2025版高考生物一轮总复习选择性必修3第10单元生物技术与工程第7讲基因工程的基本操作程序和应用及蛋白质工程课件

这是一份2025版高考生物一轮总复习选择性必修3第10单元生物技术与工程第7讲基因工程的基本操作程序和应用及蛋白质工程课件，共60页。PPT课件主要包含了考情研读·备考定位，表达产物，结构和功能清晰，序列数据库，目的基因，PCR，下一代，3构建过程，花粉管通道法，Ca2＋等内容，欢迎下载使用。
考点一　基因工程的基本操作程序
必备知识 · 夯实基础
知|识|巩|固1．目的基因的筛选与获取(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞______或获得预期____________等的基因。(2)筛选合适的目的基因①从相关的已知_____________________的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。②利用_______________和序列比对工具进行筛选。
(3)目的基因的获取①人工合成____________。②常用_________特异性地快速扩增目的基因。
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因________________________________________________，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成及作用
在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给
3．将目的基因导入受体细胞
辨析(1)转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持_______________的过程。此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是____________。(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的_______________上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的_____________上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入_________，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入____________。
(3)农杆菌特点①能在自然条件下侵染_______________和____________，而对大多数_______________没有侵染能力。②农杆菌细胞内含有____________，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
4．目的基因的检测与鉴定
思|维|辨|析易错整合，判断正误。(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。( 　　)(2)构建基因表达载体是基因工程的核心工作。( 　　)(3)启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动DNA的复制过程。( 　　)(4)将生物的所有DNA通过注射或花粉管通道法转入植物细胞中，就可获得具有理想性状的转基因植物。( 　　)
(5)转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。( 　　)(6)Ti质粒上的T－DNA可携带目的基因进入受体细胞，并可将目的基因整合到该细胞的染色体DNA中。( 　　)
延|伸|探|究1．利用PCR扩增目的基因时，为什么要用2种不同的引物？提示：DNA是两条反向平行的双链结构，而复制时只能从固定的方向(模板链的3′端)开始，所以引物的碱基序列是不同的。2．为什么切割含有目的基因的DNA片段和载体要选用同一种限制酶？是否只能用同一种限制酶？提示：选用同一种限制酶切割会产生相同的末端，可以在DNA连接酶的作用下将切割的目的基因和载体连接起来。也可以使用能产生相同末端的限制酶切割。
3．在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上？提示：Ti质粒上的T－DNA也称为可转移的DNA，可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上。
剖析难点 · 考点突破
重|难|精|讲1．PCR技术和DNA复制的比较
归纳总结：(1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。(2)引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。(4)PCR扩增过程中的循环图示与规律
2.如何筛选出含有目的基因的受体细胞
(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果目的基因插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入了四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。(2)被转化的大肠杆菌有三种：含环状目的基因的大肠杆菌、含重组质粒的大肠杆菌、含质粒的大肠杆菌。
(3)筛选方法：将大肠杆菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的大肠杆菌和含质粒的大肠杆菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用灭菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
3．启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
考向一　结合PCR技术的操作和应用，考查科学思维能力　(2024·天津模拟)PCR技术是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，使目的DNA得以迅速扩增。其简要过程如图所示。下列关于PCR技术叙述错误的是 ( 　　)
A．PCR反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板B．PCR技术制备大量DNA时引物要被不断消耗C．DNA的合成方向总是从子链的3′端向5′端延伸D．应用PCR技术与探针杂交技术可以检测特定的基因解析： PCR反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板，A正确；PCR 技术制备大量DNA 时引物要被不断消耗，B正确；DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，C错误；应用PCR技术与探针杂交技术可以检测特定的基因，D正确。
〔变式训练〕　(2024·江苏百校联考)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，经过多次PCR扩增，获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景，下图表示利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列叙述正确的是( 　　)
A．引物中G＋C的含量越低，引物与模板DNA结合的稳定性越高B．在第一阶段由于引物2和引物3发生碱基互补配对，因此两者置于不同反应系统中C．引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行一次复制后，共产生4种双链DNA分子D．在引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形成图示双链DNA，至少要经过3次复制
解析：C与G之间有3个氢键，A与T之间有2个氢键，因此引物中G＋C的含量越高，引物与模板DNA结合的稳定性越高，A错误；由图可知，引物2和引物3分别作用于同一段DNA的两条链，二者会发生碱基互补配对，因此需将它们置于不同反应系统中，B正确；引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行一次复制后，各产生2种双链DNA分子，由于引物1和引物4合成的DNA属于同一种DNA，因此共产生了3种双链DNA分子，C错误；在引物1、2组成的反应系统中，经第一阶段要形成题图所示双链DNA，至少要经过2次复制，D错误。
