反应式：
C6H12O6eq \(――→,\s\up7(酶))2C3H6O3(乳酸)＋能量。
3．果酒的制作
(1)菌种：酵母菌。
eq \b\lc\{\rc\ (\a\vs4\al\c1(分布：含糖量较高的水果、蔬菜表面等,代谢类型：异养兼性厌氧型,最适生长温度：约为28 ℃酿酒酵母,利用：可用于酿酒、制作馒头和面包等))
(2)发酵原理：酵母菌在无氧条件下，进行酒精发酵，产生酒精。反应式：
C6H12O6eq \(――→,\s\up7(酶))2C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量。
4．果醋的制作
(1)菌种：醋酸菌。
eq \b\lc\{\rc\ (\a\vs4\al\c1(代谢类型：异养需氧型,最适生长温度：30～35 ℃,利用：可用于制作各种风味的\a\vs4\al(醋)))
(2)发酵原理
①当O2、糖源都充足时，醋酸菌能将糖分解成乙酸。
反应式：C6H12O6＋2O2eq \(――→,\s\up7(酶))2CH3COOH(乙酸)＋2H2O＋2CO2＋能量。
②当缺少糖源时，醋酸菌则将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为乙酸。反应式：
C2H5OH＋O2eq \(――→,\s\up7(酶))CH3COOH(乙酸)＋H2O＋能量。
三、制作泡菜、果酒和果醋的实验流程
1．制作泡菜的实验流程
2．制作果酒和果醋的实验流程
[易错辨析]
:
(1)传统发酵以混合菌种的液体发酵为主，通常是工厂式生产(×)
(2)制备泡菜时，盐水煮沸后可以立即使用(×)
(3)泡菜的制作前期需要通入氧气，后期应严格保持无氧条件(×)
(4)酵母菌是嗜温菌，所以果酒发酵所需的最适温度高于果醋发酵温度(×)
(5)为防止杂菌污染，要用无水乙醇擦拭发酵瓶(×)
(6)只有在糖源充足的情况下才能进行醋酸发酵(×)
(7)在利用葡萄发酵生产果酒的后期，加入醋酸菌即可产生醋酸(×)
第2节 微生物的培养技术及应用
[主干知识]
一、培养基
1．概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
2．种类(按物理性质分)
液体培养基eq \(――→,\s\up7(加入凝固剂，常用琼脂),\s\d5( ))固体培养基
3．营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
二、无菌技术
获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染，无菌技术主要包括消毒和灭菌。二者的区别如下表所示。
三、微生物的纯培养
1．相关概念
(1)培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。
(2)纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。
(3)纯培养：获得纯培养物的过程就是纯培养。
2．酵母菌的纯培养
四、选择培养基
1．微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2．选择培养基：在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
五、微生物的选择培养
eq \x(土壤取样)―→eq \x(梯度稀释)―→eq \x(涂布平板)―→eq \x(培养观察)
六、微生物的数量测定
1．稀释涂布平板法
(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)注意事项
①一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
②通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数为30～300、适于计数的平板。
③在同一稀释度下，应至少对eq \a\vs4\al(3)个平板进行重复计数，然后求出平均值。
④统计的菌落数往往比活菌的实际数目eq \a\vs4\al(少)。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
2．测定微生物数量的另一种常用方法：显微镜直接计数法。
七、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
2．实验设计
(1)土壤取样：铲去表层土，在距地表3～8 cm的土壤层取样。
(2)样品的稀释：测定土壤中细菌的数量，一般选用1×104、1×105和1×106倍稀释的稀释液进行平板培养。
(3)微生物的培养与观察：细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d。每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
[易错辨析]
(1)所有的培养基中都要加入琼脂(×)
(2)微生物在液体培养基中生长可形成菌落(×)
(3)获得纯净微生物培养物的关键是防止杂菌污染(√)
(4)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用湿热灭菌法进行灭菌(×)
(5)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落(×)
(6)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类(×)
(7)稀释涂布平板法既能分离细菌，也能对细菌进行计数(√)
(8)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素(√)
(9)筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的唯一氮源(√)
发酵工程及其应用
[主干知识]
一、发酵工程的概念
发酵工程是指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。
二、发酵工程的基本环节
三、发酵工程的应用
1．在食品工业上的应用
(1)生产传统的发酵产品，如酱油和各种酒类。
(2)生产各种各样的食品添加剂，如柠檬酸和谷氨酸等。
(3)生产酶制剂，如α淀粉酶、β淀粉酶、果胶酶、氨基肽酶和脂肪酶等。
2．在医药工业上的应用
生产抗生素、多种氨基酸、激素和免疫调节剂等。
3．在农牧业上的应用
(1)生产微生物肥料，如根瘤菌肥、固氮菌肥等。
(2)生产微生物农药，如苏云金杆菌、白僵菌、井冈霉素等。
(3)生产微生物饲料，如单细胞蛋白。
4．在其他方面的应用
(1)利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等能源物质。
(2)嗜热菌、嗜盐菌可以用来生产洗涤剂，嗜低温菌有助于提高热敏性产品的产量。
[易错辨析]
(1)发酵是指利用微生物的生命活动来获得各种不同代谢产物的过程(×)
(2)发酵工程中，温度和pH的改变会影响微生物的代谢途径(√)
(3)单细胞蛋白就是从人工培养的微生物菌体中提取的蛋白质(×)
(4)发酵工程一般用半固体培养基(×)
