新高考新教材2024届高考生物二轮总复习专题十细胞工程和基因工程课件

这是一份新高考新教材2024届高考生物二轮总复习专题十细胞工程和基因工程课件，共60页。PPT课件主要包含了内容索引，网络构建知识串联，长句表达思维训练，专项模块•素能培优，胚胎分割，无性繁殖或克隆，对点训练，答案A，答案C，蛋白质工程等内容，欢迎下载使用。

细胞的全能性、细胞膜的流动性
产生专一抗体的杂交瘤细胞　
早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移
1.为什么幼龄动物组织比老龄动物组织更容易培养?培养前为什么要将动物组织分散成单个细胞?
提示 幼龄动物组织代谢旺盛。分散后细胞能与培养液充分接触,更容易进行物质交换。
2.动物细胞培养时,为什么要在培养基中加入血清等天然成分?
提示 因血清中含有多种维持细胞正常代谢和生长的物质,如蛋白质、氨基酸、未知的促生长因子等,人们对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚。因此细胞培养时,为保证细胞能顺利生长和繁殖,一般需添加血清等天然成分。
3.为什么克隆动物的性状与供体基本相同?克隆动物的性状还与什么有关?
提示 克隆动物的大部分性状受细胞核控制,而细胞核来自供体。克隆动物的性状还与提供卵母细胞的个体有关,同时还受环境影响。
4.制备单克隆抗体时,不直接用经过免疫的B淋巴细胞来获得单克隆抗体的原因是什么?
提示 用于获得杂交瘤细胞的B淋巴细胞,不能进行无限增殖,难以获得大量抗体。
5.为什么选择MⅡ期的卵母细胞作为受体细胞?
提示 细胞大,易于操作;卵黄多,营养丰富,为胚胎发育提供充足的营养;此时期卵母细胞具备受精能力,细胞质中含有能恢复供体细胞核全能性的物质。
6.刚刚采集到的哺乳动物的精子和卵子能立刻受精吗?请说明理由。
提示 不能。精子要获能后才具有受精能力,卵子必须进一步成熟到减数分裂Ⅱ中期才能受精。
7.限制酶来源于原核生物,为什么不能切割自身的DNA分子?
提示 限制酶具有特异性,即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并在特定的位点上进行切割。限制酶不切割自身DNA分子的原因是原核生物的DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
8.利用PCR扩增目的基因时,为什么要用2种不同的引物?
提示 DNA的两条链是反向平行的,而复制时只能从固定的方向(模板链的3'端)开始,所以引物的碱基序列是不同的。
9.对转基因生物存在争论的原因是什么?
提示 人们对基因的结构、基因间的相互作用以及基因的调控机制等都了解得相当有限;不少转移来的基因是异种生物的基因;外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的。
1.厘清植物细胞工程两大技术
细胞膜的流动性和植物细胞的全能性
2.植物细胞工程的四点注意
提醒植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。
3.厘清动物细胞培养的条件、过程及相关酶
提醒区分原代培养和传代培养的关键是是否分瓶培养。
4.单克隆抗体的制备
　原理:细胞膜的流动性、细胞的增殖
5.胚胎移植的操作流程
提醒①卵母细胞需培养到MⅡ期才能参与受精。②细胞分化开始于囊胚,桑葚胚的形成没有经过细胞分化。③囊胚的内细胞团具有全能性,将来发育成胎儿的各种组织。
7.胚胎干细胞的培养流程
知识拓展滋养层细胞、饲养层细胞的区别
题组一　精典对练——拿高分▶题型一　围绕植物细胞工程的相关知识,考查科学思维和科学探究1.研究人员用一定量的紫外线辐射消除某烟草细胞的细胞核,获得保留细胞质且具有链霉素抗性的烟草细胞甲,去除烟草细胞甲和烟草细胞乙(无链霉素抗性)的细胞壁,将二者进行融合,获得杂种细胞丙。下列叙述错误的是(　　)A.去除细胞壁前需要对烟草细胞甲和乙进行灭菌处理以防杂菌感染B.经纤维素酶和果胶酶处理得到的原生质体需置于等渗溶液中以维持其活性C.在添加链霉素的选择培养基上能进行增殖的细胞只有杂种细胞丙D.杂种细胞丙需要经过脱分化、再分化等过程才能够获得杂种植株
解析 去除细胞壁前需要对烟草细胞甲和乙进行消毒处理以防止杂菌感染,若进行灭菌处理则会使细胞失去活性,A项错误。经纤维素酶和果胶酶处理得到的原生质体由于失去了细胞壁的保护作用,易吸水涨破,所以需置于等渗溶液中以维持其活性,B项正确。烟草细胞甲含有链霉素抗性,但不含细胞核,不能进行增殖,而烟草细胞乙含有细胞核,但无链霉素抗性,不能进行增殖,所以在添加链霉素的选择培养基上能进行增殖的细胞只有杂种细胞丙,C项正确。杂种细胞丙需要经过植物组织培养过程中的脱分化、再分化等过程才能够获得杂种植株,D项正确。
2.人工种子,就是将组织培养产生的体细胞胚和性细胞胚包裹在能提供养分的胶囊里,再在胶囊外包上一层具有保护功能和防止机械损伤的外膜,形成一种类似于种子的结构。下列有关人工种子的叙述,错误的是(　　)A.人工种子的胚状体可通过植物组织培养技术得到B.人工种皮、人工胚乳与正常种子相应结构的作用相似C.通过体细胞胚状体得到的植株,不能再进行有性生殖D.人工种子可用来解决某些作物发芽率低、繁殖力差、结子困难等问题
