第一篇　主题五　高考热点(五)　PCR的应用 2024年高考生物二轮复习课件+讲义

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随着生物技术的飞速发展，曾经遥不可及的PCR技术逐步走进了高中实验室。PCR技术应用广泛，如实时荧光定量RT－PCR技术、重叠延伸PCR、大引物PCR、反向PCR、巢式PCR等，高考试题中有关PCR的问题越来越多，设问考查深度也明显提升。各种PCR技术不是孤立的，它们均以常规PCR为基础，为实现特定目的而进行了一定改进，但也有各自的局限性，因此在必要时可同时使用几种扩增技术，如多重巢式PCR、反向实时荧光定量PCR等。
在高考备考中，要关注不同扩增技术的本质差异，同时总结此类试题的解答步骤：一是寻找题图有效信息，确定所考PCR类型；二是迅速再忆所考PCR的独特性，猜测出题人可能的意图；三是根据设问对前述猜测进行验证，并领悟出题人挖掘的新考点，进而对知识框架进行完善。
1.实时荧光定量RT－PCR技术检测病毒核酸病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR检测
某冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小，说明病毒核酸浓度越高。
2.PCR定点突变——重叠延伸PCR技术重叠延伸PCR技术其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过
重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图：
3.PCR定点突变——大引物PCR技术大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。原理如图。
4.反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理是：用限制酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如图。
5.巢式PCR首先将目标的DNA模板与第一套引物(外引物)结合。第一套引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段(图中未显示可能的多种产物)。然后使用第二套引物(内引物)对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。由于第二套引物位于第一
轮PCR产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片段。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。原理如图。
1.(2023·兰州高三质检)实时荧光RT－PCR可用于RNA病毒的核酸检测，其原理是：在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团，新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT－PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是
A.做RT－PCR之前，需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针B.RNA不能作为PCR扩增的模板，故需要将样本中的RNA反转录为cDNA 后再进行扩增C.若检测结果有强烈荧光信号发出，说明被检测者没有感染病毒D.病毒的检测还可以检测病毒引发产生的抗体，其原理是抗原－抗体杂交
2.(2023·天水高三模拟)重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是A.过程①需要把两对引物同时加入一个扩增 体系以提高扩增效率B.过程①需要3轮PCR才能得到图中所示PCR 产物C.过程②的产物都可以完成延伸过程D.若过程④得到16个突变基因则需要消耗15个 通用引物RP2
3.(2023·徐州高三三模)农杆菌Ti质粒上的T－DNA可以转移并随机插入到被侵染植物的染色体DNA中。研究者将如图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板，利用PCR技术扩增出T－DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T－DNA插入的具体位置。下列说法错误的是
A.进行PCR扩增依据的是DNA半保留复制的原理B.进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶C.利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列D.通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T－DNA的插入位置
4.(2023·天津高三调研)IKK激酶由IKKα、KKβ和IKKγ三种亚基组成，该酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKKB基因编码区第1 183位碱基T突变为C，导致IKKβ上第395位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠，主要过程如图1、2。回答下列问题：
(1)在PCR反应体系中，除了需要加入引物和IKKB基因外，还需要加入_______________________________________等。在图1获取突变基因过程中，需要以下3种引物：引物A：5′－CCCCAACCGGAAAGTGTCA－3′(下划线字母为突变碱基)引物B：5′－TAAGCTTCGAACATCCTA－3′(下划线部分为限制酶HindⅢ识别序列)引物C：5′－GTGAGCTCGCTGCCCCAA－3′(下划线部分为限制酶SacⅠ识别序列)则PCR1中使用的引物有______________，PCR2中使用的引物有______和图中大引物的____(填“①”或“②”)链。
DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸
(2)根据图2杂交结果，可以确认突变基因已经较稳定地整合到小鼠细胞的染色体上，在遗传时遵循_________定律。研究人员对三种基因型小鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK激酶的三种亚基进行提纯和电泳，结果如图3。请依据此结果提出SCID患者免疫缺陷产生的机制：___________________________________________________________。
IKKB基因突变导致IKKβ含量减少，IKK激
酶活力降低，T细胞减少
(1)PCR反应体系需要加入模板、引物、____________________、______________________、缓冲液、Mg2＋等。
5.家畜的某些生产性状(如泌乳、产肉、产毛)会受到性别的影响，因此性别鉴定和控制技术在畜牧生产上具有重大的实践意义。如图1为利用PCR扩增SRY基因(Y染色体上的性别决定基因)进行奶牛胚胎性别鉴定的主要流程。回答下列问题：
(2)对囊胚进行性别鉴定时，应选取________(部位)细胞，该部位的细胞将发育为___________。待得出鉴定结果后，将胚胎移植至经__________处理的受体母牛子宫内可进一步发育。
(3)相比于常规PCR获得的产物而言，巢式PCR(原理见图2)获得的产物特异性____(填“强”或“弱”)，原因是__________________________________________________________________________________________。
如果利用外引物扩增产生了错误片段，再利用内引物扩增在错误片段上进行引物配对并扩增的概率低