专题24 基因工程-备战2024年高考生物一轮复习抢分特训（全国通用）

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考点1 重组DNA技术的基本工具
1．切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，简称限制酶，这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。它们能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，产生黏性末端或平末端两种形式的末端。
2．DNA连接酶分为两类，一类是E.cli DNA连接酶，另一类是T4DNA连接酶。后者既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率相对较低。
3．质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
4．在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。这些质粒上常有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选。
5．在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。
6．载体必须具备的条件：①能在受体细胞中保存下来并能自我复制；②具有1个或多个限制酶切割位点，以便与外源基因连接。③具有标记基因。
7．DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2 ml/L的NaCl溶液。在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。
考点2 基因工程的基本操作程序
1．培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
2．PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
3．PCR技术可以分为变性、复性和延伸三步。
4．PCR反应过程可以在PCR扩增仪（PCR仪）中自动完成，完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
5．基因表达载体要包括以下四个基本的结构：目的基因、启动子、终止子、标记基因。
6．构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
7．启动子位于目的基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位。
8．标记基因的作用：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。（或供重组DNA的鉴定和选择）。
9．花粉管通道法有多种操作方式。例如，可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。除此之外，将目的基因导入植物细胞常用的方法还有农杆菌转化法。
10．转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
11．农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T－DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T－DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。
12．检查转基因抗虫棉是否培育成功，首先是分子水平的检测，包括通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA；从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。其次，还需要进行个体生物学水平的鉴定。例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
13．在获得转基因产品的过程中，还可以通过构建基因文库来获取目的基因。
14．将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中，这个受精卵将发育成为具有新性状的动物。在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。研究人员一般先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
考点3 基因工程的应用
1．科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物，这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。
2．用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类一般称为基因工程菌。
3．目前，科学家正尝试利用基因工程技术对猪的器官进行改造，采用的方法是在器官供体的基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，然后再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
考点4 蛋白质工程的原理和应用
1．蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。
2．基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质，这些天然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。
3．蛋白质工程的基本思路是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。
真 题 回 顾
1．（2023·江苏·统考高考真题）某生物社团利用洋葱进行实验。下列相关叙述正确的是（ ）
A．洋葱鳞片叶内表皮可代替半透膜探究质膜的透性
B．洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂，溶液即呈砖红色
C．制作根尖有丝分裂装片时，解离、漂洗、按压盖玻片都能更好地将细胞分散开
D．粗提取的DNA溶于2ml/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后显蓝色
【答案】A