解析 胚状体是植物组织培养过程中,愈伤组织再分化得到的产物,A项正确。人工种子的种皮、胚乳应与正常种子相应结构的功能相类似,这样种子才能正常发芽生长,B项正确。通过体细胞胚状体得到的植株,是能进行有性生殖的,C项错误。制作人工种子的目的就是解决某些作物发芽率低、繁殖能力差、结子困难等问题,D项正确。
▶题型二　围绕动物细胞工程的相关知识,考查科学思维和科学探究3.不定项选择题)科学家利用基因编辑技术获得一只彻底敲除BMAL1基因(控制生物节律的核心基因之一)的猕猴甲,发现其出现睡眠紊乱的症状。利用该猕猴的体细胞克隆得到了五只具有睡眠紊乱症状的克隆猴。下列叙述正确的是(　　)A.猕猴甲体内各种细胞表达的基因完全相同B.克隆猴的胚胎发育过程中会发生细胞凋亡C.五只克隆猴的获得能够证明动物体细胞具有全能性D.通过上述技术可批量制备疾病动物模型用于科学研究
答案 BD　解析 猕猴甲体内各种细胞表达的基因不完全相同,A项错误。克隆猴的胚胎发育过程中会发生细胞凋亡,B项正确。五只克隆猴的获得能够证明动物体细胞核具有全能性,C项错误。该猕猴甲可用于研究BMAL1基因的功能和睡眠的调节,因此可通过题中所述技术批量制备疾病动物模型用于科学研究,D项正确。
4.下图为单克隆抗体制备过程的示意图。下列有关叙述错误的是(　　)
A.X细胞是从小鼠脾中提取的已免疫的B淋巴细胞B.Y细胞是杂交瘤细胞,必须取用培养10代以内的细胞C.图中的过程至少需要筛选两次且方法不同,最终保留抗体检测呈阳性的细胞D.图中能产生单克隆抗体的细胞在培养过程中不会出现接触抑制的现象
答案 B　解析 单克隆抗体的制备是用经过免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合,制备杂交瘤细胞,所以X细胞是从小鼠脾中提取的已免疫的B淋巴细胞,A项正确。Y细胞是骨髓瘤细胞,B项错误。题图中至少需要两次筛选过程且方法不同,第一次筛选的目的是选择杂交瘤细胞;第二次筛选是用抗体检测的方法选择能产生特异性抗体的杂交瘤细胞,最终保留抗体检测呈阳性的细胞,C项正确。由于杂交瘤细胞既保留了骨髓瘤细胞无限增殖的特点,又有B淋巴细胞产生特异性抗体的作用,所以题图中能产生单克隆抗体的细胞在培养过程中不会出现接触抑制的现象,D项正确。
5.近年来,有关肿瘤细胞特定分子的靶向治疗研究进展迅速。研究发现,蛋白X是细胞膜上的一种受体,由原癌基因X编码。在一些肿瘤细胞中,原癌基因X过量表达会持续激活细胞内的信号转导,启动细胞DNA的复制,导致细胞异常增殖。利用动物细胞融合技术制备的单克隆抗体,可用于诊断和治疗原癌基因X过量表达导致的肿瘤。下列说法错误的是(　　)A.通过检测细胞膜上是否存在蛋白X,可判定该细胞是否为肿瘤细胞B.可以利用蛋白X作为抗原制备原癌基因X过量表达的肿瘤单克隆抗体C.单克隆抗体可特异性降低原癌基因X过量表达的肿瘤细胞的增殖能力D.若检测发现原癌基因X只在乳腺、呼吸道等细胞中有微弱表达,则说明原癌基因X的表达具有选择性
解析 由题干可知,蛋白X是由原癌基因X编码的,而原癌基因X可存在于正常细胞内并表达,故通过检测细胞膜上是否存在蛋白X,不能判定该细胞是否为肿瘤细胞,A项错误。可用蛋白X作为抗原来刺激动物,获得已免疫的B淋巴细胞,将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合制备该单克隆抗体,即可以利用蛋白X作为抗原制备原癌基因X过量表达的肿瘤单克隆抗体,B项正确。虽然蛋白X大量表达,但是由于单克隆抗体与蛋白X发生特异性的结合,导致蛋白X介导的信号转导被阻断,也就无法启动DNA的复制,从而导致增殖能力明显下降,故单克隆抗体可特异性降低原癌基因X过量表达的肿瘤细胞的增殖能力,C项正确。虽然各种体细胞中都有原癌基因,但该基因只在特定的细胞中表达,这说明原癌基因X的表达具有(组织)特异性,这是基因选择性表达的结果,D项正确。
▶题型三　围绕胚胎工程的应用,考查科学思维和科学探究6.(2023广东卷)科学家采用体外受精技术获得紫羚羊胚胎,并将其移植到长角羚羊体内,使后者成功妊娠并产仔,该工作有助于恢复濒危紫羚羊的种群数量。此过程不涉及的操作是(　　)A.超数排卵　　　　　B.精子获能处理C.细胞核移植D.胚胎培养
解析 体外受精需要进行超数排卵以获得更多的卵母细胞,并且要对精子进行获能处理,将受精卵培养至桑葚胚或囊胚时期再进行胚胎移植。该过程没有涉及细胞核移植。
7.亚麻酸(ALA)能够促进卵母细胞体外成熟和囊胚发育。为了给水牛体外胚胎产业化生产中合理使用亚麻酸提供理论依据,科研人员研究了不同浓度的亚麻酸对水牛卵母细胞体外成熟及胚胎早期发育的影响。分析回答下列问题。①卵母细胞的收集和体外培养:从屠宰场水牛的卵巢中收集并处理卵母细胞,随机分成5组,分别置于不同浓度亚麻酸的培养液中,在39 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养22~24 h。②卵母细胞成熟判断:在显微镜下观察卵母细胞,判断其是否成熟,统计结果如表1所示。
③体外受精:在受精溶液中进行体外受精后,用显微镜观察判断是否完成受精。④早期胚胎培养:将受精卵移入胚胎培养液中培养44~48 h后检查分裂情况,每隔48 h更换一次培养液,第5~9 d观察囊胚发育情况,统计结果如表2所示。
表1　亚麻酸对水牛卵母细胞体外成熟的影响
表2　亚麻酸对水牛胚胎早期发育的影响
