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人教版 (2019)选择性必修3第1节 重组DNA技术的基本工具课文配套ppt课件
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这是一份人教版 (2019)选择性必修3第1节 重组DNA技术的基本工具课文配套ppt课件，共60页。PPT课件主要包含了操作环境，操作对象，操作水平，体外环境，分子水平，基因重组，科技探索之路，DNA，中心法则，分子手术刀等内容，欢迎下载使用。
基因工程：是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫 重组DNA技术
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品
定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍
例1.人的胰岛素基因能通过拼接并在受体细胞大肠杆菌中表达出相同蛋白质--胰岛素的理论基础是？（1）大肠杆菌和人的遗传物质都是 。（2）不同生物的DNA分子能够拼接在一起，原因是 。 （3）同一种基因在不同生物体内表达出来的蛋白质相同，因为 。（4）遗传信息的传递都遵循 。 (5) 为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？ 。
基因的组成、空间结构和碱基互补配对方式相同
所有生物共用一整套遗传密码
① 基因是控制生物性状的独立遗传单位② 遗传信息的传递都遵循中心法则③ 生物界共同一套遗传密码
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。 DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？ 这些“分子工具”各具有什么特征呢？
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
[资料1]1970年，史密斯（)等人首次从大肠杆菌中提取出了一种限制性内切核酸酶（restrictin endnuclease)。这种内切核酸酶能够识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特异性的位点上把双链DNA分子“切割”开（如图)。DNA被切割后所产生的交错的切口，也就是在每条链的一端留下的单链末端，叫做黏性末端。
一、重组DNA技术的基本工具
（1）来源：从微生物（主要是原核生物）体内分离出来（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）切割部位：“切割”的是磷酸二酯键
（1）来源：从微生物（主要是原核生物）体内分离出来（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。（3）作用部位：“切割”的是磷酸二酯键（4）切割结果：切口有两种：黏性末端和平末端
（4）切割结果：大多数限制酶的识别序列由___个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由___个、___个或_________的核苷酸组成
①无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，这就是回文序列。②能被限制酶特异性识别的切割部位基本都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。
A.形成的黏性末端（从5’往3’读）为_____B.一个限制酶切割一次断两个磷酸二酯键形成___个黏性末端C.同一种限制酶切割形成的黏性末端____D.两个黏性末端有___个游离的磷酸基团
练习：流感嗜血杆菌的d菌株( Haemphilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）
大肠杆菌（Escherichia cli R）
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内核酸切酶(限制酶)。
【思考1】下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点．请回答下列问题：
（1）请写出同时用EcRⅠ切割含目的基因的DNA的过程。（2）请写出同时用BamH和 HindⅢ切割质粒的过程。
限制酶存在于原核生物中的作用是什么?
原核生物容易受到外源DNA的入侵限制酶的作用:切割外源DNA,使之失效保证自身的安全
限制酶为什么不会剪切原核生物本身的DNA?
DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者DNA分子被修饰（甲基化），使限制酶不能将其切开
【思考3】用限制酶切割时需注意的事项(1)获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是 。但是使用该法缺点是容易发生 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。(2)获取一个目的基因需限制酶切割 次,共产生 个游离的磷酸基团。
为了产生相同的黏性末端，便于连接
分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体
目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接
【思考3】用限制酶切割时需注意的事项 (3)选择限制酶切割位点的基本原则： ①切割目的基因时： 。 ②切割质粒时： 。
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
【例1】①用图1中的质粒和图2中的外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是 。②构建重组质粒时，最好选择限制酶BamHⅠ、HindⅢ处理质粒、外源DNA，这样做的目的是 。
SmaⅠ会破坏质粒中的抗性基因以及破坏目的基因
确保目的基因与质粒的定向连接
【思考4】如图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线
用图2中的人乳铁蛋白目的基因和图1所示的质粒构建重组质粒时，选用的限制酶是 （从“EcRⅠ”、“BamHⅠ/HindⅢ”、“SmaⅠ/HindⅢ”中选择）．不能选择其他限制酶的理由分别是： 。
BamHⅠ/HindⅢ
若选EcRⅠ会破坏质粒的复制原点；若选SmaⅠ/HindⅢ，则构建的重组质粒没有标记基因或复制原点
[资料2]1967年，科学家们发现了一种能够将两个DNA片段连接起来的酶，可以用它来修复DNA链的断裂口，并把这种酶叫做DNA连接酶。1970年，科学家们又提取了一种具有更高活性的T4 DNA连接酶。当两个DNA片段的黏性末端彼此相临，而且它们的碱基能够互补配对时，DNA连接酶就能把它们之间的缝隙“缝合”起来（如图）。
