第一篇　主题五　专题(十三)　命题点3　基因工程 2024年高考生物二轮复习课件+讲义

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1.基因工程的理论基础(1)不同生物的DNA分子能拼接起来的理论基础①DNA的基本组成单位都是4种脱氧核苷酸。②DNA分子都遵循碱基互补配对原则。③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。(2)外源基因可以在受体细胞内表达的理论基础①基因是控制生物性状的独立遗传单位。②遗传信息的传递都遵循中心法则。③生物界共用一套遗传密码。
2.基因工程的三种基本工具
3.基因工程的基本操作程序(1)基因工程的四个主要操作步骤
(2)基因工程操作程序中的注意点①目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入在启动子与终止子之间。当需要目的基因在特定细胞中表达时，需要利用特定的启动子，如目的基因要在乳腺细胞中表达时，启动子要换成乳腺蛋白基因的启动子。②基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，终止子位于目的基因的尾端，使转录在所需要的地方停止，而起始密码子和终止密码子在mRNA上。
③植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此植物基因工程的受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；高度分化的动物细胞的全能性受到限制，动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素等则需要用真核生物，如酵母菌(需要内质网、高尔基体的加工、分泌)等。
5.PCR技术原理与条件
6.PCR技术的过程变性：加热超过90 ℃，DNA解链　↓复性：冷却至50 ℃左右，引物与互补DNA链结合　↓延伸：加热到72 ℃左右，在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成子链(1)PCR技术中，不需要解旋酶，需要耐高温的DNA聚合酶。(2)关于引物：依据目的基因两端的部分核苷酸序列设计。两种引物之间以及每种引物内部不能发生碱基互补配对。有时候引物5′端需要含有某种限制酶的识别序列。
7.DNA的粗提取与鉴定
8.DNA片段的电泳鉴定
1.(2023·广东，11)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
2.(2023·广东，20)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题：(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与________植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备________________。
(3)转化后，T－DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入，也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图)，用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了____________________________。
DAI基因和卡那霉素抗
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约____%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株________(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息如图，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
(1)PCR技术中，提高复性的温度能有效减少反应非特异条带的产生(2021·湖北，16)(　　)(2)利用蛋白质工程技术在N0的α和β亚基之间加入一段连接肽，可获得热稳定的融合型腈水合酶(N1)，加入连接肽需要通过改造基因实现(2021·辽宁，14)(　　)(3)用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近(2019·江苏，10)(　　)
提示：兔血液中的成熟红细胞没有DNA，因此等体积的兔血提取的DNA量小于鸡血。
(4)粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，向过滤后所得滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物(2021·山东，13)(　　)
提示：向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中。
(5)(2018·江苏，32节选)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的 端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是______________________________ 。(6)(2022·山东，25节选)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是____________ 。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 (填“3′端”或“5′端”)。
使DNA片段能定向插入表达载体，
链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸
(7)(2019·江苏，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。如图所示为甲、乙、丙
3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是 。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是______________ 。
(8)(2019·全国Ⅰ，38节选)在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是 。在PCR反应中使用TaqDNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是________________________________________________________________。