(1)步骤①中,细胞培养箱中加体积分数为5%的CO2的作用是　。 (2)步骤②中,成熟卵母细胞内染色体的行为特征是　　　　　　　　　　　　　　　。步骤③中,判断是否受精的依据是　 　。 (3)步骤④中,受精卵经　　　　(时期)发育成囊胚,培养过程定期更换培养液的目的是　 　。 (4)根据实验数据分析,亚麻酸溶液浓度为200 μml/L时,对水牛卵母细胞体外成熟和囊胚发育起　　　　(填“促进”或“抑制”)作用。 (5)实验结果表明,浓度为　　　　μml/L的亚麻酸对水牛卵母细胞体外成熟和囊胚发育都比较有利,判断依据是　 　。 
答案 (1)维持培养液pH的相对稳定　(2)染色体的着丝粒排列在赤道板上　在卵细胞膜和透明带的间隙可否观察到两个极体或者雌、雄原核　(3)桑葚胚　清除有害代谢物,补充营养物质　(4)促进　(5)50　核成熟卵子数占卵母细胞数的比例较高,囊胚数占受精卵数的比例较高
解析 (1)动物细胞培养时,细胞培养箱中加体积分数为5%的CO2的作用是维持培养液pH的相对稳定。(2)卵母细胞培养到减数分裂Ⅱ中期时才成熟,而减数分裂Ⅱ中期细胞的特征是染色体的着丝粒排列在赤道板上;判断是否受精的依据是在卵细胞膜和透明带的间隙可否观察到两个极体或者雌、雄原核。(3)胚胎早期发育过程为受精卵→桑葚胚→囊胚→原肠胚,因此步骤④中,受精卵经桑葚胚发育成囊胚;培养过程中定期更换培养液的目的是清除有害代谢物,补充营养物质。
(4)题表1中亚麻酸溶液浓度为0 μml/L的一组为对照组,与对照组相比,亚麻酸溶液浓度为200 μml/L时,核成熟卵子数占卵母细胞数的比例较高,囊胚数占受精卵数的比例较高,可见其对水牛卵母细胞体外成熟和囊胚发育起促进作用。(5)题表2中,亚麻酸溶液浓度为50 μml/L 时,核成熟卵子数占卵母细胞数的比例最高,囊胚数占受精卵数的比例最高,因此浓度为50 μml/L的亚麻酸对水牛卵母细胞体外成熟和囊胚发育都比较有利。
题组二　易错防范——不失分1.判断下列有关细胞工程的叙述是否正确。(1)植物体只有体细胞才具有发育成完整个体所必需的全套基因。(　　)(2)植物有性杂交和体细胞杂交都能克服远缘杂交不亲和的障碍。(　　)(3)传代培养时需要用胰蛋白酶处理贴壁生长的细胞。(　　)(4)动物细胞培养一般需要使用CO2培养箱。(　　)(5)选择高度分化的动物体细胞进行培养,有利于获得大量细胞。(　　)(6)外植体应进行消毒处理以防止杂菌污染。(　　)(7)脱分化和再分化过程需要考虑不同激素的浓度比例,同时还需要避光处理。(　　)(8)制备单克隆抗体时,需要诱导免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。(　　)
2.判断下列有关胚胎工程的叙述是否正确。(1)为获取更多的卵母细胞,要对供体母羊注射促性腺激素,使其同期发情。(　　)(2)人工授精和体外受精的本质不同。(　　)(3)动物细胞培养的培养液通常需要加入血清。(　　)(4)胚胎干细胞可以从早期胚胎中分离获得。(　　)(5)体外受精后的一定时间内,收集供体原肠胚用于胚胎分割。(　　)(6)胚胎移植全部属于无性生殖。(　　)
易错点拨(1)桑葚胚与囊胚
(2)克隆动物与试管动物
(3)胚胎移植的胚胎来源
1.基因工程的理论基础
2.基因工程的三种基本工具
提示若用不同的限制酶切割出不同的黏性末端,则能使基因和载体定向连接,避免自身环化和反向连接,提高连接的有效性。
3.基因工程的基本操作程序(1)目的基因的筛选与获取
特别提醒①从cDNA文库获取的目的基因不含启动子和终止子。②利用乳腺生物反应器生产药物时,应将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。
(2)基因表达载体的构建
提醒①启动子、终止子a.启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)。b.终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA上)。②目的基因插入位置:启动子与终止子之间。
(3)将目的基因导入受体细胞
(4)目的基因的检测与鉴定
题组一　精典对练——拿高分▶题型一　围绕基因工程的操作程序,考查科学思维1.限制酶的发现为DNA的切割和功能基因的获得创造了条件。限制酶Sau3AⅠ、EcRⅠ、BamHⅠ的识别序列及切割位点分别为↓GATC、G↓AATTC、C↓GATCC。含某目的基因的DNA片段如下图所示,若利用质粒A(含限制酶Sau3AⅠ、EcRⅠ、BamHⅠ的酶切位点各1个)构建基因表达载体,为克服目的基因和质粒A的自身环化以及目的基因与质粒的任意连接等,应该如何选择限制酶?(　　)
A.用限制酶EcRⅠ或BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒AB.用限制酶Sau3AⅠ和BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒AC.用限制酶Sau3AⅠ和EcRⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒AD.用限制酶EcRⅠ和BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
答案 D　解析 用限制酶EcRⅠ或BamHⅠ处理,得到的DNA片段两端具有相同的黏性末端,因此可能会出现自身环化以及目的基因与质粒的任意连接;用限制酶Sau3AⅠ处理会破坏目的基因;用限制酶EcRⅠ和BamHⅠ同时处理,则可以避免目的基因与质粒的自身环化和任意连接。
