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生物选择性必修3 生物技术与工程第一节 基因工程及其技术课文内容课件ppt
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这是一份生物选择性必修3 生物技术与工程第一节 基因工程及其技术课文内容课件ppt，共47页。PPT课件主要包含了核心素养等内容，欢迎下载使用。
1.简述PCR的原理、条件及过程。2.尝试进行PCR的基本操作并电泳鉴定PCR的产物。
1.生命观念：基于PCR技术，运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等内容。2.科学思维：比较PCR和DNA复制的异同点。
聚合酶链式反应（PCR）技术
DNA解旋酶、DNA聚合酶等
碱基互补配对原则（A与T、C与G配对保证复制的准确进行）
半保留复制、边解旋边复制
DNA聚合酶作用下形成磷酸二酯键
只能从5′－端→3′－端延伸，细胞内有RNA引物结合到模板3′－端引发子链的延伸
PCR（聚合酶链式反应）
1.含义：聚合酶链式反应简称PCR，是目的DNA片段(目的基因)的体外扩增技术。2.原理：DNA分子在不同温度下可变性和复性DNA半保留复制。
通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因。 整个过程是在体外进行，故又叫做体外DNA扩增技术。
模板（目的基因）、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、缓冲溶液（含Mg2+ )
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
1）变性（不需要解旋酶）：当温度上升到 时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。
思考：变性的温度为何是大约94℃的一个温度范围，而不是固定的94℃？
因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。
2）复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过 与两条单链DNA结合。
思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？
①因为Taq酶不能从头开始添加核苷酸。
②引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。
3）延伸：当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
思考1：为什么温度要上升至72℃？
思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？
72℃是Taq酶的最适温度
Taq酶结合在引物的3’端
要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列
可以在短时间内大量扩增目的基因
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。 即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
（1）PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因（开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段）？
（2）如果循环n次，则共需消耗 个引物。 则共需消耗 对引物。
PCR技术与DNA复制过程比较
(1)PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？
不是，PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。
(2)经过第几轮扩增后，循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段？ 比例是多少？
以指数方式扩增，即2n（n为扩增循环的次数）
(3)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？
根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。
使用的两种引物的序列不相同两种引物都结合在DNA模板链的3’端引物长度要适宜引物GC含量要适宜引物自身不应存在互补序列两条引物之间不应存在互补序列退火温度要适宜需在引物的5’端加上限制酶的酶切位点
4.图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答：（1）PCR扩增技术与体内DNA复制相比，DNA解旋的原理一样吗？请说明理由。
不一样；PCR扩增技术是利用高温使DNA变性从而解旋，DNA复制是利用解旋酶解旋。
（2）PCR过程使用的DNA聚合酶有什么特点？
(3)图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？
(4)如果循环n次，则共需消耗多少对引物？
共需消耗2n－1对引物。
(5)图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。
第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。
(6)要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是:第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA 杂交分子;第二步，核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。
用PCR可以扩增mRNA吗？
5.PCR技术的应用(1)广泛应用于医学及分子生物学领域，如：病原体鉴定、 、免疫学研究、癌基因探索及某些疾病治疗等。(2)在古生物学、法医学等方面也有广泛的应用。
