精讲80 基因工程的基本操作程序-【备战一轮】最新高考生物一轮复习名师精讲课件

这是一份精讲80 基因工程的基本操作程序-【备战一轮】最新高考生物一轮复习名师精讲课件，共60页。PPT课件主要包含了高考生物一轮复习策略，教学过程，概念图，课堂练习巩固，典型习题，规律总结，基因工程，基因工程的操作程序，ＤＮＡ连接酶，运载体等内容，欢迎下载使用。

1、落实考点。一轮复习时要在熟读课本、系统掌握基础知识、基本概念和基本原理后，要找出重点和疑点；通过结合复习资料，筛选出难点和考点，有针对地重点复习。这就需要在掌握重点知识的同时，要善于进行知识迁移和运用，提高分析归纳的能力。2、注重理论联系实际。生物的考试并不仅仅是考概念，学会知识的迁移非常重要，并要灵活运用课本上的知识。不过特别强调了从图表、图形提取信息的能力。历年高考试题，图表题都占有比较大的比例。那些图表题虽不是教材中的原图，但它源于教材而又高于教材，是对教材内容和图表的变换、深化、拓展，使之成了考查学生读图能力、综合分析能力、图文转换能力的有效途径。3、一轮复习基础知识的同时，还要重点“攻坚”，突出对重点和难点知识的理解和掌握。这部分知识通常都是学生难于理解的内容，做题时容易出错的地方。分析近几年的高考生物试题，重点其实就是可拉开距离的重要知识点。　4、学而不思则罔，思而不学则殆。这一点对高三生物一轮复习很重要。尤其是对于错题。错题整理不是把错题抄一遍。也不是所有的错题都需要整理。
【新教材•选择性必修三】2023-80【基因工程】
Teaching Prcess
2.课堂教 学内容
1.概念:按照人们的意愿，把一种生物的某种 出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里， （定向/不定向）地改造生物的遗传性状。2.别名: 。3.原理: 。4.操作对象: 。5.操作水平: 。6.操作环境: 生物 （体内/体外）进行7.结果： 。 8.优点： （1） 。 （2） 等。
基因拼接技术或DNA重组技术
创造出符合人们需要的生物类型和生物产品
定向改造生物性状（目的性强）
克服远缘杂交不亲和的障碍
【探究】人的胰岛素基因能通过拼接并在受体细胞大肠杆菌中表达出相同蛋白质--胰岛素的理论基础：（1）大肠杆菌和人的遗传物质都是 。（2）不同生物的DNA分子能够拼接在一起，原因是 。 （3）同一种基因在不同生物体内表达出来的蛋白质相同，因为 。（4）遗传信息的传递都遵循 。 (5) 为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？ 。
基因的组成、空间结构和碱基互补配对方式相同
所有生物共用一整套遗传密码
① 基因是控制生物性状的独立遗传单位② 遗传信息的传递都遵循中心法则③ 生物界共同一套遗传密码
【易错警示】工具酶≠工具
质 粒λ噬菌体的衍生物动植物病毒
二.基因操作基本的工具
1.限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
（1）限制酶切割DNA产生黏性末端的过程和黏性末端的表示方法：【例析】如EcRI酶能识别-GAATTC-序列，并在G与A之间切割，请表示:
一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。
（2）下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点．请回答下列问题：
（1）请写出同时用EcRⅠ切割含目的基因的DNA的过程。（2）请写出同时用BamH和 HindⅢ切割质粒的过程。
（3）用限制酶切割时需注意的事项①获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是 。但是使用该法缺点是容易发生 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。②获取一个目的基因需限制酶切割 次,共产生 个游离的磷酸基团。
为了产生相同的黏性末端，便于连接
分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体
目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接
③选择限制酶切割位点的基本原则： A.切割目的基因时： 。 B.切割质粒时： 。
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
例2.①用图1中的质粒和图2中的外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是 。②构建重组质粒时，最好选择限制酶BamHⅠ、HindⅢ处理质粒、外源DNA，这样做的目的是 。
SmaⅠ会破坏质粒中的抗性基因以及破坏目的基因
确保目的基因与质粒的定向连接
例3.如图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线
用图2中的人乳铁蛋白目的基因和图1所示的质粒构建重组质粒时，选用的限制酶是　 （从“EcRⅠ”、“BamHⅠ/HindⅢ”、“SmaⅠ/HindⅢ”中选择）．不能选择其他限制酶的理由分别是： 。
BamHⅠ/HindⅢ
若选EcRⅠ会破坏质粒的复制原点；若选SmaⅠ/HindⅢ，则构建的重组质粒没有标记基因或复制原点
教材隐性知识：(1)源于选择性必修3 P71“旁栏思考”：①原核生物中存在限制酶的意义是什么？
原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？
限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰（甲基化），使限制酶不能将其切开。
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶。
总结：图解限制酶的选择原则
（1）限制酶与DNA连接酶的关系(如下图)：
（2）DNA连接酶与DNA聚合酶的关系(如下图)：
相同点——作用位点都在磷酸二酯键不同点——
DNA聚合酶：单个核苷酸与DNA片段
DNA连接酶：DNA片段与DNA片段
DNA聚合酶作用需要模板，而DNA连接酶不需要
例4.下列所示的黏性末端是由几种限制性核酸内切酶作用产生的（　　）
A.1种 B.2种 C.3种 D.4种
图中的黏性末端哪些能连接在一起吗？ 、 。
①② ③④
能够在宿主细胞中自我复制并稳定保存