▶题型二　围绕基因工程、蛋白质工程的应用,考查科学思维和科学探究2.(不定项选择题)已知B基因存在于水稻基因组中,其仅在体细胞和精子中正常表达,在卵细胞中不转录。研究人员将B基因编码蛋白的序列与Luc基因(表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光)连接成融合基因(表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能),然后构建基因表达载体导入水稻愈伤组织中,如下图所示。下列有关说法正确的是(　　)
A.B-Luc融合基因的形成需要DNA连接酶的催化B.构建B基因编码蛋白的cDNA文库,只能从水稻体细胞中提取全部RNA进行逆转录C.B基因在水稻卵细胞中不转录,其可能的原因是卵细胞中该基因的启动子无法启动转录D.将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交实验可对获得的转基因植株进行鉴定筛选
答案 AC　解析 将两个基因连接起来需要DNA连接酶,A项正确。构建B基因编码蛋白的cDNA文库,还可以从水稻的精子中提取全部的RNA进行逆转录,B项错误。B基因在水稻卵细胞中不转录,据图推测其可能的原因是卵细胞中该基因的启动子无法启动转录,C项正确。对获得的转基因植物进行筛选,应以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针,而不是将随机断裂的B基因片段制备成探针,D项错误。
3.新型冠状病毒通过面刺突蛋白(S蛋白)的活性域(RBD)与人体细胞表面的ACE2受体相互作用而感染细胞。科学家设计了一种自然界中不存在的蛋白质LCB1,可与S蛋白的RBD紧密结合,以干扰新型冠状病毒的感染。下列说法不合理的是(　　)A.LCB1的结构可能与S蛋白的抗体有相似之处B.S蛋白的RBD结构可以为设计LCB1提供信息C.生产LCB1用到了基因工程的操作技术D.可直接从细胞中获取基因用于LCB1的生产
答案 D　解析 S蛋白的抗体能与S蛋白的RBD特异性结合,由题干可知,LCB1可与S蛋白的RBD紧密结合,说明LCB1的结构可能与S蛋白的抗体类似,A项合理。由于LCB1可与S蛋白的RBD紧密结合,故LCB1可依据S蛋白的RBD结构进行设计,B项合理。生产LCB1用到了蛋白质工程,其中一些步骤用到了基因工程的操作技术,例如人工合成DNA等,C项合理。由题意可知,蛋白质LCB1是一种自然界中不存在的蛋白质,故不能从细胞中获取相应的基因,D项不合理。
题组二　易错防范——不失分1.判断下列有关基因工程的叙述是否正确。(1)重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和载体。(　　)(2)没有与目的基因重组的质粒也可以进入受体细胞。(　　)(3)蛋白质工程是在分子水平上对基因进行操作。(　　)(4)用人胰高血糖素基因制成DNA探针,检测胰岛A细胞中的mRNA,可形成杂交带。(　　)(5)转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测。(　　)(6)一种限制酶只能识别一种核苷酸序列。(　　)(7)DNA连接酶与DNA聚合酶均能作用于黏性末端。(　　)(8)如果基因比较小,核苷酸序列又已知,可以利用化学方法直接人工合成。(　　)
易错点拨DNA连接酶连接的是两个DNA片段,而DNA聚合酶是将单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。
2.(2023湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如下图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　)A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
解析 用一种限制酶切割,目的基因在质粒上可以正向或反向插入,进而导致基因转录产物的不同,A项正确。用一种限制酶切割后,质粒有可能发生自身环化,导致目的基因未能插入,B项正确。SphⅠ酶切会在重组质粒上产生特定的片段,通过DNA凝胶电泳技术可以分离和检测这些片段,从而确定重组质粒是否构建成功,C项正确。根据质粒图示,携带目的基因的受体菌需要同时具有AmpR和TetR基因才能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基中形成菌落,若用SphⅠ酶切,会破坏四环素抗性基因(TetR),D项错误。
易错点拨DNA连接酶连接的是两个DNA片段,而DNA聚合酶是将单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。
3.图甲、图乙中标注了相关限制酶的酶切位点。下列有关培育转基因大肠杆菌的叙述,错误的是(　　)
A.若通过PCR技术提取该目的基因,则应该选用引物甲和引物丙B.图中质粒和目的基因构建表达载体时,应选用BclⅠ和HindⅢ剪切C.若将基因表达载体导入受体细胞中,则需用Ca2+处理大肠杆菌细胞D.在受体细胞中,氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达