考向二　围绕基因工程的基本操作程序，考查科学思维能力　( 2024·中原名校联盟)某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题：
(1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是__________；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为___________。该方法中农杆菌的作用是______________________________________________________________。(2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用HindⅢ和SalⅠ两种酶的好处是______________________________________________________________________________________________________。
感染烟草细胞，把目的基因
插入到烟草细胞的染色体DNA上
防止目的基因自连和质粒自连，以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率；防止目的基因与质粒反向连接
(3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？___(填“是”或“否”)。为什么？_______________________________________________。
(4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。
考点二　DNA片段的扩增及电泳鉴定
知|识|巩|固1．实验基础
2．PCR实验操作步骤
延|伸|探|究1．DNA的电泳鉴定实验中，影响DNA分子迁移速率的因素有哪些？提示：凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等。2．若操作者进行电泳鉴定的结果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。提示：不止一条条带的原因：操作过程中混入限制酶将DNA片段切割成片段或含有其他DNA片段，以此为模板，进行了扩增。
考向　围绕DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查科学探究能力某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是( 　　)A．增加模板DNA的量B．延长热变性的时间C．延长延伸的时间D．提高复性的温度
解析：增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少反应非特异性条带，A错误；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性、延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带，B、C错误；非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D正确。
〔变式训练1〕　用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，2～10号为PCR产物；其中2号的模板为野生型植株DNA,3～9号的模板为转基因植株的DNA,10号使用蒸馏水代替模板DNA。PCR时加入的模板DNA如下图所示。据此作出的分析，不合理的是( 　　)A．PCR产物的分子大小在250至500 bp之间B．3号样品植株导入的目的基因一定能成功表达C．9号样品对应植株不是所需的转基因植株D．10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
解析：PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段。3～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型植株和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A合理；3号PCR结果包含250～500 bp片段，包含目的基因，但导入的目的基因不一定能成功表达，B不合理；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C合理；10号使用蒸馏水代替模板DNA，可排除反应体系等对实验结果的干扰，D合理。
〔变式训练2〕　(2024·江苏扬州高三模拟)20世纪70年代，Fred sanger发明了双脱氧终止法对DNA进行测序。其原理如图，在4个试管中分别加入4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)和1种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)；ddNTP可以与dNTP竞争核苷酸链延长位点，并终止DNA片段的延伸。在4个试管中DNA链将会分别在A、C、G及T位置中止，并形成不同长度的DNA片段。这些片段随后可被电泳分开并显示出来。下列说法中正确的是( 　　)
A．这种测序方法需要引物和耐高温的DNA连接酶B．电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤结尾C．测得未知DNA的序列为5′－GATTCGAGCTGA－3′D．ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的5′末端解析：PCR测序需要引物和耐高温的DNA聚合酶，A错误；电泳图谱中的箭头所指的DNA片段以鸟嘌呤结尾，B正确；由图可知，测得未知DNA的序列为5′－TCAGCTCGAATC－3′，C错误；ddNTP与dNTP竞争的延长位点是核苷酸链的3′末端，D错误。
考点三　基因工程的应用和蛋白质工程
知|识|巩|固1．基因工程在农牧业方面的应用
2．基因工程在医药卫生领域的应用
3．基因工程在食品工业方面的应用
脱氧核苷酸序列(基因)
思|维|辨|析易错整合，判断正误。(1)干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛应用。( 　　)(2)用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类一般称为基因工程菌。( 　　)(3)蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是涉及多学科的综合科技工程。( 　　)(4)蛋白质工程的应用为酶制剂产业的发展提供了强大助力。( 　　)
延|伸|探|究1．蛋白质工程为什么通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造？提示：①蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造。②改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传。2．基因工程能否完全满足人们生产和生活的需要，为什么？提示：不能，因为基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，这些蛋白质不一定能完全满足人类的需要。
重|难|精|讲　蛋白质工程与基因工程的异同
考向一　结合基因工程的应用，考查社会责任　红细胞生成素(EPO)是体内促进红细胞生成的一种激素物质，是当今最成功的基因工程药物，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，目前临床使用的红细胞生成素主要来自基因工程技术生产的重组人红细胞生成素(rhEPO)。其简要生产流程如图，下列相关叙述正确的是( 　　)
A．过程①用到的工具酶有DNA聚合酶、限制酶和DNA连接酶B．构建的重组表达载体中终止子的作用是终止翻译过程C．检测重组细胞是否表达出rhEPO常用抗原—抗体杂交技术D．用乳腺生物反应器生产EPO可将人EPO基因导入哺乳动物体细胞获得