TaqDNA聚合酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
(9)(2023·海南，20节选)基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是农杆菌细胞内含有Ti质粒，______________________________________________________________________________________。
Ti质粒中的T—DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起
题组一　基因工程1.如图1中的三个DNA片段上依次表示出了EcRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点，图2为某种基因表达载体的示意图(载体上的EcRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。请回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_________酶切后的产物连接，理由是________________________________________。
两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端
(2)图2中启动子的作用是_____________________________，终止子的作用是________________，抗生素抗性基因的作用是________________________。
RNA聚合酶识别和结合的部位
(3)构建基因表达载体时，还需要用到DNA连接酶。常见的DNA连接酶有_______DNA连接酶和_____DNA连接酶，其中能连接平末端的是______DNA连接酶。
(4)若某人利用图2所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组DNA分子(如图3所示)。这三种重组DNA分子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，原因是_____________________________________________________________________________________________。
甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录
2.(2023·鄂州高三联考)多酚氧化酶(PPO)基因的大量表达是促使果实褐变的主要原因之一。科研人员将外源多酚氧化酶基因的同源片段(ASPPO)与载体结合，构建PPO基因的反义表达载体(重组质粒2)，并在农杆菌介导下实现了对鸭梨组培苗的转化，其操作流程如图1，图中限制酶SacⅠ的识别序列为GAGCT↓C，
限制酶XbaⅠ的识别序列为T↓CTAGA，限制酶HindⅢ的识别序列为A↓AGCTT，KanR为卡那霉素抗性基因，aadA为链霉素抗性基因。请回答下列问题：
(1)多酚氧化酶基因的同源片段(ASPPO)的获取：根据PPO基因3′端450 bp的片段两侧的碱基序列，设计引物进行过程①(以mRNA为模板进行的特殊PCR)。过程①中需要使用的酶有_________________________，为使扩增出的ASPPO基因能与质粒2构建反义表达载体，左、右侧引物_____(填“5′”或“3′”)端分别需要添加的序列是____________________。
逆转录酶和TaqDNA聚合酶
GAGCTC、TCTAGA
(2)ASPPO片段的克隆：将ASPPO片段与质粒1连接形成的重组质粒1导入大肠杆菌，该过程需要预先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，其目的是___________________________________________________________。与体外扩增相比，将重组质粒1导入大肠杆菌中扩增的优点有___________________________________。
使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
(3)PPO基因反义表达载体的构建：过程④中利用___________________________________将ASPPO片段与质粒2定向连接形成重组质粒2，导入农杆菌后进行筛选、测序鉴定，再使用______(物理状态)培养基扩大培养农杆菌。
(SacⅠ、XbaⅠ)限制酶
(4)鸭梨的遗传转化：将预培养的鸭梨叶片愈伤组织置于上述农杆菌菌液中浸渍5 min后，再将愈伤组织转接到添加__________(抗生素)的选择培养基中培养。
(5)反义转基因鸭梨的检测：科研人员分别提取了非转基因鸭梨植株叶片及转基因鸭梨植株叶片的总RNA，以PPO基因编码区全长为探针进行杂交检测转基因鸭梨的内源PPO基因转录情况，结果如图2。该检测的原理是______________，实验结果表明植株____(填“A”或“B”)可能是成功实现转化的转基因植株。为进一步验证获得的转基因植株是否是耐褐化新品种，还需进行的检测是_____________________________________。
待植株开花结果后，观察果实是否褐变
题组二　DNA片段的扩增及电泳鉴定3.(2023·珠海高三期末)反转录PCR又称逆转录PCR(RT－PCR)，是以mRNA为模板进行的特殊PCR，过程如图。下列相关叙述错误的是A.图示过程需要控制温度，否则可能得不到产物B.RT－PCR技术中，不需要已知mRNA的全部序列C.过程③中子链沿着模板链的5′→3′方向延伸D.RT－PCR技术可应用于是否被RNA病毒感染的 检测
4.染色质是由一定长度的核小体为基本单位构成的。将大鼠肝细胞中分离出的染色质用非特异性核酸酶水解后去除染色质蛋白，对得到的DNA片段进行凝胶电泳，结果如图所示。若先将染色质中的蛋白质去掉后用同样的非特异性核酸酶处理，则得到随机长度的DNA片段。据此分析，下列有关叙述错误的是
A.凝胶中的DNA分子通过染色， 可以在波长为300 nm的紫外灯 下被检测出来B.染色质中的蛋白质可能对DNA 具有保护作用C.构成核小体的基本单位是脱氧核糖核苷酸D.在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小和构象等 有关
题组三　蛋白质工程5.(2023·宿迁高三质检)基因定点突变的目的是通过定向地改变基因内一个或少数几个碱基来改变多肽链上一个或几个氨基酸。该技术是蛋白质工程的重要技术。如图为利用PCR技术进行定点突变的流程，下列相关叙述错误的是
A.由于基因决定蛋白质，因此要 对蛋白质的结构进行设计改造， 最终还必须通过改造或合成基 因来完成B.酶①应为耐高温的DNA聚合酶， 引物X和Y应该为引物2和4C.可以将引物1、引物2、引物3 和引物4置于同一个反应系统
中同时进行第一个阶段的反应，进而缩短实验时间D.利用图示流程技术可以将两个不同的基因拼接到一起