答案 D　解析 PCR技术要求两种引物分别和目的基因的两条单链结合,沿相反的方向合成子链,故所用的引物组成为图乙中的引物甲和引物丙,A项正确。选择的限制酶应在目的基因两端和质粒中都存在识别位点,但BamHⅠ会破坏质粒中的所有标记基因,因此只能选BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割,B项正确。将目的基因导入微生物大肠杆菌细胞中,需要用Ca2+处理,使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,C项正确。在构建基因表达载体时,使用BclⅠ和HindⅢ两种限制酶切割质粒,氨苄青霉素抗性基因被破坏,D项错误。
易错点拨为了避免目的基因和载体的自身环化和随意连接,可使用不同的限制酶切割目的基因和载体,使目的基因和载体各具有两个不同的末端。
1.电泳鉴定PCR产物的原理(1)电泳DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程就是电泳。(2)鉴定原理PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
(3)注意事项①为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。②在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换。③在进行操作时,一定要戴好一次性手套。
2.PCR技术原理与条件
3.PCR技术的过程
4.DNA的粗提取与鉴定(1)提取DNA的原理DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理,可以初步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于浓度为2 ml/L的NaCl溶液。(2)鉴定DNA的原理在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色,因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。(3)实验步骤(以洋葱为例)制取洋葱研磨液→过滤或离心,取上清液→加入预冷的体积分数为95%的酒精溶液,获得沉淀物→溶于浓度为2 ml/L的NaCl溶液中,用二苯胺试剂鉴定。
题组一　精典对练——拿高分▶题型一　围绕PCR技术原理与应用,考查科学思维和科学探究1.荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量。其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针,当相关酶催化子链延伸至探针处,会水解探针,使荧光监测系统接收到荧光信号,即每扩增一次,就有一个荧光分子生成。下列叙述正确的是(　　)A.引物是单链DNA,引物的碱基序列均相同B.DNA合成方向是从子链的3'端向5'端C.达到设定荧光强度所经过的循环次数与其起始模板数量无关D.该项技术结合逆转录可用于检测某种细胞中不同基因的转录水平
答案 D　解析 引物是单链的DNA或RNA,扩增不同的DNA,所用的引物的碱基序列不相同,A项错误。DNA合成方向是从子链的5'端向3'端,B项错误。由题干可知,达到设定荧光强度所经过的循环次数与其起始模板数量呈正相关,C项错误。cDNA是以mRNA为模板逆转录形成的,故若以cDNA为模板,该项技术便可用于检测某种细胞中不同基因的转录水平,D项正确。
2.(不定项选择题)大引物PCR定点诱变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得,第一轮加诱变引物和侧翼引物,第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物,过程如下图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.第一轮PCR过程中复性所用的温度与第二轮PCR复性的温度是一样的B.PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状,该定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译C.第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链D.将某功能蛋白的第17位Cys(UGU)改造成Ser(UCU),属于蛋白质工程
答案 BD　解析 为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行,引物设计时应考虑不同的复性温度,第二轮PCR的复性温度应该比第一轮高,A项错误。若要使得目的基因可以表达出蛋白质,则需要在产物上具备启动子和终止子,诱导基因转录和翻译,B项正确。除第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物外,第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物,以便进行另一条链的延伸,C项错误。欲将某功能蛋白的第17位Cys(UGU)改造成Ser(UCU),诱变引物应包含—AGA—或—TCT—序列,该过程属于蛋白质工程技术范畴,D项正确。