【解析】洋葱鳞片叶内表皮的原生质层具有选择透过性，可代替半透膜探究质膜的透性，A正确；洋葱匀浆中加入新配制的斐林试剂，需要水浴加热才可能出现砖红色沉淀，若出现砖红色，则可说明洋葱匀浆中含有还原糖，B错误；制作根尖有丝分裂装片时，解离、按压盖玻片得目的都是为了获得单层细胞，即这些操作均能更好地将细胞分散开，C错误；粗提取的DNA溶于2ml/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂后经过水浴加热可显蓝色，D错误。
2．（2023·浙江·统考高考真题）紫外线引发的DNA损伤，可通过“核苷酸切除修复（NER）”方式修复，机制如图所示。着色性干皮症（XP）患者的NER酶系统存在缺陷，受阳光照射后，皮肤出现炎症等症状。患者幼年发病，20岁后开始发展成皮肤癌。下列叙述错误的是（ ）
A．修复过程需要限制酶和DNA聚合酶
B．填补缺口时，新链合成以5’到3’的方向进行
C．DNA有害损伤发生后，在细胞增殖后进行修复，对细胞最有利
D．随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释
【答案】C
【解析】由图可知，修复过程中需要将损伤部位的序列切断，因此需要限制酶的参与；同时修复过程中，单个的脱氧核苷酸需要依次连接，要借助DNA聚合酶，A正确；填补缺口时，新链即子链的延伸方向为5’到3’的方向进行，B正确；DNA有害损伤发生后，在细胞增殖中进行修复，保证DNA复制的正确进行，对细胞最有利，C错误；癌症的发生是多个基因累积突变的结果，随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释，D正确。
3．（2023·湖北·统考高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落
【答案】D
【解析】若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确。 若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
4．（2023·浙江·统考高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。

下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
【答案】B
【解析】分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GEP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误；因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；用引物1和引物3进行PCR扩增，扩增出的片段大小差异较小，无法较好的区分片段，D错误。
5．（2023·广东·统考高考真题）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（ ）
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
【答案】D
【解析】裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2ml/L的NaCl溶液， 将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确；将DNA溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。
6．（2023·山西·统考高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。

下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. cli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. cli DNA连接酶连接
【答案】C
【解析】酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。
7．（2023·江苏·统考高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：

(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用______。

A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC’
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是 。
【答案】(1) 模板（片段F1、片段F2）、引物 引物
(2)CD
(3)限制性核酸内切酶（限制酶）
(4)ABC
(5)P3、P4
(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列
【解析】（1）PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。
（2）由图1可知，引物F2-F用于扩增F2片段，引物F1-R用于扩增F1片段，C选项中5'-GACGAG-3'能与AnBI中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F选用C。D选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP中的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R选用D。
（3）传统重组质粒构建需要使用限制性核酸内切酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在DNA连接酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性核酸内切酶（限制酶）。
（4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于30，A错误；
B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B错误；
C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；
D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。
故选ABC。
（5）EGFP为720bp，AnBI为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1100bp，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。
（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
8．（2023·北京·统考高考真题）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。