(1)在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的(2)λ噬菌体的衍生物或某些动植物病毒作为运载体利用的原理是 .病毒对宿主细胞的侵染具有一定的 性。
利用病毒对宿主细胞的侵染性
例5.若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。
噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕
(4)【分子运输车--质粒】
①来源：来源于许多 等生物，它是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的 （化学本质），故质粒有 个游离的磷酸基团②氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为 ，还有如： 等；其作用是 。③复制原点： 。
用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞
卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因
(1)质粒与拟核中的DNA有哪些相同点：（至少写出两点） ① 。 ② 。 ③ 。(2)质粒 （是/不是）一种细胞器。(3)细胞膜上的载体蛋白与基因工程中的载体的区别 ①化学本质不同：细胞膜上的载体： 。基因工程中的载体可能是物质，如 ；也可是生物，如 ；也可是λ噬菌体的衍生物。 ②功能不同：细胞膜上的载体功能是 ;基因工程中的载体是一种“分子运输车”,把 。
具有遗传效应或都能够指导蛋白质的合成等
协助细胞膜控制物质进出细胞
例6.在基因工程中，已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据下图示判断下列操作错误的是( )
A.质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割B.用限制酶切割获得目的基因时，有四个磷酸二酯键被水解C.限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后获得的黏性末端相同D.质粒中标记基因便于筛选出目的基因已经表达的细胞E.用酶I和酶II形成相同的黏性末端，且用DNA连接酶连接的重组DNA还能用上面两种酶切割
例7.某线性DNA分子含有3000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是(　　)
A.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个B.a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接C.a酶与b酶切断的化学键不相同D.用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，
教材隐性知识：(2)源于选择性必修3 P72“旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶　　(填“是”或“不是”)一回事。原因是：①DNA连接酶连接的是　　　　　　，而DNA聚合酶是把单个的　　　　　连接到已有的DNA片段上。②　　　　　起作用时需要以一条DNA链为模板，而　　　　　不需要模板。
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
获取目的基因的常用方法：1.从基因文库中获取目的基因2.人工合成目的基因
基因表达载体的组成：启动子+目的基因+终止子+标记基因
植物细胞：农杆菌转化法(常用）、基因枪法、花粉管通道法动物细胞（受精卵）：显微注射法微生物细胞：感受态细胞法
检测方法：1.分子水平：DNA分子杂交法、分子杂交法、抗原－抗体杂交法2.个体水平：抗虫鉴定 抗病鉴定、活性鉴定等
三.基因工程的基本操作程序
与RNA聚合酶结合位点
非编码区（非编码序列）
②调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等
(以真核生物的逆转录过程为例)
以mRNA为模板, 反转录产生的目的基因中没有内含子、启动子和终止子。
（1）目的基因指：主要是 ；也可以是 ；例如与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因等（2）获取目的基因的常用方法：
(1)从基因文库中获取目的基因
将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。
②基因文库的种类: 。
含有一种生物的全部基因
只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库
基因组文库和部分基因文库
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
(2)人工合成法： ①逆转录法：即以 作为模板，在 酶的作用下合成 ，若要运用该方法获得人的胰岛素基因，则只能从人的 细胞中提取到胰岛素的mRNA进行逆转录获取胰岛素基因；原因是 。上述方法获得的胰岛素基因（cDNA）在基因结构的特点是 。
胰岛素基因只会在胰岛B细胞中表达，其他细胞中不表达
基因只包括了编码区中的外显子序列，而没有非编码区和内含子序列
(2)人工合成法： ②化学合成法 基因比较小且目的基因的核苷酸序列已知，可通过 （填仪器）用 直接人工合成A.蛋白质工程运用化学合成法合成目的基因的基本途径是 → → → → → . B.化学法合成的目的基因 （含/不含）内含子、启动子和终止子？ 。C.若是控制同一种蛋白质合成的目的基因，利用化学合成法合成的基因可能有 （一种/多种）；理由是 。
找到对应的脱氧核苷酸序列
参与翻译的mRNA序列是由编码序列转录而来的
遗传密码具有简并性或一种氨基酸可能由多个密码子决定
(2)人工合成法： ③化学合成法 （能/不能）合成自然界不存在的新基因，使生物产生新的性状以满足人类的要求【易错积累】从基因组文库中获得的胰岛素基因（含内含子），若以大肠杆菌作为受体细胞却未得到对应的胰岛素，其原因可能是 。
胰岛素基因含内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出胰岛素
(3)利用PCR技术扩增目的基因