3.滁菊为菊科多年生草本植物,长期营养繁殖易造成病毒积累,导致滁菊花色变差。某科研小组比较了3种脱毒方法对滁菊体内菊花B病毒(CVB)和菊花矮化类病毒(CSVd)脱除的效果,结果见下表;下图是对不同试管苗利用CVB基因序列引物进行逆转录PCR(RT-PCR)后的电泳示意图。下列叙述正确的是(　　)
不同脱毒方法对滁菊茎尖脱毒率的影响
A.热处理、利巴韦林处理对试管苗的存活率均有显著提高B.只脱除CVB病毒的最佳选择是热处理和利巴韦林结合茎尖培养C.RT-PCR中用到的酶有逆转录酶、TaqDNA聚合酶D.试管苗2、5尚未脱毒成功,3、4已成功脱去CSVd和CVB病毒
答案 C　解析 由题表可知,与对照组相比,热处理、利巴韦林处理组的样本存活数都更少,说明热处理、利巴韦林处理对试管苗的存活率均有一定的抑制作用,A项错误。与对照组相比,热处理结合茎尖培养时,脱除CVB率比较高,而利巴韦林结合茎尖培养时,脱除CVB率相差不大,因此只脱除CVB病毒的最佳选择是热处理结合茎尖培养,B项错误。RT-PCR中包括逆转录过程和PCR过程,逆转录过程需要用到逆转录酶,而PCR过程需要用到Taq DNA聚合酶,C项正确。2、5电泳结果显示标准片段之外的阳性结果,3、4则没有,说明3、4成功脱毒(CVB病毒),2、5未能脱去CVB病毒,D项错误。
▶题型二　围绕DNA的粗提取与鉴定,考查科学探究4.下列关于“DNA的粗提取和鉴定”实验原理的叙述,错误的是(　　)A.利用DNA不溶于酒精溶液,而蛋白质能溶于酒精溶液,可将DNA与蛋白质分离B.利用高温能使蛋白质变性,但对DNA没有影响的特性,可将DNA与蛋白质分离C.在预冷的酒精溶液中沉淀DNA时,要用玻璃棒沿一个方向搅拌,防止DNA断裂D.利用DNA能溶于浓度为2 ml/L的NaCl溶液,可将提取的丝状物或沉淀物溶解于NaCl溶液中
答案 B　解析 高温能使蛋白质、DNA变性,蛋白质在60~80 ℃发生变性,DNA在80 ℃以上发生变性。
5.(2021山东卷)粗提取DNA时,向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌,过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤,在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是(　　)A.加入适量的木瓜蛋白酶B.37~40 ℃的水浴箱中保温10~15 minC.加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的预冷的酒精溶液D.加入NaCl调节浓度至2 ml/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0.14 ml/L
答案 A　解析 木瓜蛋白酶能够分解蛋白质,故在得到的滤液中加入木瓜蛋白酶后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状物,A项符合题意。将制备的含有DNA的滤液加入60~75 ℃的水浴箱中保温10~15 min,利用DNA和蛋白质对高温的耐受性不同,使蛋白质变性,从而与DNA更好地分离,B项不符合题意。DNA不溶于预冷的体积分数为95%的酒精,因此向DNA溶液中加入预冷的体积分数为95%的酒精后DNA会析出,用玻璃棒卷起丝状物后过滤得到的滤液中几乎不含DNA,C项不符合题意。DNA在浓度为0.14 ml/L的NaCl溶液中的溶解度最低,因此将滤液中几乎不含DNA,D项不符合题意。
题组二　易错防范——不失分1.判断下列有关电泳和PCR的叙述是否正确。(1)PCR反应需提供DNA模板,2种引物,4种核糖核苷酸和耐高温的DNA聚合酶。(　　)(2)可通过PCR技术检测目的基因是否成功插入或目的基因是否转录出了mRNA,也可以检测目的基因是否翻译成了蛋白质。(　　)(3)电泳是指在电场的作用下,带电分子会向着与它所带电荷相同的电极移动。(　　)(4)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定,在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。(　　)(5)PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前没必要进行高压灭菌处理。(　　)
2.(2023广东卷)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是:裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是(　　)A.裂解:使细胞破裂释放出DNA等物质B.分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等C.沉淀:可反复多次以提高DNA的纯度D.鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
答案 D　解析 细胞破裂后才能释放出其中的DNA,A项正确。分离的目的是将混合物中的一些非DNA杂质去除,例如多糖和蛋白质,B项正确。通过反复沉淀可以去除杂质,提高DNA的纯度,C项正确。鉴定DNA时,加入二苯胺后需要沸水浴加热,D项错误。