(1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能与 互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短时间内即被降解。
(2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从 点到 点。
(3)为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列（x），但L的功能正常；②Ce酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失；③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。请完善制备小鼠IK的技术路线： →连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→ →获得小鼠IK。
(4)各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是 。
【答案】(1)A/腺嘌呤
(2) Q R
(3) 将Ce酶基因和Er基因连接 饲喂口服药T
(4)大多数B细胞没有被BrdU标记
【解析】（1）分析题意可知，EdU和BrdU都是胸腺嘧啶（T）类似物，根据碱基互补配对的原则可知，掺入DNA的EdU和BrdU均能与A（腺嘌呤）互补配对，并可以被分别检测。
（2）DNA分子复制时会发生模板链与子链的碱基互补配对，据题可知，将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，则EdU会与A结合，导致子链出现放射性，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，则BrdU也会与A结合，使放射性增强，最终实现双标记，随复制完成达到峰值，故结合题图可知，图中反映DNA复制所需时长的是从Q点到R点。
（3）分析题意，要制备IK小鼠，需要用诱导型基因敲除小鼠，而饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，结合所给实验材料及药物可知，制备小鼠IK的技术路线为：将Ce酶基因和Er基因连接（Ce酶可作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失）→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→饲喂口服药T（诱导Er蛋白进入细胞核）→获得小鼠IK。
（4）据题可知，变胖过程中增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ），由于但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，若先用EdU饲喂小鼠IK，各种细胞DNA复制所需时间基本相同，t2时间已经经过一个细胞周期，所有的细胞应都含有EdU标记，实验假设是变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，即来源于途径I，该过程已经复制的B细胞直接分裂，不会再有DNA复制过程，故t2时间后用BrdU饲喂则不起作用，即大多数B细胞没有被BrdU标记。
9．（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB法）。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。
回答下列问题。
(1)图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和 ，该过程还需要光照，其作用是 。
(2)图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的 。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注 。
(3)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是 。
(4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ，依据是 。
(5)与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点是 （答出2点即可）。
【答案】(1) 脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需要
(2) 遗传特性 转基因标识
(3)Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起
(4) 荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根 观察幼苗是否表现出白化特征 PDS缺失会导致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除
(5)操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。
【解析】（1）图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于脱分化过程，该过程的本质是使细胞失去原来特定的结构和功能；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和细胞分裂素，这两种激素的比值能调控愈伤组织的分化方向，该过程还需要光照，因为叶绿素的形成需要光；且叶绿体利用光能制造有机物，供试管苗生长发育。
（2）图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的遗传特性。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注转基因种子，即进行转基因标识。
（3）图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，利用了农杆菌含有的Ti质粒的作用，Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起。
（4）已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B，该过程中通过荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根即为阳性毛状根段，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是观察幼苗是否表现出白化特征，因为PDS缺失会导致植株白化，而白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除。