本章重难点讲解
一、传统发酵技术中常用菌种的比较
二、果酒制作与果醋制作的比较
三、制作果酒和果醋的发酵装置分析
四、泡菜制作的注意事项
(1)泡菜坛的选择：应选择火候好、无裂纹、无砂眼、坛沿深、盖子吻合好的泡菜坛。
(2)盐水按水盐质量比为4∶1配制，煮沸冷却后待用。煮沸有两大作用，一是除去水中的氧气，二是杀灭盐水中的细菌。
(3)材料装至八成满时，再加入盐水至没过全部菜料，盖好坛盖。
(4)封坛时，坛盖边沿的水槽中要注满水，严格密封，以保证乳酸菌发酵所需的无氧环境，并注意在发酵过程中经常补水。
(5)注意控制温度、食盐水浓度和发酵时间。温度过高，食盐水浓度低于10%，腌制时间过短，会造成其他细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量升高。一般亚硝酸盐含量在泡菜腌制10 d后开始下降。食盐水浓度过高，会使泡菜口味不佳，甚至影响乳酸菌的发酵。
五、果酒和果醋制作成功的关键
六、泡菜腌制中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化
七、培养基配制的原则
(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。营养物质浓度过低不能满足微生物营养需要，过高对微生物的生长有抑制作用。
(3)pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同，如细菌的适宜pH为6.5～7.5、放线菌的适宜pH为7.5～8.5、真菌的适宜pH为5.0～6.0。为维持pH的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，常用的缓冲剂是磷酸氢二钾磷酸二氢钾。
八、培养基的成分
九、动物、微生物和绿色植物所需营养物质的比较
十、几种常用灭菌和消毒方法的比较
十一、倒平板操作的注意事项
(1)培养基要冷却到50 ℃左右时开始倒平板。温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。
(2)要使锥形瓶的瓶口通过酒精灯火焰。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
(3)倒平板时，要用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。
(4)平板冷凝后，要将平板倒置。因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，培养基表面的温度也较高，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分更快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
(5)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，那么这个平板不能用来培养微生物，因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
(6)整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。
十二、平板划线操作的注意事项
(1)灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
(2)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个菌种繁殖而来的菌落。
(3)划线时最后一区不要与第一区相连。
(4)划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
(5)操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的如下表：
十三、选择培养基与鉴别培养基
十四、平板划线法和稀释涂布平板法的区别
十五、两种微生物计数方法的比较
十六、分离尿素分解菌操作中的注意事项
(1)在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。
(2)样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上最终有30～300个菌落，细菌一般为104、105、106倍的稀释液，放线菌一般为103、104、105倍的稀释液，真菌一般为102、103、104倍的稀释液。
(3)为排除非测试因素(培养基)的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。
(4)每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为实验重复，求其平均值，若其中有菌落数与其他实验差距悬殊的，需要对该平板进行重新制作。
(5)注意培养时间和温度，获取准确的菌落数。细菌：30～37 ℃，培养1～2 d；放线菌：25～28 ℃，培养5～7 d；霉菌(真菌)：一般在25～28 ℃，培养3～4 d。
(6)微生物的菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。仔细观察分离到的菌落，记录它们的特征。
十七、结果分析与评价
消毒
灭菌
概念
使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物
使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
适用对象
操作空间、操作者的衣着和手等
微生物培养的器皿、接种用具和培养基等
常用方法
煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药物消毒法和紫外线消毒法
湿热灭菌(其中高压蒸汽灭菌的效果最好)、干热灭菌、灼烧灭菌
微生物
酵母菌
醋酸菌
乳酸菌
分类
真核生物
原核生物
原核生物
代谢类型
异养兼性厌氧
异养需氧
异养厌氧
适宜温度
18～30 ℃
30～35 ℃
室温
发酵条件
前期需氧；后期不需氧
一直需氧
无氧
生殖方式
孢子生殖，适宜条件下出芽生殖
二分裂生殖
二分裂生殖
生产应用
酿酒、发面
酿醋
制作酸奶、泡菜
果酒制作
果醋制作
发酵菌种
酵母菌
醋酸菌
菌种来源
传统的葡萄酒酿造采用自然发酵，菌种主要是附着在葡萄皮上的野生型酵母菌
购买醋酸菌的菌种或从食醋中分离醋酸菌
发酵产物
酒精、二氧化碳
乙酸、水或二氧化碳
发酵条件
温度
一般控制在18～30 ℃
30～35 ℃
时间
10～12 d
7～8 d
氧气
初期需氧，
后期不需氧
始终需要氧
pH
最适pH为4.5～5.0
最适pH为5.4～6.0
制作原理
项目
说明
材料的选择与处理
选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄进行冲洗，再去除枝梗，以防葡萄汁流失及污染。冲洗以洗去灰尘为目的，以防洗去野生型酵母菌
防止发酵液被污染
①榨汁机和发酵瓶等器具用洗洁精清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒；