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，形成重组DNA分子。
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段
既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）
旁栏思考（P72）：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键
需要DNA的一条链为模板
形成完整的DNA分子
①化学本质都是蛋白质②都是催化形成磷酸二酯键
[资料4]1973年，美国科学家科恩（S.Chen)等人从大肠杆菌中提取出了两种质粒，一种含有卡那霉素抗性基因，另一种含有四环素抗性基因。他们将这两种基因分别“切割”下来，并拼接在同一个质粒上，然后导入大肠杆菌，产生了既抗卡那霉素又抗四环素的大肠杆菌。
3.基因进入受体细胞的载体
（1）作用: ① ． ② ．（2）作为运载体需具备的条件: ① ． ② ． ③ ． ④ 等．（3）种类
将目的基因转移到受体细胞中去
利用运载体在受体细胞内对目的基因进行大量复制
能够在宿主细胞中自我复制并稳定保存
有1个至多个限制酶切点，以便与外源基因连接
具有标记基因，便于进行筛选
将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
（4）λ噬菌体的衍生物或某些动植物病毒作为运载体利用的原理是 .病毒对宿主细胞的侵染具有一定的 性。
利用病毒对宿主细胞的侵染性
【例2】若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。
噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕
霍乱弧菌中含有质粒，但 （填“能”、“不能”）用来做载体，因为选择的载体应该 。
①来源：来源于许多 等生物，它是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的 （化学本质），故质粒有 个游离的磷酸基团②氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为 ，还有如： 等；其作用是 。
用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞
卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因
最好回答：将含有目的基因的受体细胞筛选出来
③复制原点： 。
④在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。⑤细菌质粒是独立于细菌拟核之外的细胞质DNA分子，侵入宿主细胞后 A.有的可以独立地进行自我复制， B.有的则整合到宿主细胞染色体DNA上，随着宿主细胞染色体DNA的复制而同步复制。
⑥若质粒DNA分子的切割末端为 ，
则与之连接的目的基因切割末端应为 ；可使用 把质粒和目的基因连接起来。
CGCGT— A—
请在两张纸上分别写上下面两段DNA序列：
请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcRI的识别序列和切割位点。然后,用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后,将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处,并用透明胶条将切口粘连起来。
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ?
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
根据学生实际操作的情况进行指导。如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
（1）质粒与拟核中的DNA有哪些相同点：（至少写出两点） ① 。 ② 。 ③ 。（2）质粒 （是/不是）一种细胞器。（3）细胞膜上的载体蛋白与基因工程中的载体的区别 ①化学本质不同：细胞膜上的载体： 。基因工程中的载体可能是物质，如 ；也可是生物，如 ；也可是λ噬菌体的衍生物。 ②功能不同：细胞膜上的载体功能是 ;基因工程中的载体是一种“分子运输车”,把 。
具有遗传效应或都能够指导蛋白质的合成等
协助细胞膜控制物质进出细胞
【例4】在基因工程中，已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据下图示判断下列操作错误的是( )
A.质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割B.用限制酶切割获得目的基因时，有四个磷酸二酯键被水解C.限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后获得的黏性末端相同D.质粒中标记基因便于筛选出目的基因已经表达的细胞E.用酶I和酶II形成相同的黏性末端，且用DNA连接酶连接的重组DNA还能用上面两种酶切割
【例5】某线性DNA分子含有3000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是( )
A.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个B.a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接C.a酶与b酶切断的化学键不相同D.用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，
【例6】若要用上图质粒和外源DNA构建重组质粒,需要对质粒进行改造,构建新的限制酶切位点。在构建新的限制酶切位点的过程中需要使用的酶是（ ）
A限制酶PstⅠ、DNA连接酶、DNA聚合酶 B.限制酶EcRⅠ、DNA连接酶、DNA聚合酶C.限制酶EcRⅠ、限制酶PstⅠ、DNA聚合酶D.限制酶PstⅠ、限制酶EcRⅠ、DNA连接酶
1 镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变。检测这种碱基序列必须使用的酶是[ ]A．解旋酶B．DNA连接酶C．限制性核酸内切酶D．RNA聚合酶
镰刀型细胞贫血症是DNA中一个CTT变成CAT,即其中一个碱基T变成A,以致产生病变.致使血红蛋白β链中N端第6个氨基酸由谷氨酸（Glu）转变为缬氨酸(Val) 限制酶识别特定DNA序列
①不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；【解析：酶具有专一性，识别的序列相同】
你能用DNA连接酶将他们连接起来吗？2和 ； 3和 ；1和 ； 4和 。
②判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转180度，若与另一个完全相同，则说明两个末端是用同一种限制酶切割