（5）与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点主要表现在操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。
10．（2023·浙江·统考高考真题）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：
(1)植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于 。根据这种调节方式，在培养基中添加 ，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。
(2)随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：
①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过检索 获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。
②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生 ，表达载体最终进入细胞核，发生转化。
③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为 。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了 重组细胞发育的作用。
④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至 ，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以 为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行 处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为 ，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？ 。
【答案】(1)负反馈调节 过量赖氨酸类似物
(2) 基因数据库 融合 核受体细胞 激活 早期囊胚 转基因BEF
DNA酶 PCR的模板 构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。
【解析】（1）负反馈调节是指在一个系统中，系统工作的效果，反过来又作为信息调节该系统的工作，并且使系统工作的效果减弱或受到限制，有助于系统保持稳定。植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于负反馈调节。如果想得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体可在培养基中添加过量赖氨酸类似物。
（2）①从基因数据库获取获取目的基因编码序列，用化学合成法制备可得到目的基因。
②表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，根据细胞膜成分，其与BEF膜发生融合。
③去核的卵母细胞作为受体细胞，其处于减数第二次分裂中期，因为卵母细胞中含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了激活重组细胞发育的作用。
④胚胎发育到适宜阶段可取出向受体移植。牛、羊一般要培养到桑椹胚或囊胚阶段；植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。
⑤阳性对照：按照当前实验方案一定能得到正面预期结果的对照实验。阳性对照是已知的对测量结果有影响的因素，目的是确定实验程序无误。阴性对照和阳性对照相反，按照当前的实验方案一定不能得到正面预期结果的对照实验。排除未知变量对实验产生的不利影响。本实验以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，为了检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。应该以含有目的基因的牛耳组织细胞为阳性对照。为了除去DNA污染，可以使用DNA酶使其水解。经逆转录形成cDNA，并以此为PCR的模板进行扩增。目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是构建的表达载体只含有乳腺特异性启动子，只能在乳腺细胞中启动转录，而在牛耳细胞中不能表达。
11．（2023·天津·统考高考真题）基因工程：制备新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是 （填“细胞内”和“细胞外”）
(2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员，运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A．B，已知酵母菌体内DNA有许多A-B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物 对目的基因进行PCR。
(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。
（i）导入目的基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA基因，再重新导入。研究人员在UGA基因序列两端加上酵母菌DNA中不存在的同源C．C’序列，以便对UGA基因进行切除。C．C’的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA片段在切割后是否可以顺利重连，如图，则应选择方式 进行连接。
（ii）切去UGA基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。
(4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图 。


【答案】(1)细胞外
(2)P1和P6
(3) 缺乏尿嘧啶 方式二 含有5-氟乳清酸
(4)图3
【解析】（1）由于酵母菌不能吸收淀粉，所以导入分解淀粉的酶发挥作用的场所在细胞外。
（2）根据题干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入”，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，需要选择P1和P6这对引物进行PCR。
（3）（i）选择了尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，则应该将酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培养基上培养，如果导入成功，则形成菌落；如果没有导入，则缺乏尿嘧啶，不能生存；