①概念：PCR全称为 ，是一项在生物 （体内/体外）复制特定DNA片段核酸合成技术②原理： 。③前提：要有一段 ，以便根据这一序列合成 。④引物的化学本质：是一小段 ；它是以 为模板，在 酶的作用下合成的⑤两种引物与模板链如何配对？ 。
已知目的基因的核苷酸序列
引物的5′端与模板链3′端互补配对
【思考】合成引物时是否需要知道目的基因的所有的碱基序列？
⑥延伸时需要加入两种引物，原因是 。⑦两种引物的要求： 。⑧PCR反应的基本步骤： 、 、 。
DNA是反向平行的双链，DNA聚合酶只能从引物3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
两种引物之间不能互补配对
引物长度不宜过短，防止引物随机结合
变性 复性 延伸
总结：PCR技术和DNA复制的比较
(1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成　　　　　的原料，又可为DNA的合成提供　　。(2)引物既可以是DNA单链，也可以为　　　　　。细胞内的DNA进行复制时，也需要　　，一般为RNA片段。(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要　　　激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加　　　。
模板DNA加热至900C以上时，模板DNA双链解聚为单链。
温度下降到50℃左右，两种引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。
温度上升到72℃，在Taq酶的作用下，以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则，合成一条新的DNA链
A.模板DNA： ；B.分别与两条模板链相结合的 种引物；C.原料： ；D.酶： ；E.控制温度（由 控制）、PH值（由 调节），但不需解旋酶。
Taq酶（耐高温的DNA聚合酶）
利用PCR技术扩增目的基因
PCR扩增过程中的循环图示与规律
A.上一次循环的产物为下一循环的模板B.有最初母链的两个DNA分子只含一个引物，其它子代DNA分子都为两个引物分子C.处于两引物之间的DNA序列呈指数增长
（1)PCR技术扩增时需要适宜的温度和PH值，温度可以由 自动调控，PH值由 来调节。（2）DNA聚合酶只能特异性地复制处于 之间的DNA序列,使其成指数倍增加（3）若一个DNA分子利用PCR扩增N次后，产生的2N个DNA分子，其中有 个DNA分子只含有一个引物， 个DNA分子中每个DNA分子都含有两种引物（4）通过N次复制产生的子代DNA分子中含有（如引物I或引物II）的DNA分子占DNA分子总数的比为 。（5）第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，占所得DNA分子的比例为 。
比例的通式：1-（N/2N-1）
⑩PCR反应的实验操作
A.按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）B.用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）C.盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）D.将微量离心管放在离心机上（离心）E.将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）
　　教材隐性知识：源于选择性必修3 P77“相关信息”：Bt抗虫蛋白基因产生的Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈　　，肠道细胞也无特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害。
例8.如图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向．
例9.若用PCR技术扩增图示目的基因，应选用的引物是 。
例10.设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
(1）第1组： ；（2）第2组： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效
(1)在PCR技术扩增目的基因时 （需要/不需要）解旋酶，原因是 。(2)利用PCR技术扩增目的基因前，需根据目的基因的核苷酸序列设计 种引物，进行PCR时需加热至90∽95度然后冷却至55∽60度，此操作的目的是 。
例11.如图为PCR技术扩增图解，请回答下列问题
PCR过程中是通过高温使DNA双链解聚为单链的，而不是用解旋酶
①90∽95度高温使DNA解聚为单链，②然后冷却至55∽60度使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
（3）利用PCR技术扩增目的基因时，需要加入两种引物，原因是　　 ，在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是 。DNA聚合酶只能特异地复制处于　　 之间的DNA序列，若这个过程中消耗了引物62个,则进行了 轮的DNA复制。 (4)目的基因能被准确扩增的原因是 。
DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
从子链的5′端向3′端延伸
目的基因独特的双螺旋结构提供了精确的复制模板；碱基互补配对原则保证复制准确的进行 
(2n+1-2)=62
(5)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的__________和_________，前者由________ 自动调控，后者则靠___________来维持。（6）从理论上讲，在PCR技术中，循环4次产生的DNA分子中，第四次循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。（7）假设DNA片段有150个脱氧核苷酸对，若DNA分子中胞嘧啶脱氧核苷酸有70个，则5次循环，需要胸腺嘧啶脱氧核苷酸 个（不考虑引物所对应的片段）（8）假设DNA片段有200个脱氧核苷酸对，经3次扩增后，从理论上计算，除需要引物14个外（注：每个引物中含有20个脱氧核苷酸），还需要游离的脱氧核苷酸 个。
(2n-1)400 - 20×14
(2n+1-2)=14