大题分析与表达(七)　基因工程类大题突破
【典例】 (2021广东卷)非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法,在细胞外构建多酶催化体系,获得目标产物的新技术,其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线,如下图所示,可直接用淀粉生产肌醇(重要的医药食品原料),以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题,并可以提高产率。回答下列问题。
(1)研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外,获得酶基因的方法还有　　　　　　　　　　　　　(答出两点即可)。 (2)高质量的 DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白,方法有　　　　　　　　　　　　(答出两点即可)。  
(3)研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时,首先应用　　　　　　处理细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白,需要采用的方法有　　　　　　　　　　　　　。 (4)依左图所示流程,在一定的温度、pH等条件下,将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同,可能导致的结果是　　　　　　　　　　　　　　。在分子水平上,可以通过改变　　　　　　　,从而改变蛋白质的结构,实现对酶特性的改造和优化。
答案 (1)从基因文库中获取、人工合成(2)用蛋白酶水解蛋白质、用一定浓度的NaCl溶解DNA、用预冷酒精溶解蛋白质(任选两点即可)(3)Ca2+　抗原—抗体杂交(4)反应产生的肌醇量少　基因的结构
解析 (1)目的基因的获取方法主要有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和通过化学方法人工合成等。(2)DNA与蛋白质的分离思路是去除蛋白质,将DNA提取出来。分离方法有利用DNA和蛋白质在NaCl溶液和酒精中的溶解度不同进行分离、利用蛋白酶的专一性进行分离等。(3)将目的基因导入受体细胞时,如果是以大肠杆菌作为受体细胞,需要用Ca2+处理细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。检测目的基因是否成功表达出酶蛋白的方法为抗原—抗体杂交。(4)淀粉在4种酶的依次催化下最终形成肌醇,但是4种酶的最适反应条件不同,在某一条件下进行反应,有些酶的活性不高,因此,产生的肌醇量少。蛋白质工程通过改变基因的结构(碱基排列顺序)进而改变蛋白质的结构。
1.(2023广东卷)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变,筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。回答下列问题。(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确实由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与　　　　植株的种子大小相近。 (2)用PCR反应扩增DA1基因,用限制性内切核酸酶对PCR产物和　　　　　进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备　　　　　　　。 
(3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入,也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(图1),用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交,将T1代种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了　　　　　　　　。 ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约　　　　　%的培养基中幼苗继续培养。 ③将②中选出的T2代阳性植株　　　　　　　　(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到　　　%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。 
为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性内切核酸酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息见图2,在答题卡电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
答案 (1)野生型(2)载体　启动子和终止子(3)DA1基因和卡那霉素抗性基因　75　自交　100