方式一，C和C'方向相反，如果切割，则末端在一条链上，不能连接，所以选择方式二，连接方向相同，切割后形成末端，便于连接。
（ii）由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，所以应该在含有5-氟乳清酸的培养基上，如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。
（4）根据前面分析，C和C'的中间插入UGA，A和B之间插入的目的基因，所以图3正确。
12．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。
【答案】(1) RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等
(2) F2和R1或F1与R2 a链
(3) J-V5融合蛋白 不是
【解析】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
（2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。
（3）据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
13．（2023·湖北·统考高考真题）某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
回答下列问题：
(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞（含浆细胞） （填“需要”或“不需要”）通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是 。
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基（如HAT培养基），该培养基对 和 生长具有抑制作用。
(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是 。
(4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是 。
【答案】(1) 不需要
使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
(2) 未融合的亲本细胞 融合的具有同种核的细胞
(3)通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞
(4)④
【解析】（1）浆细胞是高度分化的细胞，不能增殖，所以不需要通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物质PEG可使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
（2）在杂交瘤细胞筛选过程中，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。
（3）单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原-抗体杂交技术，抗体检测呈阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。
（4）DNA连接酶能连接DNA片段，脱氧核苷酸的磷酸基团位于5'端，-OH位于3'端，①②③脱氧核苷酸链的两端基团有误；DNA连接酶能催化合成磷酸二酯键，即将一条脱氧核苷酸5'端的磷酸基团与另一条脱氧核苷酸链的3'端的-OH相连，④符合题意。
故选④。
14．（2023·全国·统考高考真题）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是 。
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。
(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取 进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是 。
(4)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
【答案】(1)重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖
(2) 筛选 RNA聚合酶
(3) 核染色体DNA 被标记的目的基因的单链DNA片段
(4)通过使用相应抗体，利用抗原-抗体杂交技术，检测mRNA是否翻译形成蛋白质
【解析】（1）重组乙肝疫苗的成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。蛋白质注入人体后，无法完成病毒遗传物质的复制与蛋白质的合成，无法独立增殖。
（2）抗生素抗性基因作为标记基因，用于转化细胞的筛选。
RNA聚合酶结合目的基因启动子并驱动转录。
（3）检测的对象是目的基因是否插入染色体中，故提取酵母细胞染色体进行目的基因鉴定。
基因探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列。
（4）要检测出目的基因是否表达，除了需要检测目的基因是否插入染色体外，还需要检查目的基因是否转录与表达。检测是否转录，用核酸分子杂交技术，检测是否翻译用抗原-抗体杂交技术。
15．（2023·浙江·统考高考真题）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：
(1)根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备 的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的 为外植体。
(2)植物细胞壁的主要成分为 和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的 失活。对处理后的原生质体在显微镜下用 计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是 。
(3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于 。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？
A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂
B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂
C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂
D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂
(4)愈伤组织经 可形成胚状体或芽。胚状体能长出 ，直接发育形成再生植株。
(5)用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路：
Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的 。
Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系， 为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。
Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经 后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的 个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
【答案】(1) 再生 叶
(2) 纤维素 细胞质和细胞核 血细胞计数板 降低PEG浓度，使其失去融合作用
(3) 同一个杂种融合原生质体 ABD
(4) 再分化 根和芽
(5) 模板 M1、M2 凝胶电泳 1
【解析】（1）在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备再生的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的叶为外植体。
（2）植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应，在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的细胞质和细胞核失活，融合后具有甲植物的细胞核基因和乙植物的细胞质基因。对处理后的原生质体在显微镜下用血细胞计数板计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是降低PEG浓度,使其失去融合作用。
（3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于同一个杂种融合的原生质体。未融合的原生质体因为细胞质或细胞核的失活，无法正常生长、分裂；同种融合的原生质体也因为甲原生质体细胞质或乙原生质体细胞核失活而不能生长、分裂；只有杂种细胞才具备有活性的细胞质和细胞核，可以生长、分裂，因此这些愈伤组织只能来自于杂种细胞。故选ABD。
（4）愈伤组织经再分化可形成胚状体或芽。胚状体能长出根和芽，直接发育形成再生植株。
（5）Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的模板。
Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系，M1、M2为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。
Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经凝胶电泳后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的1个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
16．（2023·广东·统考高考真题）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和 进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。
(3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。

①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 （填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑 。

【答案】(1)野生型
(2) 载体（基因表达载体） 启动子和终止子
(3) DAI基因和卡那霉素抗性基因 75 自交 100
【解析】（1）根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。
（2）利用PCR技术扩增DAI基因后，应该用同种限制性核酸内切酶对DAI基因和运载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。
（3）①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌（T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因）液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基（含有卡那霉素）上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。
②T1代阳性植株都含有DAI基因，由于T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。
③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150bp，突变型有50bp和100bp，如图：
。
新 题 尝 鲜
1．（2023春·高二课时练习）从图甲酶切结果分析，图乙中目的基因（长度为2.0kb）插入方向正确的重组质粒序号和作出该判断所用的限制酶是（ ）

A．②，BamHⅠB．①，EcRⅠ
C．①，EcRⅠ和HindⅢD．②，EcRⅠ和HindⅢ
【答案】C
【解析】分析图1可知，重组质粒被EcRⅠ酶切后，得到5.8kb的片段，说明重组质粒中只有一个EcRⅠ的酶切位点；重组质粒被BamHⅠ酶切后产生3.8kb和2.0kb两种片段，说明重组质粒中有2个BamHⅠ的酶切位点；重组质粒被EcRⅠ和HindⅢ酶切后，产生4.5kb和1.3kb两种片段，说明重组质粒中有EcRⅠ和HindⅢ的酶切位点，且二种酶切位点之间的片段为4.5kb和1.3kb。结合图2分析可知，重组质粒①符合上述分析的结果，重组质粒②中EcRⅠ和HindⅢ酶切位点之间的片段为2.3kb和3.5kb，不符合图1酶切的结果。综上所述，C正确，ABD错误。
2．（2023春·高二课时练习）下列关于基因工程各种工具的叙述，错误的是（ ）
A．E .cliDNA连接酶只能“缝合”黏性末端
B．限制酶主要来自原核生物，限制酶一般不切割自身DNA
C．载体上必须有2个以上限制性内切核酸酶的切割位点
D．限制酶断开磷酸二酯键，T4DNA连接酶能恢复磷酸二酯键
【答案】C