2 已知EcRⅠ的识别序列和切点是—G↓AATTC—，BamHⅠ的识别序列和切点是—G↓GATCC—
③同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同；【解析：酶具有专一性，识别的序列不同】
2 已知BamHⅠ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，Sau3AⅠ的识别序列和切点是—↓GATC—
③同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同,(也有可能切割出相同的黏性末端，可以相互配对连接成链）
总结：产生相同的黏性末端不一定都是用同一种限制酶切割
④不同限制酶切割形成的黏性末端，如果互补则可以相互重新配对连接
总结：两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端
用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，序列会明显 （增多、减少、不变）
－TCTAGG－－AGATCC－
总结：两种同尾酶切割的DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在，不能再被原来的限制酶识别
【例1】基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，已知BamHⅠ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，Sau3AⅠ的识别序列和切点是—↓GATC—
酶切结果：BamHⅠ， 。Sau3AⅠ， 。
使用 （限制酶）提取目的基因
【例2】在DNA 测序工作中，需要将某些限制性内切酶的限制位点在 DNA上定位，使其成为 DNA 分子中的物理参照点。这项工作叫做“限制酶图谱的构建”。假设有以下一项实验：用限制酶 HindⅢ，BamHⅠ和二者的混合物分别降解一个 4kb（1kb即1千个碱基对）大小的线性DNA 分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，如下图所示。据此分析，这两种限制性内切酶在该DNA 分子上的限制位点数目是以下哪一组？ A．HindⅢ1个，BamHⅠ2 个 B．HindⅢ2个，BamHⅠ3个C．HindⅢ2个，BamHⅠ1 个 D．HindⅢ和BamHⅠ各有2 个
【例3】限制性内切酶能识别特定的DNA序列并进行剪切，不同的限制性内切酶可以对不同的核酸序列进行剪切。现以3种不同的限制性内切酶对一6.2kb大小的线状DNA进行剪切后。用凝胶电泳分离各核酸片段，实验结果如图所示。请问：3种不同的限制性内切酶在此DNA片段上相应切点的位置（ ）
请问：3种不同的限制性内切酶在此DNA片段上相应切点的位置（ ）
6.2kb大小的线状DNA
3 重组质粒的筛选
3 重组质粒的筛选【例4】为制备目的基因Y（图19）与质粒X（图20）的重组DNA，将质粒X与含Y的DNA片段加入含有限制性核酸内切酶BgIⅡ与BamHⅠ的反应混合物中，酶切后的片段再加入含有连接酶的反应体系中。其中，质粒X含有leu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR
使用BgI II处理重组质粒，可以得到 。
A．长度为3300bp的环状DNA B．长度为3300bp的线形DNA C．长度为2800bp和500bp的线DNA D．长度为2800bp的环状DNA
【例4】为制备目的基因Y（图19）与质粒X（图20）的重组DNA，将质粒X与含Y的DNA片段加入含有限制性核酸内切酶BgIⅡ与BamHⅠ的反应混合物中，酶切后的片段再加入含有连接酶的反应体系中。其中，质粒X含有leu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR
要筛选含有重组质粒的Z细胞，应选择 的培养基。
含卡那霉素但不含亮氨酸的培养基
【例5】某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如图所示：
（1）将含有目的基因的DNA与质粒分别用SalⅠ酶切，酶切产物用________ 催化连接后，一个DNA片段的连接结果有________种。
载体自身连接、目的基因自身环化
（1）将含有目的基因的DNA与质粒分别用SalⅠ酶切，酶切产物用______ 催化连接后，两个DNA片段的连接结果有________种。
载体-载体、目的基因-目的基因、载体-目的基因
【例6】研究人员利用Ti质粒构建p—H5/H3共表达重组质粒（如下图)。设计思路是：获得H5基因和H3基因，先将H5基因整合到含卡那霉素抗性基因的T-DNA(仅含有NheⅠ和XhⅠ酶切位点）上，再将H3基因插入，获得重组质粒。为达到实验目的，需在H5基因两端分别引入___________和________________酶切位点。通常酶切位点的引入方法是在PCR过程中，通过设计使其出现在_______中，进而出现在H5基因中。
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。例如， DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 ml/L.的NaCl溶液。在一定温度下， DNA遇二苯胶试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。 目的要求 1.了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。 2.学会DNA粗提取的方法以及用二苯胶试剂对DNA进行鉴定。 材料用具 1.材料：新鲜洋葱（也可以选择香焦、菠菜、菜花和猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同）、研磨液、体积分数为95%的酒精、2 ml/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。研磨液和二苯胺试剂的配制方法参见本书附录2。 2.用具：烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。
方法步骤 1. 称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨。 2.在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1 500 r/min的转速下离心5 min，再取上清液放人烧杯中。 3.在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA，用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10 000 r/min的转速下离心5 min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA )晾于。 4.取两支20 mL的试管，各加入2 ml/L的NaCl溶液5 ml，将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