（9）用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ，其连接部位如下图所示，X为某限制酶识别序列。扩增得到的绝大部分DNA片段是图A-D中的（ ）
（1）构建目的： ； 。（2）构建过程：
2.基因表达载体的构建—基因工程的核心：
如果使用两种限制酶同时切割目的基因和质粒，有何优点? 。若只考虑两两连接，质粒和目的基因至少可以连接 种；即 。
可防止目的基因和质粒自身环化以及目的基因与运载体的反向连接
目的基因-目的基因、质粒-质粒、目的基因-质粒
①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代。
②使目的基因能够表达和发挥作用
（3）基因表达载体的组成及作用：
①目的基因：能控制表达所需要的特殊性状。②启动子作用： 。
③终止子：使 终止的特殊结构的DNA片段。④标记基因：种类： 。作用： 。⑤复制原点： 。
四环素抗性基因，卡那霉素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因等抗生素抗性基因
启动子具有物种和组织特异性。即只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达。如：构建在水稻胚乳细胞内表达的表达载体需要选择的启动子是 。
是RNA聚合酶识别和结合位点，驱动基因转录出mRNA
思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？
A.生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；B.通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；C.目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；D.为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；
不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。理由是：
E.如何筛选出插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落？
在含有氨苄青霉素的培养基上进行培养，产生一些菌落，然后将这些菌落按照原来的位置转移到含有四环素的培养基上进行培养，一段时间后，某些菌落将会出现停止增殖的现象，这些菌落的位置在含氨苄青霉素的培养基中对应的位置的菌落即为插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落。
例12.（2020，高三，衡水）目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示：
(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于______________________________。观察上图，如果A为质粒，则C表示 。
供重组DNA的鉴定和选择
(2)pBR322分子中有单个EcRⅠ限制酶作用位点，EcRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcRⅠ切割后所形成的黏性末端。 。
(3)pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过____________作用恢复________________________键，成功地获得了重组质粒。能形成重组质粒的原因是______________________________________________。
两种限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同
(4) 作为受体大肠杆菌应不含________________，以方便筛选已导入重组质粒的受体大肠杆菌。将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是 _，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是______________。
ampR和tetR（或氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因）
能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素
（5）基因工程中使用的限制酶，其特点是______ _________________，下图四种质粒含有E1和E2两种限制酶的识别，Apr表示抗青霉素的抗性基因，Tcr表示抗四环素的抗性基因。
将两端用E1切开的Tcr基因与用E1切开的质粒X－1混合连接，连接后获得的质粒类型有 。（可多选）A．X－1 B．X－2 C．X－3 D．X－4
分子某种特定核苷酸序列，切割特定部位的磷酸二酯键
(6)若将上图所示X-1、X-2、X-3、X-4四种质粒导入大肠杆菌，然后分别涂布在含有青霉素或四环素的两种培养基上．在这两种培养上均不能生长的大肠杆菌细胞类型有______、______．
（7）图1为某种常用质粒的序列图，LacZ基因编码的酶能使无色的X﹣gal变为蓝色，Ampr为氨苄青霉素抗性基因．图2为目的基因的序列及其相关限制酶的识别序列．请回答下列问题：
实验小组用BamHⅠ和BlgⅡ两种限制酶切割目的基因和质粒，若要筛选成功导入目的基因的重组质粒，培养基中应加入的物质有 和 ．
成功导入重组质粒的大肠杆菌菌落显 ， 若大肠杆菌菌落显蓝色，说明导入 ． 没有导入任何外源DNA的大肠杆菌 （填“能”或“不能）在该培养基上生存．
（8）为制备目的基因Y（图19）与质粒X（图20）的重组DNA，将质粒X与含Y的DNA片段加入含有限制性核酸内切酶BgIⅡ与BamHⅠ的反应混合物中，酶切后的片段再加入含有连接酶的反应体系中。其中，质粒X含有leu2基因，可用于合成亮氨酸，目的基因Y含有卡那霉素抗性基因KanR
要筛选含有重组质粒的Z细胞，应选择 的培养基。
含卡那霉素但不含亮氨酸的培养基
(1)转化：指 。(2)常用的受体细胞： ①原核生物： 。 ②真核生物： 。(3)将目的基因导入受体细胞的原理： 。 (4)常用的方法： 植物细胞： 。 动物细胞： 。 微生物细胞： 。
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径