解析 (1)根据题干信息可知,突变后的基因为隐性基因,则野生型DA1基因为显性基因,因此采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确实由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。(2)利用PCR技术扩增DA1基因后,应该用同种限制性内切核酸酶对PCR产物和载体进行切割,再用DNA连接酶将两者连接起来。在基因表达载体中,启动子位于目的基因的首端,终止子位于目的基因的尾端,因此为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备启动子和终止子。(3)①将T0代植株的花序浸没在农杆菌(T-DNA上含有DA1基因和卡那霉素抗性基因)菌液中转化,再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上,在选择培养基上能够萌发并生长的阳性个体应该含有
卡那霉素抗性基因,即表示其基因组中插入了DA1基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DA1基因,由于T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点,所以不确定是单一位点插入还是多个位点插入,若是单一位点插入,相当于一对等位基因的杂合子,其自交后代应该出现3∶1的性状分离比,即阳性率约75%的培养基中幼苗是单一位点插入的植株。③将单一位点插入的T2代阳性植株自交,再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上,若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株,即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析,野生型和突变型基因片段的长度都是150 bp,野生型的基因上没有限制酶X的切割位点,而突变型的基因上有限制酶X的切割位点,结合图中的数据分析可知,电泳图中,野生型只有150 bp的条带,突变型有50 bp和100 bp的条带。
2.Ti质粒上的T区即为T-DNA,虽然是在原核生物中产生的,但是当其整合到植物细胞核基因组后,也能进行转录和翻译。下图为用Ti质粒进行植物基因工程的部分步骤示意图。回答下列问题。
(1)图中①②过程需要用到的工具酶是　　　　　　　　　。③过程常用的方法是　 。 (2)pBR322质粒是研究最多、使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒之一,作为高质量的载体,应具备的条件有　　　　　　　　(答出两点即可)。 (3)图中的“植物基因”是目的基因,常用的扩增技术是　　　　,其原理是　　　　　　。将该基因插入T-DNA的非必需区域而不是其他区域的原因是　  　。 (4)目的基因进入受体细胞后,维持稳定和表达的过程称为　　　　,T-DNA虽然是在原核生物中产生的,但可在受体植物细胞中表达的原因是　  　。 
答案 (1)限制酶、DNA连接酶　Ca2+处理法(2)有一个至多个限制酶切割位点,含有特殊的标记基因,能够进行自我复制(3)PCR技术　DNA双链复制　防止破坏原有结构导致基因在受体细胞内无法稳定存在并表达(4)转化　所有生物共用一套遗传密码
解析 (1)①过程为构建基因表达载体的过程,需要限制酶和DNA连接酶,③过程是将重组质粒导入农杆菌细胞,应用Ca2+处理法。(2)高质量的载体,需要具备在受体细胞中能稳定存在并能大量复制,且对受体细胞无害;有一个至多个限制酶切割位点;含有特殊的标记基因,便于筛选等条件。(3)目的基因常用的扩增技术是PCR技术,其原理是DNA双链的复制,应将基因插入T-DNA的非必需区域,否则会破坏原有结构导致基因在受体细胞内无法稳定存在并表达。(4)目的基因进入受体细胞后,维持稳定和表达的过程称为转化,T-DNA虽然在原核生物中产生,但是在受体植物细胞中也能表达是因为所有生物共用一套遗传密码。
3.报告基因是指一类易于检测且实验材料本身不具备的基因。阿尔茨海默病(AD)是由淀粉样前体蛋白(APP)过量表达导致的神经系统退变性疾病,用增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为报告基因,将EGFP基因与APP基因融合,可方便、经济、快速地筛选出促进人APP mRNA降解的药物。研究表明,EGFP与APP基因融合后,虽然能全部转录,但是仅有EGFP蛋白得到表达。EGFP基因与APP基因融合过程如下图所示。回答下列问题。
(1)APP751、EGFP基因的cDNA是以其mRNA为模板经　　　　　　过程形成的,将其储存于细菌质粒中,属于构建　　　　　　　　　　　。 (2)据图分析,Klenw酶的作用是　　　　　　　　　　　　　　　。切割pcDNA3.1质粒获得APP751基因时,研究人员没有选择直接用Hind Ⅲ、XbaⅠ同时切割,而是历经①→②→③的复杂过程,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (3)COS-7细胞来源于非洲绿猴肾成纤维细胞,培养这类细胞时,为保证细胞生长和避免污染,应分别在合成培养基中添加　　　　　　　　　　　　　　　,传代培养不宜超过10代,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。