【解析】E•cliDNA连接酶只能“缝合”黏性末端，T4DNA连接酶能“缝合”平末端和黏性末端，A正确；限制酶主要从原核生物中分离纯化出来，细胞内含有的限制酶一般不对自身DNA进行剪切，只切割外源DNA，这是在长期的进化过程中形成的一种保护，B正确；
载体上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中，C错误；限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键，D正确。
3．（2023秋·河南·高三校联考开学考试）水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需要施加氮肥。科学家想利用基因工程技术将相关基因导入水稻细胞中，建立水稻“小型化肥厂”,让水稻直接固氮，减少使用氮肥的生产成本以及可能造成的环境污染。下列相关叙述错误的是（ ）
A．PCR 技术可用于固氮基因的获取和检测
B．实验中需将转基因水稻种植在缺氮培养液中进行筛选
C．为了提高 PCR 扩增固氮基因的特异性，可适当增加引物长度并降低复性温度
D．PCR 实验中使用的微量离心管和枪头等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理
【答案】C
【解析】PCR技术的原理是模拟生物体内DNA分子复制过程，故用PCR技术可从根瘤菌DNA中获取固氮基因，也可用于固氮基因的检测，A正确；若要检测转基因水稻是否成功，可将该水稻种于缺氮的培养液，若无缺乏症，则可证明转基因成功，B正确；若要提高PCR扩增固氮基因的特异性，因引物延长，与模板特异性结合能力更强，可耐受较高的复性温度，所以应可适当增加引物长度并提高复性温度，C错误；为避免杂菌的DNA污染，所用装置应该严格灭菌，D正确。
4．（2023秋·重庆万州·高三重庆市万州第二高级中学校考阶段练习）图甲、乙中标注了相关限制酶的酶切位点。下列关于培育转基因大肠杆菌的叙述错误的是（ ）
A．若通过PCR获取该目的基因，应该选用引物甲和引物丙
B．图中质粒和目的基因构建表达载体，应选用BclⅠ和Hind Ⅲ剪切
C．若将基因表达载体导入受体细胞中，需选用Ca2+转化法
D．在受体细胞中，氨苄青霉素抗性基因和目的基因可同时表达
【答案】D
【解析】引物是根据目的基因两侧序列获得，需要与目的基因两端互补，故若通过PCR技术大量扩增该目的基因，应该选用引物甲和引物丙，A正确；图甲中BamHⅠ会破坏两种抗性基因，不能选用，故图乙中目的基因左侧只能选BclⅠ，而质粒上没有目的基因右侧Sau3A的切点，两者都有Hind Ⅲ的切点，为了防止目的基因与质粒随意连接，故质粒和目的基因构建表达载体，应选用BclⅠ和Hind Ⅲ剪切，B正确；若将基因表达载体导入受体细胞大肠杆菌时，需用钙离子等处理，使其处于易于吸收外源DNA的状态，C正确；在受体细胞中，插入目的基因时氨苄青霉素抗性基因被破坏，不能和目的基因同时表达，D错误。
5．（2023春·高二课时练习）科学家运用基因工程技术，将人血清白蛋白基因导入山羊的受精卵中，培育出羊乳腺生物反应器，使羊乳汁中含有血清白蛋白。以下相关叙述正确的是（ ）
A．该转基因羊中的血清白蛋白基因只存在于乳腺细胞中
B．可用显微注射技术将含有目的基因的表达载体导入羊的乳腺细胞中
C．血清白蛋白基因需要与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件进行重组
D．利用乳腺生物反应器生产药物不受性别和生殖期的限制
【答案】C
【解析】本过程是把人血清白蛋白基因导入山羊的受精卵中，因此在山羊的各个细胞中都含有血清白蛋白基因，A错误；以动物细胞作为受体细胞时，常采用显微注射技术将含有目的基因的表达载体导入羊的受精卵（全能性高）中，B错误；若想血清白蛋白基因在乳腺中表达，则应将血清白蛋白基因需要与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件进行重组，C正确；
由于只有雌性动物在哺乳期才会分泌乳汁，因此药物的生产会受到转基因动物性别和年龄的限制，D错误。
6．（2023春·河南许昌·高二校考期中）蜘蛛丝(丝蛋白)被称为“生物钢”，有着超强的抗张强度，可制成防弹背心、降落伞绳等，还可被制成人造韧带等。科学家研究出集中生产蜘蛛丝的方法—一培育转基因蜘蛛羊作为乳腺生物反 应器。下列有关乳腺生物反应器的说法，错误的是（ ）
A．将蜘蛛丝蛋白基因与乳腺中特异性表达的基因的启动子等结合在一起构建成表达载体
B．将含有丝蛋白基因的表达载体导入动物乳腺细胞中即可获得乳腺生物反应器
C．与乳腺生物反应器相比，膀胱生物反应器不受性别等限制，受体来源更广泛
D．转基因动物产生的生殖细胞中可能含有药用蛋白基因
【答案】B
【解析】该过程需要将蜘蛛丝蛋白基因与乳腺中特异性表达的基因的启动子等结合在一起构建成表达载体，再通过显微注射导入受精卵中，A正确；将含有丝蛋白基因的表达载体导入动物受精卵中才可获得乳腺生物反应器，B错误；与乳腺生物反应器（只能选雌性）相比，膀胱生物反应器不受性别等限制，受体来源更广泛，C正确；转基因动物产生的生殖细胞可能含有药用蛋白基因，因为体细胞中含有药用蛋白基因，D正确。
7．（2023春·高二课时练习）下列有关生物工程的叙述，不正确的有（ ）
①基因工程的核心步骤是构建基因表达载体
②蛋白质工程可通过直接改造蛋白质的结构从而改变其功能
③克隆羊的培育涉及细胞核移植、早期胚胎培养和胚胎移植等技术
④PCR技术需要酶打开DNA双链
⑤利用核移植技术可以培育试管婴儿
⑥牛胚胎发育的历程是：受精卵→桑椹胚→囊胚→原肠胚→幼体
⑦利用动物细胞培养技术和细胞融合技术可以制备单克隆抗体
③利用植物茎尖培养脱毒苗时，需要对离体的茎尖、培养基等进行灭菌
A．一项B．两项C．三项D．四项
【答案】D
【解析】①为了使目的基因在受体细胞中稳定存在并且遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用，需要构建基因表达载体，该步是基因工程的核心步骤，①正确；
②蛋白质工程通过对基因修饰或基因合成间接改造蛋白质的结构从而改变其功能，②错误；
③克隆羊的培育是借助核移植技术完成的，涉及到细胞核移植、早期胚胎培养和胚胎移植等技术，③正确；
④PCR技术利用高温打开DNA双链，④错误；
⑤利用体外受精技术可以培育试管婴儿，⑤错误；
⑥哺乳动物牛的胚胎发育过程均为：受精卵→桑葚胚→囊胚→原肠胚→幼体，⑥正确；
⑦单克隆抗体的制备是利用动物细胞融合技术将免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞进行融合以获得杂交瘤细胞，将该杂交瘤细胞进行克隆化培养而获得的抗体即为单克隆抗体，而细胞融合技术的基础是动物细胞培养技术，⑦正确；
⑧利用植物茎尖培养脱毒苗时，植物的茎尖病毒极少、甚至没有病毒，不需要对其进行灭菌处理，但为了防止杂菌污染，需要对培养基等进行灭菌处理，⑧错误。综上所述，A、B、C错误，D正确。
8．（2023春·高二课时练习）天然胰岛素制剂容易发生聚合，会在一定程度上延缓药效。科学家通过蛋白质工程将胰岛素B链28位脯氨酸替换为天冬氨酸或者将它与B29位的赖氨酸交换位置，从而有效抑制了胰岛素的聚合，研发出速效胰岛素。下列说法错误的是（ ）