②清洗葡萄时要先清洗后除枝梗；
③发酵瓶排气管用曲颈管而不用直管
控制发酵条件
①葡萄汁装入发酵瓶时，要留有大约1/3的空间，目的是先让酵母菌进行有氧呼吸，快速繁殖，耗尽O2后再进行酒精发酵，并防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液的溢出；
②严格控制温度：18～30 ℃利于酵母菌的繁殖和酒精发酵；30～35 ℃利于醋酸菌的繁殖和果醋的发酵；
③充气：酒精发酵为无氧发酵，需关闭充气口；醋酸发酵为有氧发酵，需经充气口充气
发酵时期
乳酸菌数量
乳酸含量
亚硝酸盐含量
发酵初期
少(O2抑制乳酸菌活动)
少
增加(硝酸盐还原菌的作用)
发酵中期
最多(乳酸积累抑制其他菌活动)
增多
下降(硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解)
发酵后期
减少(乳酸积累，pH下降，抑制自身活动)
继续增多
下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制)
变化曲线
营养物质
定义
作用
主要来源
碳源
凡能提供碳元素的物质
构成生物体细胞的物质和一些代谢产物，有些也是异养生物的能源物质
无机碳源：NaHCO3、CO2等；
有机碳源：糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等
氮源
凡能提供氮元素的物质
合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物
无机氮源：N2、NH3、铵盐等；
有机氮源：尿素、牛肉膏等
生长因子
生长必不可少的微量有机物
是酶和核酸的组成成分
维生素、氨基酸、碱基等
水
—
不仅是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定
培养基、空气、代谢产物
无机盐
为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素，包括大量元素和微量元素
是细胞的组成成分、生理调节物质、某些化能自养菌的能源、酶的激活剂等
无机化合物
营养物质
动物
(异养型)
微生物
绿色植物
(自养型)
异养型
自养型
碳源
糖类、脂肪、蛋白质等
糖、醇、有机酸等
二氧化碳、碳酸盐等
二氧化碳、碳酸盐等
氮源
蛋白质或其降解产物等
蛋白质或其降解产物、有机氮化物、无机氮化物
无机氮(硫)化物
无机氮化物
能源
与有机碳源相同
与有机碳源相同
氧化无机物或利用光能
利用光能
灭菌和消毒种类
主要方法
应用范围
灼烧灭菌
酒精灯火焰灼烧
微生物接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其他金属用具，以及接种过程中的试管口或瓶口等
干热灭菌
干热灭菌箱160～170 ℃加热2～3 h
玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等，凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品
湿热灭菌
高压蒸汽灭菌锅内100 kPa、121 ℃维持15～30 min
培养基及多种器材、物品
煮沸消毒法
100 ℃煮沸5～6 min
家庭餐具等生活用品的消毒
巴氏消毒法
62～65 ℃消毒30 min或80～90 ℃处理30 s～1 min
牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体
紫外线消毒
30 W紫外灯照射30 min
接种室、接种箱、超净工作台
化学药物
消毒
用体积分数为70%～75%的酒精、碘酒涂抹，来苏尔喷洒等
用于皮肤、伤口、动植物组织表面的消毒和空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等的消毒
第一次操作
每次划线之前
划线结束
目的
杀死接种环上原有的微生物
杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少
杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者
项目
选择培养基
鉴别培养基
特殊成分
加入某种化学物质
加入某种指示剂或化学药品
目的
抑制或阻止其他微生物生长，促进目的微生物生长
与微生物的代谢产物或培养基中的成分发生特定反应
用途
培养、分离出特定微生物
鉴别不同的微生物
举例
培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌生长；用以尿素作唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌
可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈黑色)
比较项目
平板划线法
稀释涂布平板法
关键操作
接种环在固体培养基表面连续划线
①一系列的梯度稀释
②涂布平板操作
注意事项
每次划线前后均需灼烧接种环
稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加稀释度的范围
菌体获取
在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
优点
可根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落
既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
缺点
不能对微生物计数
操作复杂，需要涂布多个平板
平板示意图
比较项目
间接计数法(稀释涂布平板法)
直接计数法
(显微计数法)
原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式
每克样品中的菌落数＝eq \f(C,V)×M
C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数
每毫升原液所含细菌数：每小格内平均细菌数400×104×稀释倍数
缺点
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
不能区分细胞死活
结果
比实际值偏小
比实际值偏大
内容
现象
结论
有无杂菌污染的判断
对照的培养皿中无菌落生长
未被杂菌污染
培养基中菌落数偏高
被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高
培养基中混入其他氮源
选择培养基的筛选作用
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目
选择培养基具有筛选作用
样品的稀释操作
得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板
操作成功
重复组的结果
若选取同一种土样，统计结果应接近
相关试卷
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