大肠杆菌 枯草杆菌 土壤农杆菌等
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程
3.将目的基因导入受体细胞：
①农杆菌特点：易感染 植物，对大多数 植物没有感染能力。②原理：Ti质粒上的 可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。【易错积累】a.农杆菌的作用是 。b.用农杆菌感染时，优先选择 （受伤的/完好的）叶片与重组质粒的农杆菌培养，选用该叶片的理由是 。
感染植物细胞，把目的基因插入到植物细胞的染色体的DNA上
叶片伤口处的细胞可释放大量的酚类物质，可吸引农杆菌
c.若要利用农杆菌转化法转化单子叶植物细胞，可采取添加 ，其目的是 。d.利用Ti质粒构建重组质粒的目的是： 。
吸引农杆菌移向受体细胞，有利于目的基因成功转化
将目的基因插入到Ti质粒上的T-DNA上，利用其将目的基因导入受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上，使目的基因的遗传特性稳定维持和表达
①方法: 。②受体细胞： 。
B.将目的基因导入动物细胞
【思维拓展】为什么受体细胞选受精卵而不是正常体细胞？ 。
受精卵具有全能性且体积大,易操作；而动物体细胞的全能性受限
提纯含目的基因表达载体
C.将目的基因导入微生物细胞
①常用法: .②常用菌： 。③微生物作为受体细胞的原因是 。④过程：
表达载体与感受态细胞混合
Ca2+处理法(感受态细胞法)
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
⑤受体细胞用Ca2+处理的目的是 。⑥用Ca2+处理受体细胞是通过改变 的通透性来完成
使其变为感受态细胞，容易吸收周围环境中的DNA分子
(1)DNA分子探针： 。(2)检测和鉴定 ① ，它是目的基因能否在个体内稳定遗传的关键，采用的技术是 。 ② 是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步，该过程采用的技术是 。 ③检测目的基因是否成功翻译出蛋白质 A.分子水平检测： 。
放射性同位素标记的含有目的基因的DNA片段
检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因
检测目的基因是否成功转录出mRNA
4.目的基因的检测与鉴定：
将Bt毒蛋白注射小鼠体内
从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒蛋白的抗体
将基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能活性是否相同。
B.个体生物学水平的鉴定
a.检测生物是否具有该蛋白质赋予的某种特性以及具有该特性的程度。如：
抗虫：做抗虫接种实验，观察 （害虫/生物）的生存状况抗病：做病原体接种实验，观察 （病原体/生物）的生存状况抗盐：将转基因植物移栽到 。抗寒：将转基因植物移栽到 环境中，观察其生长状况
(1)已知真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是 。(2)人体合成的初始胰岛素，需要经过膜系统加工形成特定的空间结构才有生物活性，把胰岛素基因导入大肠杆菌时形成的胰岛素没有生物活性，原因是 。(3)为了避免抗虫基因通过花粉传播给其他植物，应将该目的基因导入 （细胞核/细胞质）中理由是 。
基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A
大肠杆菌是原核生物，没有内质网、高尔基体，无法对形成的胰岛素进行加工
细胞质基因具有母系遗传的特点
(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，①子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为3∶1时，②若子代全部耐旱。尝试推测该耐旱基因分别整合到了什么位置上？（答“同源染色体的一条上”或“同源染色体两条上”_________________ ， 。 (5)若自交子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为15：1时，则可推测该耐旱基因整合到了什么位置上？（答“同源染色体的一条上”或“两对同源染色体上”）。_______________________________。
同源染色体的一条上 同源染色体两条上
(1)基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤:目的基因的获取、_________________、将目的基因导入受体细胞、_________________。(2)A过程需要的酶有______ _______________。
（同一种）限制酶和DNA连接酶
例13.下列是转基因抗虫棉的形成过程，请据图回答问题：
（3）要把重组质粒导入土壤农杆菌，首先必须用____处理土壤农杆菌，使土壤农杆菌转变为_________态；然后将______________________在缓冲液中混合培养完成转化过程。（4）含有重组质粒的土壤农杆菌侵染离体棉花叶片组织后，将离体棉花叶片组织培养成再生植株要经过［C］______和［E］_______。如要确保再生植株中含有抗虫基因，可在C过程的培养基中加入______________。
(5)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T－DNA，把目的基因插入Ti质粒的T－DNA中是利用T－DNA____________的特点。(6)Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内并成功实现表达的过程，在基因工程中称为________。(7)目的基因能否在棉株体内稳定维持和表达其遗传特性的关键是______________________________________________，这需要通过检测才能知道，检测采用的方法是________。
可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上
目的基因是否插入了受体生物细胞的染色体DNA上
(8)不同种生物之间的基因移植成功，其结构基础是 ，也说明了不同种生物共用一套 。
都是双螺旋结构，均由四种脱氧核苷酸组成