结果分析与评价 1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。 二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功； 如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
结果分析与评价 2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？ 3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法；对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果；如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等；看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
进一步探究 本实验只是对DNA进行了粗提取，请在阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿一异丙醇混合液(体积比为24:1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是( ) A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氨键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是( ) A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶 C. DNA片段的黏性末端 D.用来识别特定基因的DNA探针
1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分了？
迄今为止，在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样,尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶切speⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ , XbaⅠ、EcRⅤ和XhⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶Spel切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？
xbaⅠ。因为XbaⅠ与Spe Ⅰ切割产生了相同的黏性末端
基因工程：是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫 重组DNA技术
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品
定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍
例1.人的胰岛素基因能通过拼接并在受体细胞大肠杆菌中表达出相同蛋白质--胰岛素的理论基础是？（1）大肠杆菌和人的遗传物质都是 。（2）不同生物的DNA分子能够拼接在一起，原因是 。 （3）同一种基因在不同生物体内表达出来的蛋白质相同，因为 。（4）遗传信息的传递都遵循 。 (5) 为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？ 。
基因的组成、空间结构和碱基互补配对方式相同
所有生物共用一整套遗传密码
① 基因是控制生物性状的独立遗传单位② 遗传信息的传递都遵循中心法则③ 生物界共同一套遗传密码
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。 DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？ 这些“分子工具”各具有什么特征呢？
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
[资料1]1970年，史密斯（)等人首次从大肠杆菌中提取出了一种限制性内切核酸酶（restrictin endnuclease)。这种内切核酸酶能够识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特异性的位点上把双链DNA分子“切割”开（如图)。DNA被切割后所产生的交错的切口，也就是在每条链的一端留下的单链末端，叫做黏性末端。
一、重组DNA技术的基本工具
（1）来源：从微生物（主要是原核生物）体内分离出来（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）切割部位：“切割”的是磷酸二酯键
（1）来源：从微生物（主要是原核生物）体内分离出来（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。（3）作用部位：“切割”的是磷酸二酯键（4）切割结果：切口有两种：黏性末端和平末端
（4）切割结果：大多数限制酶的识别序列由___个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由___个、___个或_________的核苷酸组成
①无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，这就是回文序列。②能被限制酶特异性识别的切割部位基本都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。
A.形成的黏性末端（从5’往3’读）为_____B.一个限制酶切割一次断两个磷酸二酯键形成___个黏性末端C.同一种限制酶切割形成的黏性末端____D.两个黏性末端有___个游离的磷酸基团
练习：流感嗜血杆菌的d菌株( Haemphilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
粘质沙雷氏杆菌（Serratia marcesens）
大肠杆菌（Escherichia cli R）
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内核酸切酶(限制酶)。
【思考1】下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点．请回答下列问题：
（1）请写出同时用EcRⅠ切割含目的基因的DNA的过程。（2）请写出同时用BamH和 HindⅢ切割质粒的过程。
限制酶存在于原核生物中的作用是什么?