(1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应( )(2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列( )(3)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高( )(3)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。 ( )(4)设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列。
1.下列有关PCR技术的说法，错误的是A.PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术B.PCR技术的原理是DNA分子半保留复制C.退火过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D.PCR过程中只需要用到模板DNA、两种引物分子、4种脱氧核苷三磷酸原料
2.聚合酶链式反应(PCR)被广泛用于遗传疾病的诊断、刑事侦查、古生物学和基因工程等领域。利用PCR技术可快速扩增目的基因。下列有关叙述错误的是A.扩增目的基因的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列B.PCR技术需要使用Taq酶的原因是其耐高温C.PCR技术扩增时，两种引物的碱基序列要尽可能互补D.若目的基因扩增5次，则需要消耗62个引物分子
利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
(1)尝试运用PCR仪扩增DNA片段。(2)关注PCR技术的应用。(3)学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的方法和技术。
(1)扩增DNA片段的过程包括 、 和 等步骤的多次循环。(2)理论上，每经过一个循环，样本中DNA片段的数量增加 ，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过n个循环后，DNA片段数量可扩增至原来的 倍。
(3)PCR反应体系包括：DNA模板、 、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、人工合成的 、Taq酶等。(4)在不同阶段，还需要控制PCR仪反应系统的 温度。
PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪或 、微孔加热器(微量恒温仪)等。
DNA模板、dNTP混合物、Taq酶、双蒸水、10×PCR缓冲液等。
(1)PCR扩增目的基因①配制反应体系。
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
②按程序进行扩增。a.94 ℃ 5 minb.94 ℃变性1 minc.55 ℃ 1 mind.72 ℃延伸2 mine.重复b～d,30个循环f.72 ℃ 7～10 min。
(2)电泳分析①电泳：维持恒压 1.5～2 h。②电泳鉴定：采用凝胶成像仪或 观察和记录电泳结果。
实验步骤——琼脂糖凝胶电泳
1.DNA分子大小与凝胶中迁移速率是什么关系？
2.在电泳鉴定中，判断DNA片段扩增是否成功的依据是什么？
可以通过凝胶成像仪或紫外透射仪直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
3.试分析PCR反应中变性时温度低、时间短和退火时的温度过低对实验结果分别产生什么影响？
变性时温度低、时间短可能导致未出现扩增条带；退火时的温度过低可能导致出现非特异性扩增条带。
4.进行电泳鉴定的结果无条带或者不止一条条带，请分析产生这些结果的可能原因。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
(1)影响DNA分子迁移速率的因素有：凝胶的浓度，DNA分子的大小和构象，在本实验中主要考虑DNA分子的迁移速率与其大小成反比。(2)未出现扩增条带的原因主要有：①Taq酶失活。②引物出现质量问题。③Mg2＋浓度过低。④变性时的温度低，变性时间短。(3)出现非特异性扩增条带的原因主要有：①模板DNA出现污染。②引物特异性不强或形成引物二聚体。③Mg2＋浓度过高。④退火时的温度过低等。
(1)PCR的引物为DNA片段并保留在子链中，细胞核内DNA复制所需引物为RNA片段，并且不保留在子链中( )(2)DNA分子的大小影响其在凝胶中的迁移速率( )(3)PCR循环之前，常要进行一次预变性，预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的概率( )
3.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是A.二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量D.二者遵循的碱基互补配对方式相同
4.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是
A.PCR产物的分子大小在250～500 bp之间B.3号样品为不含目的基因的载体DNAC.9号样品对应植株不是所需的转基因植株D.10号确定反应体系等对结果没有干扰
1．PCR(聚合酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示合成过程。下列说法错误的是 ( )A．a过程高温使DNA变性解旋，该过程不需要解旋酶的作用B．c过程要用到的酶在高温下失活，因此在PCR扩增时需要再添加C．如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不标记，控制“94 ℃～55 ℃～72 ℃”温度循环3次，则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占25%D．PCR中由碱基错配引起的变异属于基因突变
2．关于PCR扩增DNA片段和电泳检测扩增产物实验的描述，错误的是( )A．PCR过程需要耐高温的Taq酶B．PCR过程需要DNA连接酶C．PCR扩增区域有2个引物来决定D．不同大小的DNA在电场中迁移速率不同