解析： 过程①是基因表达载体的构建，需用限制酶切割目的基因和载体，并用DNA连接酶连接，该过程无需DNA聚合酶参与；终止子的作用是终止转录过程；检测重组细胞是否表达出rhEPO，可利用抗原—抗体特异性结合的原理，采用抗原—抗体杂交技术检测；将基因表达载体转入哺乳动物受精卵中，使EPO基因在转基因雌性动物的乳腺细胞中表达，通过分泌的乳汁来生产EPO，目前还不能直接用高度分化的体细胞克隆哺乳动物。
考向二　结合蛋白质工程，考查社会责任(2024·山东淄博期中)纤维素酶广泛应用于医药、食品发酵、造纸、废水处理等领域。研究人员利用蛋白质工程将细菌纤维素酶的相应氨基酸替换后，纤维素酶热稳定性得到了提高。下列有关该技术的说法，正确的是( 　　)A．改造后的纤维素酶的较高热稳定性不可遗传B．对纤维素酶的改造需要以基因工程为基础C．改造纤维素酶无需构建基因表达载体D．对纤维素酶的改造是通过直接改造mRNA实现的
解析：由于蛋白质工程是进行了基因改造，所以改造后的纤维素酶的较高热稳定性是可遗传的，A错误；对纤维素酶的改造需要以基因工程为基础，B正确；改造纤维素酶同样需构建基因表达载体，C错误；对纤维素酶的改造是通过改造控制合成纤维素酶的基因来实现的，D错误。
〔变式训练〕　(2023·湖北孝感高中质检)下图表示蛋白质工程的操作过程，相关说法不正确的是( 　　)A．a、b过程分别是转录、翻译B．蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作C．蛋白质工程是完全摆脱基因工程技术的一项全新的生物工程技术D．蛋白质工程中可能构建出一种全新的基因
解析： a过程是以DNA的一条链为模板合成mRNA的转录过程，b过程是以mRNA为模板合成具有一定氨基酸顺序的多肽链的翻译过程，A正确；蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活需求，因此蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作，B正确；蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，C错误；蛋白质工程中，可能根据已经明确的蛋白质的结构构建出一种全新的基因，D正确。
素养提升 · 强化思维
|情境试题　规范作答|阅读下列材料，回答下列问题：基因的魔剪——CRISPR/Cas系统二倍体马铃薯存在自交不亲和的现象，导致无法使用种子种植马铃薯①。二倍体马铃薯的自交不亲和是由核糖核酸酶基因(S－RNase)控制的，科研人员通过基因编辑技术敲除了马铃薯的S－RNase基因，获得自交亲和的二倍体马铃薯②，为马铃薯杂交育种提供了新的技术。如图是科研人员用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点敲除S－RNase基因的示意图。
(1)用于编辑不同基因的CRISPR/Cas9复合物中向导RNA碱基序列不同，因此首先要确定S－RNase基因中的待编辑序列，可以通过PCR技术扩增S－RNase基因③，作为编码特定向导RNA的模板。扩增时需要根据________________________________设计引物，引物的作用是_________________________________________________。
S－RNase基因的脱氧核苷酸序列
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
(2)CRISPR/Cas9系统能精准识别相关基因，依据的原理是向导RNA与目标DNA发生_____________；Cas9蛋白可催化____________(填化学键名称)水解，剪切特定DNA片段。(3)欲检测经上述基因编辑技术得到的植株是否已具有自交亲和性状，最简便的方法是________________________________。
让该植株自交，观察能否产生种子
真|题|再|现1．(2023·浙江卷)紫外线引发的DNA损伤，可通过“核苷酸切除修复(NER)”方式修复，机制如图所示。着色性干皮症(XP)患者的NER酶系统存在缺陷，受阳光照射后，皮肤出现炎症等症状。患者幼年发病，20岁后开始发展成皮肤癌。下列叙述错误的是( 　　)
A．修复过程需要限制酶和DNA聚合酶B．填补缺口时，新链合成以5′到3′的方向进行C．DNA有害损伤发生后，在细胞增殖后进行修复，对细胞最有利D．随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释
解析： 由图可知，修复过程中需要将损伤部位的序列切断，因此需要限制酶的参与；同时修复过程中，单个的脱氧核苷酸需要依次连接，要借助DNA聚合酶，A正确；填补缺口时，新链即子链的延伸方向为5′到3′的方向进行，B正确；DNA有害损伤发生后，在细胞增殖中进行修复，保证DNA复制的正确进行，对细胞最有利，C错误；癌症的发生是多个基因累积突变的结果，随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释，D正确。故选C。
2．(2023·浙江卷)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3－GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是( 　　)A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3－GFP基因纯合子D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
解析：分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合在Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GFP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误；因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3－GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；用引物1和引物3进行PCR扩增，扩增出的片段大小差异较小，无法较好的区分片段，D错误。故选B。
3．(2023·山东卷)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是______________除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有_________________________________________ (答出2个结构即可)。(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物___________________。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
限制酶切割位点、标记基因、
F2与R1或F1与R2
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了__________________，条带2所检出的蛋白_________(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
解析：(1)基因表达载体中启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因(如抗性基因)，以便于重组DNA分子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
(2)据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2与R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3′－5′，非模板链(也就是a链)是5′－3′；考虑到DNA复制的方向是子链的5′－3′，引物延伸的方向肯定是5′－3′，所以引物结合的单链其方向是3′－5′；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′－5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。
(3)据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J－V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