例14.下图表示利用基因工程培育抗虫棉的过程，请据图回答下列有关问题。
(1)若限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—↓GATC—，限制酶Ⅱ识别序列和切点是—G↓GATCC—，那么在①过程中，应用限制酶____切割质粒，用限制酶____切割抗虫基因(2)将通过②过程得到的大肠杆菌涂布在含有________的培养基上，若能够生长说明已导入了普通质粒或重组质粒，反之则说明没有导入。
(3)要确定抗虫基因导入后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，则在个体水平上的鉴定过程可简述为 。经筛选分析，该植株细胞中含有一个携带抗虫基因的DNA片段，因此可以把它看作是杂合子。理论上，该转基因植株自交产生的F1代中，仍具有抗虫特性的植株占总数的____。(4)⑤过程所用的现代生物技术运用的原理是 ，从遗传学角度来看，据细胞通过⑤过程，能形成棉植株的根本原因是细胞具有 。
让害虫吞食转基因棉花的叶片，观察害虫的存活情况，以确定其是否具有抗虫性状　　
发育成完整个体的全部遗传物质
例15.(2021·山东，25)人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是______，在R末端添加的序列所对应的限制酶是________。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要____种酶。
解析：据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶MunⅠ识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。
要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有MunⅠ和XhⅠ的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶MunⅠ和XhⅠ所识别，故应该选用添加限制酶EcRⅠ
和限制酶SalⅠ识别序列，由图中可知，限制酶MunⅠ识别并切割后的黏性末端与限制酶EcRⅠ识别并切割后的黏性末端相同，故R末端添加的序列所对应的限制酶是EcRⅠ，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是SalⅠ；
荧光蛋白基因中含有限制酶EcR Ⅰ的识别位点，故对载体使用限制酶MunⅠ和XhⅠ切割。综上所述，对载体使用限制酶MunⅠ和XhⅠ切割，对扩增后的产物用限制酶EcRⅠ和限制酶SalⅠ切割，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；
产物扩增中需要使用TaqDNA聚合酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是TaqDNA聚合酶、限制酶EcRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhⅠ、DNA连接酶。
(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是___________________________________________________。
F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达
解析：受体细胞中已经除去BCL11A基因，故扩增产物中的BCL11A蛋白结合位点不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达。
(3)向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，
据此结果可推测， BCL11A蛋白结合位点位于______________________________________________，理由是_________________________________________________________________________________
F1～ F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控序列的下游(右侧)；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对应调控序列的上游(左侧)，所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上
引物F4与F5在调控序
根据有无荧光情况判断，
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
列上所对应序列之间的区段上
解析：向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生BCL11A蛋白，BCL11A蛋白与BCL11A蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A蛋白的结合位点在引物F4与引物R之间的序列上；含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A蛋白结合位点在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。
填空默写1.(选择性必修3 P67)基因工程：___________________________________________________________________________________________________。2.(选择性必修3 P71)限制酶能够识别双链DNA分子的　　　　　序列，并且使每一条链中特定部位的　　　　　断开。3.(选择性必修3 P72)载体上有特殊的标记基因，便于　　　　　　　　　。4.(选择性必修3 P77)PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供　　　　　、　　　　、4种　　　　　和耐高温的　　　　　。
按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋
予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品