3．(多选)下图是快速RTPCR过程示意图，①和②为逆转录酶催化的逆转录过程，③是PCR过程。据图分析下列说法错误的是( )
A．逆转录酶具有DNA聚合酶能力B．③PCR过程只需要引物bC．RTPCR不能检测基因表达水平D．RTPCR可检测新冠病毒等RNA病毒
1.简述PCR的原理、条件及过程。2.尝试进行PCR的基本操作并电泳鉴定PCR的产物。
1.生命观念：基于PCR技术，运用结构与功能观等观念理解PCR技术的过程、原理、条件等内容。2.科学思维：比较PCR和DNA复制的异同点。
聚合酶链式反应（PCR）技术
DNA解旋酶、DNA聚合酶等
碱基互补配对原则（A与T、C与G配对保证复制的准确进行）
半保留复制、边解旋边复制
DNA聚合酶作用下形成磷酸二酯键
只能从5′－端→3′－端延伸，细胞内有RNA引物结合到模板3′－端引发子链的延伸
PCR（聚合酶链式反应）
1.含义：聚合酶链式反应简称PCR，是目的DNA片段(目的基因)的体外扩增技术。2.原理：DNA分子在不同温度下可变性和复性DNA半保留复制。
通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因。 整个过程是在体外进行，故又叫做体外DNA扩增技术。
模板（目的基因）、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、缓冲溶液（含Mg2+ )
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
1）变性（不需要解旋酶）：当温度上升到 时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。
思考：变性的温度为何是大约94℃的一个温度范围，而不是固定的94℃？
因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。
2）复性：当温度下降到50℃左右时，两种引物通过 与两条单链DNA结合。
思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？
①因为Taq酶不能从头开始添加核苷酸。
②引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。
3）延伸：当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
思考1：为什么温度要上升至72℃？
思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？
72℃是Taq酶的最适温度
Taq酶结合在引物的3’端
要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列
可以在短时间内大量扩增目的基因
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。 即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
（1）PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因（开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段）？
（2）如果循环n次，则共需消耗 个引物。 则共需消耗 对引物。
PCR技术与DNA复制过程比较
(1)PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？
不是，PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。
(2)经过第几轮扩增后，循环产物中出现位于两种引物之间的DNA片段？ 比例是多少？
以指数方式扩增，即2n（n为扩增循环的次数）
(3)如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？
根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。
使用的两种引物的序列不相同两种引物都结合在DNA模板链的3’端引物长度要适宜引物GC含量要适宜引物自身不应存在互补序列两条引物之间不应存在互补序列退火温度要适宜需在引物的5’端加上限制酶的酶切位点
4.图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答：（1）PCR扩增技术与体内DNA复制相比，DNA解旋的原理一样吗？请说明理由。
不一样；PCR扩增技术是利用高温使DNA变性从而解旋，DNA复制是利用解旋酶解旋。
（2）PCR过程使用的DNA聚合酶有什么特点？
(3)图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？
(4)如果循环n次，则共需消耗多少对引物？
共需消耗2n－1对引物。
(5)图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。
第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。
(6)要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是:第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA 杂交分子;第二步，核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。
用PCR可以扩增mRNA吗？
5.PCR技术的应用(1)广泛应用于医学及分子生物学领域，如：病原体鉴定、 、免疫学研究、癌基因探索及某些疾病治疗等。(2)在古生物学、法医学等方面也有广泛的应用。
(1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应( )(2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列( )(3)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高( )(3)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。 ( )(4)设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列。