4．(2023·广东卷)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题：(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与_________植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和_________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备________________。(3)转化后，T－DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图)，用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了________________________________。②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约______%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株______(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到_________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
解析：(1)根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。(2)利用PCR技术扩增DAI基因后，应该用同种限制性内切核酸酶对DAI基因和运载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。
(3)①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌(T－DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因)液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。
②T1代阳性植株都含有DAI基因，由于T－DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。
③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150 bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150 bp，突变型有50 bp和100 bp，如图：
5．(2021·辽宁卷)PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因)，大小为0.9 kb(1 kb＝1 000碱基对)，利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：(1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经_________过程得到cDNA，将其作为PCR的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入_________和_________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用_________________ (填“E.cli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。
相关限制酶的识别序列及切割位点
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于_________的生理状态，以提高转化效率。(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落(分别编号为1、2、3、4)培养并提取质粒，用(2)中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2，___号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2 kb的DNA分子条带未出现在图中
解析：(1)利用RNA获得cDNA的过程称为逆转录。(2)根据启动子和终止子的作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间，从图中看出，两者之间存在三种限制酶切点，但是由于KpnⅠ在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcRⅠ和PstⅡ两种不同限制酶；根据PstⅡ的酶切序列可知，其酶切产物为平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4 DNA连接酶连接质粒和目的基因。(3)转化时用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。
(4)由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和质粒，如果用EcRⅠ和PstⅡ两种酶切割重组质粒，电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带，由于phb2基因大小为0.9 kb，所以对应电泳图中的菌落3。
6．(2022·山东卷)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 _________________________________________________。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。
两种引物分别与两条模板链3′端
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是_______________________________________________________________________________________________________________________________________。
在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变
修改扩增P基因时使用的带有EcRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是________________________________________________________________________________。
在EcRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG－P、FLAG－P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG－P和FLAG－P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是_________________________；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是___________________________________________。
促进UBC与FLAG－P的结合
的特定序列是与UBC结合的关键序列
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是________________________________________________________________________________________。
与FLAG－P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的
解析：(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。
(2)融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图甲可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变。可通过在EcRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。