备课素材知识点：工程菌如何产生胰岛素 高中生物学选择性必修三

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胰岛素是一种真核细胞产生的分泌蛋白，它的合成与分泌需要内质网和高尔基体直接参与，才能对合成的蛋白质进行加工和修饰，从获得具有一定空间结构和生物活性胰岛素。而大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，无法对合成的蛋白质进行加工修饰。那么导入胰岛素基因的大肠杆菌是如何生产具有生物功能的胰岛素？
生产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建方案主要有下列三种：
1、AB链分别表达法
该方法在早期重组大肠杆菌生产胰岛素时采用。A链和B链的基因编码区(不含内含子)由化学合成并分别克隆在β－半乳糖苷酶基因的表达型质粒上，后者与胰岛素编码序列形成杂合基因，其连接位点处为甲硫氨酸密码子。重组分子分别转化大肠杆菌受体细胞，两种克隆菌分别合成β－半乳糖苷酶－人胰岛素A链融合蛋白以及β－半乳糖苷酶－人胰岛素B链融合蛋白。经大规模发酵后，从菌体中分离纯化融合蛋白，再用溴化氰在甲硫氨酸残基的C端以化学方法切断融合蛋白，释放出人胰岛素的A链和B链。由于β－半乳糖苷酶中含有多个甲硫氨酸残基，溴化氰处理后生成多个小分子多肽，而A链和B链内部均不含甲硫氨酸残基，故不被溴化氰继续降解。A链和B链进一步纯化后，以2∶1的分子比混合，并进行体外化学折叠。
2、人胰岛素原表达法
将人胰岛素原cDNA编码序列克隆在β－半乳糖苷酶基因的下游，两个DNA片段的连接处仍为甲硫氨酸密码子。该杂合基因在大肠杆菌中高效表达后，分离纯化融合蛋白，并同样采用溴化氰特性化学裂解法回收人胰岛素原片段，然后将之进行体外折叠。由于C链的存在，胰岛素原在复性条件下能形成天然的空间构象，为三对二硫键的正确配对提供了良好的条件，使得体外折叠率高达80%以上。为了获得具有生物活性的胰岛素，经折叠后的人胰岛素原分子必须用胰蛋白酶特异性切除C链。胰蛋白酶的作用位点位于精氨酸或赖氨酸残基的羧基端，由于天然构象的存在，人胰岛素原链第22位上的精氨酸残基和第29位上的赖氨酸残基对胰蛋白酶的作用均不敏感。因此用胰蛋白酶处理人胰岛素原后，可获得完整的A链以及C末端带有精氨酸残基的B链。也就是说，与人的天然胰岛素相比，这个B链多出一个氨基酸残基，后者再用高浓度的羧肽酶B专一性切除。
3、AB链同时表达法
该方法的基本思路是将人胰岛素的A链和B链的基因编码序列拼接在一起，然后组装在大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因的下游。重组子表达出的融合蛋白经溴化氰处理后，分离纯化A－B链多肽，然后再根据两条链连接处的氨基酸残基性质，采用相应的裂解方法获得A链和B链肽段，最终通过体外化学折叠制备具有活性的重组人胰岛素。与AB链分别表达法相似，其最大的缺陷仍是体外折叠的正确率较低。
由于大肠杆菌仅能在细胞内将胰岛素基因表达出无特异性空间结构的多肽链，以及其缺乏真核细胞的蛋白质加工系统等原因，大肠杆菌不能表达出具有生物活性的胰岛素。上述3种工程菌的构建策略均采用胰岛素基因与大肠杆菌β--半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的融合型重组蛋白不能分泌，主要以包涵体的形式存在于细胞内，然后对肽链进行分离、纯化、体外折叠，方可获得具有生物活性的胰岛素。

例、科学家通过基因工程的方法,能使大肠杆菌产生人的胰岛素。以下叙述中正确的是(多选)( )
A.大肠杆菌常不能表达出具有生物活性的胰岛素
B.目的基因导入受体细胞后一定能表达
C.DNA连接酶和限制酶都是构建重组质粒所必需的工具酶
D.不同的限制酶处理目的基因和质粒产生的黏性末端一定不能互补配对
解析：选A、C。由于细菌中不含有内质和高尔基体等细胞器,所以合成的蛋白质是没有生物活性的;目的基因导入受体细胞后不一定表达,所以要进行目的基因的检测和鉴定;DNA连接酶和限制酶在将目的基因和运载体结合时起重要作用;不同的限制酶识别的序列不完全相同,但切出的黏性末端有可能是互补配对的。