原核生物容易受到外源DNA的入侵限制酶的作用:切割外源DNA,使之失效保证自身的安全
限制酶为什么不会剪切原核生物本身的DNA?
DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者DNA分子被修饰（甲基化），使限制酶不能将其切开
【思考3】用限制酶切割时需注意的事项(1)获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是 。但是使用该法缺点是容易发生 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。(2)获取一个目的基因需限制酶切割 次,共产生 个游离的磷酸基团。
为了产生相同的黏性末端，便于连接
分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体
目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接
【思考3】用限制酶切割时需注意的事项 (3)选择限制酶切割位点的基本原则： ①切割目的基因时： 。 ②切割质粒时： 。
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
【例1】①用图1中的质粒和图2中的外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是 。②构建重组质粒时，最好选择限制酶BamHⅠ、HindⅢ处理质粒、外源DNA，这样做的目的是 。
SmaⅠ会破坏质粒中的抗性基因以及破坏目的基因
确保目的基因与质粒的定向连接
【思考4】如图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线
用图2中的人乳铁蛋白目的基因和图1所示的质粒构建重组质粒时，选用的限制酶是 （从“EcRⅠ”、“BamHⅠ/HindⅢ”、“SmaⅠ/HindⅢ”中选择）．不能选择其他限制酶的理由分别是： 。
BamHⅠ/HindⅢ
若选EcRⅠ会破坏质粒的复制原点；若选SmaⅠ/HindⅢ，则构建的重组质粒没有标记基因或复制原点
[资料2]1967年，科学家们发现了一种能够将两个DNA片段连接起来的酶，可以用它来修复DNA链的断裂口，并把这种酶叫做DNA连接酶。1970年，科学家们又提取了一种具有更高活性的T4 DNA连接酶。当两个DNA片段的黏性末端彼此相临，而且它们的碱基能够互补配对时，DNA连接酶就能把它们之间的缝隙“缝合”起来（如图）。
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，形成重组DNA分子。
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段
既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端（但连接平末端的效率相对较低）
旁栏思考（P72）：DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键
需要DNA的一条链为模板
形成完整的DNA分子
①化学本质都是蛋白质②都是催化形成磷酸二酯键
[资料4]1973年，美国科学家科恩（S.Chen)等人从大肠杆菌中提取出了两种质粒，一种含有卡那霉素抗性基因，另一种含有四环素抗性基因。他们将这两种基因分别“切割”下来，并拼接在同一个质粒上，然后导入大肠杆菌，产生了既抗卡那霉素又抗四环素的大肠杆菌。
3.基因进入受体细胞的载体
（1）作用: ① ． ② ．（2）作为运载体需具备的条件: ① ． ② ． ③ ． ④ 等．（3）种类
将目的基因转移到受体细胞中去
利用运载体在受体细胞内对目的基因进行大量复制
能够在宿主细胞中自我复制并稳定保存
有1个至多个限制酶切点，以便与外源基因连接
具有标记基因，便于进行筛选
将外源基因导入大肠杆菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别
（4）λ噬菌体的衍生物或某些动植物病毒作为运载体利用的原理是 .病毒对宿主细胞的侵染具有一定的 性。
利用病毒对宿主细胞的侵染性
【例2】若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。
噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕
霍乱弧菌中含有质粒，但 （填“能”、“不能”）用来做载体，因为选择的载体应该 。
①来源：来源于许多 等生物，它是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的 （化学本质），故质粒有 个游离的磷酸基团②氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为 ，还有如： 等；其作用是 。
用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞
卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因
最好回答：将含有目的基因的受体细胞筛选出来
③复制原点： 。
④在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。⑤细菌质粒是独立于细菌拟核之外的细胞质DNA分子，侵入宿主细胞后 A.有的可以独立地进行自我复制， B.有的则整合到宿主细胞染色体DNA上，随着宿主细胞染色体DNA的复制而同步复制。
⑥若质粒DNA分子的切割末端为 ，
则与之连接的目的基因切割末端应为 ；可使用 把质粒和目的基因连接起来。
CGCGT— A—
请在两张纸上分别写上下面两段DNA序列：
请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcRI的识别序列和切割位点。然后,用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后,将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处,并用透明胶条将切口粘连起来。
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ?