1.下列有关PCR技术的说法，错误的是A.PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术B.PCR技术的原理是DNA分子半保留复制C.退火过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则D.PCR过程中只需要用到模板DNA、两种引物分子、4种脱氧核苷三磷酸原料
2.聚合酶链式反应(PCR)被广泛用于遗传疾病的诊断、刑事侦查、古生物学和基因工程等领域。利用PCR技术可快速扩增目的基因。下列有关叙述错误的是A.扩增目的基因的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列B.PCR技术需要使用Taq酶的原因是其耐高温C.PCR技术扩增时，两种引物的碱基序列要尽可能互补D.若目的基因扩增5次，则需要消耗62个引物分子
利用PCR技术扩增DNA片段并完成电泳鉴定
(1)尝试运用PCR仪扩增DNA片段。(2)关注PCR技术的应用。(3)学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段的方法和技术。
(1)扩增DNA片段的过程包括 、 和 等步骤的多次循环。(2)理论上，每经过一个循环，样本中DNA片段的数量增加 ，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过n个循环后，DNA片段数量可扩增至原来的 倍。
(3)PCR反应体系包括：DNA模板、 、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、人工合成的 、Taq酶等。(4)在不同阶段，还需要控制PCR仪反应系统的 温度。
PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像仪或 、微孔加热器(微量恒温仪)等。
DNA模板、dNTP混合物、Taq酶、双蒸水、10×PCR缓冲液等。
(1)PCR扩增目的基因①配制反应体系。
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
②按程序进行扩增。a.94 ℃ 5 minb.94 ℃变性1 minc.55 ℃ 1 mind.72 ℃延伸2 mine.重复b～d,30个循环f.72 ℃ 7～10 min。
(2)电泳分析①电泳：维持恒压 1.5～2 h。②电泳鉴定：采用凝胶成像仪或 观察和记录电泳结果。
实验步骤——琼脂糖凝胶电泳
1.DNA分子大小与凝胶中迁移速率是什么关系？
2.在电泳鉴定中，判断DNA片段扩增是否成功的依据是什么？
可以通过凝胶成像仪或紫外透射仪直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
3.试分析PCR反应中变性时温度低、时间短和退火时的温度过低对实验结果分别产生什么影响？
变性时温度低、时间短可能导致未出现扩增条带；退火时的温度过低可能导致出现非特异性扩增条带。
4.进行电泳鉴定的结果无条带或者不止一条条带，请分析产生这些结果的可能原因。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
(1)影响DNA分子迁移速率的因素有：凝胶的浓度，DNA分子的大小和构象，在本实验中主要考虑DNA分子的迁移速率与其大小成反比。(2)未出现扩增条带的原因主要有：①Taq酶失活。②引物出现质量问题。③Mg2＋浓度过低。④变性时的温度低，变性时间短。(3)出现非特异性扩增条带的原因主要有：①模板DNA出现污染。②引物特异性不强或形成引物二聚体。③Mg2＋浓度过高。④退火时的温度过低等。
(1)PCR的引物为DNA片段并保留在子链中，细胞核内DNA复制所需引物为RNA片段，并且不保留在子链中( )(2)DNA分子的大小影响其在凝胶中的迁移速率( )(3)PCR循环之前，常要进行一次预变性，预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的概率( )
3.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是A.二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量D.二者遵循的碱基互补配对方式相同
4.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是
A.PCR产物的分子大小在250～500 bp之间B.3号样品为不含目的基因的载体DNAC.9号样品对应植株不是所需的转基因植株D.10号确定反应体系等对结果没有干扰
1．PCR(聚合酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示合成过程。下列说法错误的是 ( )A．a过程高温使DNA变性解旋，该过程不需要解旋酶的作用B．c过程要用到的酶在高温下失活，因此在PCR扩增时需要再添加C．如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不标记，控制“94 ℃～55 ℃～72 ℃”温度循环3次，则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占25%D．PCR中由碱基错配引起的变异属于基因突变
2．关于PCR扩增DNA片段和电泳检测扩增产物实验的描述，错误的是( )A．PCR过程需要耐高温的Taq酶B．PCR过程需要DNA连接酶C．PCR扩增区域有2个引物来决定D．不同大小的DNA在电场中迁移速率不同
3．(多选)下图是快速RTPCR过程示意图，①和②为逆转录酶催化的逆转录过程，③是PCR过程。据图分析下列说法错误的是( )
A．逆转录酶具有DNA聚合酶能力B．③PCR过程只需要引物bC．RTPCR不能检测基因表达水平D．RTPCR可检测新冠病毒等RNA病毒
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