A．设计速效胰岛素首先要从避免胰岛素形成聚合体这一预期功能开始
B．该过程通过改造胰岛素基因实现了对相应氨基酸序列的改造
C．速效胰岛素在受体细胞中合成时遵循中心法则
D．该过程若使用大肠杆菌作为受体细胞，可直接生产有生物活性的胰岛素
【答案】D
【解析】对胰岛素进行分子设计的主要依据是胰岛素的预期功能，而后再进行预期蛋白质结构的设计，A正确；设计胰岛素的改造中，要对胰岛素基因的结构进行改造，因此，蛋白质工程又叫做第二代基因工程，B正确；速效胰岛素的化学本质是蛋白质，因此其在受体细胞中合成时遵循中心法则，C正确；该过程若使用大肠杆菌作为受体细胞，不能直接生产有生物活性的胰岛素，因为大肠杆菌是原核生物，细胞中没有内质网和高尔基体，因而不能对多肽链进行加工，D错误。
9．（2023秋·福建龙岩·高三上杭一中校考阶段练习）为使水稻获得抗除草剂性状，科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入水稻植株，获得抗草甘膦转基因水稻。
注：GUS基因表达产物经染色能从无色变成蓝色
(1)将草甘膦抗性基因作为 ，与Ti质粒用相同的 和DNA连接酶处理构建基因表达载体。
(2)用 处理农杆菌后获得感受态细胞，将其与基因表达载体混合完成转化后，在添加 的培养基中，经筛选1得到含基因表达载体的农杆菌。
(3)取某品种水稻的幼胚，先进行 处理，然后接种到培养基中，水稻幼胚细胞发生 形成愈伤组织。用含基因表达载体的农杆菌侵染该愈伤组织。
(4)PCR扩增时需要根据草甘膦抗性基因序列设计 种引物，引物是 。
(5)利用PCR技术，可以鉴定被侵染的愈伤组织中是否含有草甘膦抗性基因。草甘膦抗性基因的部分序列如下：
5’---ATGGCT………AGGAAC---3’
3’---TACCGA………TCCTTG---5’
根据上述序列应选择引物 （填字母）进行PCR。
A．引物：5’-TACCGA-3’B．引物：5’-GTTCCT-3’
C．引物：5’-AUGGCU-3’D．引物：5’-ATGGCT-3’
(6)除了鉴定愈伤组织中是否含有目的基因以外，还可以利用GUS基因表达产物的鉴定进行图中的筛选2，以确定目的基因是否 。两次筛选后得到的转基因愈伤组织经过细胞的 过程，获得转基因水稻。
【答案】(1) 目的基因 限制性核酸内切酶
(2) CaCL2溶液 潮霉素
(3) 消毒 脱分化
(4) 2 使DNA聚合酶能够从引物的3，端开始连接脱氧核苷酸
(5)BD
(6) 表达 再分化
【解析】（1）构建的基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点，目的基因与运载体要用限制酶切割获得相同的末端才能进行连接，本实验中，草苷膦抗性基因为目的基因。
（2）细菌最常用的转化方法是：首先用Ca2+处理细胞，使细胞成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。若农杆菌得到含目的基因的表达载体，则也同时含有潮霉素抗性基因，因此可以用加有潮霉素的选择培养基把它筛选出来。
（3）外植体脱离了母体，易受微生物感染，在体外培养的条件下要消毒处理，再接种。外植体在培养基中发生脱分化，进行细胞分裂，形成愈伤组织。
（4）PCR技术要用到两种引物，使DNA聚合酶能够从引物的3，端开始连接脱氧核苷酸。
（5）已知草甘膦抗性基因的部分序列，由于PCR技术中，子链合成的方向是从5，到3，，因此应选择引物BD进行PCR技术。
（6）SUS基因表达产物经染色能从无色变成蓝色，还可以利用GUS基因表达产物的鉴定进行图中的筛选2，以确定目的基因是否表达。两次筛选后得 到的转基因愈伤组织经过细胞的再分化过程，获得转基因水稻。
10．（2023秋·浙江·高三校联考开学考试）研究者改造与肠道共生的大肠杆菌，口服该工程菌后激活机体特异性免疫，实现肿瘤的预防和治疗。部分肠道细菌能够分泌外膜囊泡（OMV），OMV能穿越肠道上皮屏障活化肠黏膜内丰富的免疫细胞（如图1）。细菌溶素A（ClyA）是外膜囊泡上含量较高的特异蛋白。

(1)构建表达载体：研究者利用含图2所示元件的表达载体转化大肠杆菌制备工程菌，ClyA基因的作用是表达ClyA，使 定位至OMV表面；Fc表达产物能够与树突状细胞表面的特异性受体结合，提高树突状细胞 OMV的能力。
(2)工程菌的制备与培养：为了便于将表达载体导入大肠杆菌，可用CaCl2处理，以提高细菌 （结构）的通透性。然后将已改造的工程菌置于LB 培养基中培养，并不断进行搅拌。
(3)检测：可用核酸分子杂交技术，或先对融合基因进行 ，然后再进行凝胶电泳加以鉴定。琼脂糖凝胶的孔隙可起到 的作用，一般来说，DNA分子量越小，配制琼脂糖凝胶的浓度越 。凝胶浸没于电泳缓冲液中，电泳缓冲液的作用是 。DNA本身是无色的，可以用 将DNA染色。如果最终在凝胶上出现多个条带，推测可能的原因有 。（写出两点）
(4)使用：患者应将工程菌与 一同口服，在肠道繁殖并表达后，使人体产生对 的特异性免疫反应。
【答案】(1) OVA和Fc 识别（识别、摄取）
(2) 细胞膜 液体
(3) PCR 分子筛（筛选） 大（高） 维持合适的PH，并使溶液具有一定的导电性 亚甲基蓝（溴化乙锭、荧光） 引物设计不合理，退火温度过低
(4) 阿拉伯糖 黑色素瘤
【解析】（1）ClyA是外膜囊泡上含量较高的特异蛋白，而OMV能穿越肠道上皮屏障活化肠黏膜内丰富的免疫细胞。所以，ClyA基因的作用为表达出细菌溶素A(ClyA)，使OVA和Fc定位至OMV表面，进而融合基因可以被免疫细胞识别。Fc表达产物能够与树突状细胞表面的特异性受体结合，进而提高树突状细胞识别、摄取和传递抗原信息的能力。
（2）基因表达载体导入大肠杆菌细胞最常用转化法：首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，以提高细菌细胞膜的通透性。然后将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。改造后的细菌要大量增殖，要用液体培养基。
（3）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH（用缓冲液来维持）下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，琼脂糖凝胶的孔隙可起到分子筛的作用。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。一般来说，DNA分子量越小，配制琼脂糖凝胶的浓度越高；凝胶中的DNA分子通过亚甲基蓝或溴化乙锭染色，或荧光标记后，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。如果最终在凝胶上出现多个条带，说明PCR过程中，由于引物设计不合理、退火温度过低等原因，产生多种DNA片段。
（4）依图2中信息，基因表达载体的启动子在有阿拉伯糖存在时，才会起作用，因此患都应同时服用工程菌和阿拉伯糖，才能表达出抗原信息，使人体产生对黑色素瘤的特异性免疫反应。