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
根据学生实际操作的情况进行指导。如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
（1）质粒与拟核中的DNA有哪些相同点：（至少写出两点） ① 。 ② 。 ③ 。（2）质粒 （是/不是）一种细胞器。（3）细胞膜上的载体蛋白与基因工程中的载体的区别 ①化学本质不同：细胞膜上的载体： 。基因工程中的载体可能是物质，如 ；也可是生物，如 ；也可是λ噬菌体的衍生物。 ②功能不同：细胞膜上的载体功能是 ;基因工程中的载体是一种“分子运输车”,把 。
具有遗传效应或都能够指导蛋白质的合成等
协助细胞膜控制物质进出细胞
【例4】在基因工程中，已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据下图示判断下列操作错误的是( )
A.质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割B.用限制酶切割获得目的基因时，有四个磷酸二酯键被水解C.限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后获得的黏性末端相同D.质粒中标记基因便于筛选出目的基因已经表达的细胞E.用酶I和酶II形成相同的黏性末端，且用DNA连接酶连接的重组DNA还能用上面两种酶切割
【例5】某线性DNA分子含有3000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是( )
A.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个B.a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接C.a酶与b酶切断的化学键不相同D.用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，
【例6】若要用上图质粒和外源DNA构建重组质粒,需要对质粒进行改造,构建新的限制酶切位点。在构建新的限制酶切位点的过程中需要使用的酶是（ ）
A限制酶PstⅠ、DNA连接酶、DNA聚合酶 B.限制酶EcRⅠ、DNA连接酶、DNA聚合酶C.限制酶EcRⅠ、限制酶PstⅠ、DNA聚合酶D.限制酶PstⅠ、限制酶EcRⅠ、DNA连接酶
1 镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变。检测这种碱基序列必须使用的酶是[ ]A．解旋酶B．DNA连接酶C．限制性核酸内切酶D．RNA聚合酶
镰刀型细胞贫血症是DNA中一个CTT变成CAT,即其中一个碱基T变成A,以致产生病变.致使血红蛋白β链中N端第6个氨基酸由谷氨酸（Glu）转变为缬氨酸(Val) 限制酶识别特定DNA序列
①不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同；【解析：酶具有专一性，识别的序列相同】
你能用DNA连接酶将他们连接起来吗？2和 ； 3和 ；1和 ； 4和 。
②判断两个末端是否为同一种限制酶切割产生的方法：将其中一个末端旋转180度，若与另一个完全相同，则说明两个末端是用同一种限制酶切割
2 已知EcRⅠ的识别序列和切点是—G↓AATTC—，BamHⅠ的识别序列和切点是—G↓GATCC—
③同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同；【解析：酶具有专一性，识别的序列不同】
2 已知BamHⅠ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，Sau3AⅠ的识别序列和切点是—↓GATC—
③同一个DNA分子用不同限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同,(也有可能切割出相同的黏性末端，可以相互配对连接成链）
总结：产生相同的黏性末端不一定都是用同一种限制酶切割
④不同限制酶切割形成的黏性末端，如果互补则可以相互重新配对连接
总结：两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端
用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，序列会明显 （增多、减少、不变）
－TCTAGG－－AGATCC－
总结：两种同尾酶切割的DNA片段连接后，原来的酶切位点将不存在，不能再被原来的限制酶识别
【例1】基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，已知BamHⅠ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，Sau3AⅠ的识别序列和切点是—↓GATC—
酶切结果：BamHⅠ， 。Sau3AⅠ， 。
使用 （限制酶）提取目的基因
【例2】在DNA 测序工作中，需要将某些限制性内切酶的限制位点在 DNA上定位，使其成为 DNA 分子中的物理参照点。这项工作叫做“限制酶图谱的构建”。假设有以下一项实验：用限制酶 HindⅢ，BamHⅠ和二者的混合物分别降解一个 4kb（1kb即1千个碱基对）大小的线性DNA 分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，如下图所示。据此分析，这两种限制性内切酶在该DNA 分子上的限制位点数目是以下哪一组？ A．HindⅢ1个，BamHⅠ2 个 B．HindⅢ2个，BamHⅠ3个C．HindⅢ2个，BamHⅠ1 个 D．HindⅢ和BamHⅠ各有2 个
【例3】限制性内切酶能识别特定的DNA序列并进行剪切，不同的限制性内切酶可以对不同的核酸序列进行剪切。现以3种不同的限制性内切酶对一6.2kb大小的线状DNA进行剪切后。用凝胶电泳分离各核酸片段，实验结果如图所示。请问：3种不同的限制性内切酶在此DNA片段上相应切点的位置（ ）
请问：3种不同的限制性内切酶在此DNA片段上相应切点的位置（ ）
6.2kb大小的线状DNA
3 重组质粒的筛选
3 重组质粒的筛选【例4】为制备目的基因Y（图19）与质粒X（图20）的重组DNA，将质粒X与含Y的DNA片段加入含有限制性核酸内切酶BgIⅡ与BamHⅠ的反应混合物中，酶切后的片段再加入含有连接酶的反应体系中。其中，质粒X含有leu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR
使用BgI II处理重组质粒，可以得到 。
A．长度为3300bp的环状DNA B．长度为3300bp的线形DNA C．长度为2800bp和500bp的线DNA D．长度为2800bp的环状DNA
【例4】为制备目的基因Y（图19）与质粒X（图20）的重组DNA，将质粒X与含Y的DNA片段加入含有限制性核酸内切酶BgIⅡ与BamHⅠ的反应混合物中，酶切后的片段再加入含有连接酶的反应体系中。其中，质粒X含有leu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR
要筛选含有重组质粒的Z细胞，应选择 的培养基。
含卡那霉素但不含亮氨酸的培养基
【例5】某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如图所示：
（1）将含有目的基因的DNA与质粒分别用SalⅠ酶切，酶切产物用________ 催化连接后，一个DNA片段的连接结果有________种。
载体自身连接、目的基因自身环化
（1）将含有目的基因的DNA与质粒分别用SalⅠ酶切，酶切产物用______ 催化连接后，两个DNA片段的连接结果有________种。
载体-载体、目的基因-目的基因、载体-目的基因
【例6】研究人员利用Ti质粒构建p—H5/H3共表达重组质粒（如下图)。设计思路是：获得H5基因和H3基因，先将H5基因整合到含卡那霉素抗性基因的T-DNA(仅含有NheⅠ和XhⅠ酶切位点）上，再将H3基因插入，获得重组质粒。为达到实验目的，需在H5基因两端分别引入___________和________________酶切位点。通常酶切位点的引入方法是在PCR过程中，通过设计使其出现在_______中，进而出现在H5基因中。
DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。例如， DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 ml/L.的NaCl溶液。在一定温度下， DNA遇二苯胶试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。 目的要求 1.了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。 2.学会DNA粗提取的方法以及用二苯胶试剂对DNA进行鉴定。 材料用具 1.材料：新鲜洋葱（也可以选择香焦、菠菜、菜花和猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同）、研磨液、体积分数为95%的酒精、2 ml/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。研磨液和二苯胺试剂的配制方法参见本书附录2。 2.用具：烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。
方法步骤 1. 称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨。 2.在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1 500 r/min的转速下离心5 min，再取上清液放人烧杯中。 3.在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA，用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10 000 r/min的转速下离心5 min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA )晾于。 4.取两支20 mL的试管，各加入2 ml/L的NaCl溶液5 ml，将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
结果分析与评价 1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。 二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功； 如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
结果分析与评价 2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？ 3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法；对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果；如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等；看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
进一步探究 本实验只是对DNA进行了粗提取，请在阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿一异丙醇混合液(体积比为24:1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
1.DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是( ) A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氨键 B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键 C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键 D.只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是( ) A.大肠杆菌的质粒 B.切割DNA分子的酶 C. DNA片段的黏性末端 D.用来识别特定基因的DNA探针
1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分了？
迄今为止，在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样,尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶切speⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ , XbaⅠ、EcRⅤ和XhⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶Spel切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？
xbaⅠ。因为XbaⅠ与Spe Ⅰ切割产生了相同的黏性末端
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