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2025届高考 一轮复习 人教版 基因工程的基本工具和基本操作程序 课件
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这是一份2025届高考 一轮复习 人教版 基因工程的基本工具和基本操作程序 课件，共60页。PPT课件主要包含了关键·真题必刷等内容，欢迎下载使用。
(1)阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。(2)阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。(3)DNA的粗提取与鉴定实验。(4)利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
重组DNA技术的基本工具
基因工程的基本操作程序
DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
考点一 重组DNA技术的基本工具
生物类型
2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
①将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
(1)请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过程。提示 限制性内切核酸酶Ⅰ：
(2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。提示 用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割质粒。限制酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的识别序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择Sma Ⅰ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma Ⅰ。(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcR Ⅰ两种限制酶。
2.标记基因的作用标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞：
考向 结合基因工程的基本工具，考查科学探究1.(2023·新课标卷，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.cli DNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.cliDNA连接酶连接
解析 酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。
2.(2024·广东珠海调研)大肠杆菌pUC118质粒是基因工程中常用的一种载体，具有氨苄青霉素抗性基因，该质粒中某限制酶的唯一切点位于lacZ基因中。在特定的选择培养基中，若lacZ基因没有被破坏，则大肠杆菌菌落呈蓝色；若lacZ基因被破坏，则菌落呈白色。关于图中操作的叙述正确的是( )
A.试管1中应加入限制酶和DNA连接酶B.试管2中将重组质粒导入大肠杆菌，需用Ca2＋处理大肠杆菌C.能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落均呈现白色D.试管3应选择蓝色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养
解析 分析题图可知，在加入试管1之前，质粒和目的基因已经被切割，故试管1中应加入DNA连接酶，A错误；试管2中用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于感受态，B正确；能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落呈现蓝色或白色，C错误；若大肠杆菌的菌落为蓝色，则导入大肠杆菌的是普通质粒，试管3应选择白色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养，D错误。
3.(2021·全国乙卷，38)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：(1)常用的DNA连接酶有E.cliDNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中_________________酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA连接酶连接。上图中___________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
EcR Ⅰ、Pst Ⅰ
EcR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcR Ⅴ
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能 ；质粒DNA分子上有 ，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是______________________________________________________________________________________________________________________________。
用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
(4)表达载体含有启动子，启动子是指______________________________________________________________________________________________________。
RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列
解析 (1)由题图可以看出，EcR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcR Ⅴ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E.cli DNA连接酶可用于连接黏性末端，T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。(2)DNA连接酶催化DNA链的5′端与另一DNA链的3′端生成磷酸二酯键。(3)复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中进行自我复制。质粒上有限制酶切割位点，该位点可被限制酶切开并使外源目的基因插入其中。若质粒DNA分子上有某种抗生素抗性基因，则可以用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(4)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
考点二 基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(2)利用PCR获取和扩增目的基因
耐高温的DNA聚合酶
①在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。②引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。③复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。④真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。
2.基因表达载体的构建——核心
受体细胞中是否含有目的基因
提醒 启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别
3.将目的基因导入受体细胞只有该步骤没涉及碱基互补配对原则
(1)农杆菌特点①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 ②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。(2)农杆菌转化法中的两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的TDNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。(3)导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
4.目的基因的检测与鉴定
1.设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。
①第1组：__________________________________________________________；②第2组：_________________________________________________________。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
2.若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要消耗多少个引物数？提示 经过n轮循环需要消耗引物数为(2n＋1－2)个，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。
考向 围绕基因工程的操作程序，考查科学探究1.(2023·湖北卷，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
解析 若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
2.(2023·全国乙卷，38改编)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题：
(1)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如图所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为 ；②为 ，其作用是____________________________________________________________________；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是____________________________________________________________________。
提供RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动GFP突变基因转录出mRNA
将含有表达载体的细胞筛选出来
(2)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________(答出1点即可)。
GFP基因虽然发生了突变，但由于存在密码的简并现象(密码子的简并)，突变基因所编码的氨基酸序列并未改变
(3)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是_________________________________________________________________________________________________________。
将YFP基因插入表达载体，再将构建成功的重组表达载体导入不能发黄色荧光的真核细胞中，观察黄色荧光是否出现
解析 (1)从图中可以知道，转录方向是顺时针，所以①为终止子，②为启动子，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录。而标记基因是为了鉴别受体细胞中是否含有表达载体，从而将含有表达载体的细胞筛选出来。(2)基因突变，但是性状不改变的情况，有多种可能，如因为非编码区改变，但是编码区不变导致mRNA不变，或者由于密码子的简并导致的氨基酸序列不变等等。(3)用基因工程将目的基因导入真核细胞，检测是否发黄色荧光即可。如以酵母菌为受体菌，以YFP为目的基因，通过基因工程技术，观察导入基因表达载体后的受体酵母菌是否可以发黄色荧光。
3.(2023·全国甲卷，38改编)接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题：(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是_________________________________________________________________。
疫苗中不含乙肝病毒DNA
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。
用于筛选含有重组表达载体的细胞
(3)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。______________________________________________________________________________________________________________________________________。
从酵母细胞中提取蛋白质，再用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测是否出现杂交带
解析 (1)重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。蛋白质注入人体后，无法完成病毒遗传物质的复制与蛋白质的合成，无法独立增殖。(2)抗生素抗性基因作为标记基因，用于重组表达载体的筛选。RNA聚合酶识别目的基因启动子并驱动转录。(3)检测目的蛋白在宿主细胞中是否表达。要从细胞表达的众多蛋白中检测目的蛋白，通常采用抗原—抗体杂交的实验方法。因此，要检测目的蛋白在酵母细胞中是否表达，首先需要提取酵母细胞的总蛋白，然后用特异性抗体进行杂交，若出现杂交带，则说明酵母细胞表达了目的蛋白。
如何筛选出含有目的基因的受体细胞(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如下图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。(2)被转化的细菌有三种：含自身环化目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。
(3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含重组质粒的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
考点三 DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定
①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和其他细胞器(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)实验基础
(2)PCR实验操作步骤
(3)电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为______________的紫外灯下被检测出来。①成功扩增出DNA片段的判断依据是____________________________________。②进行电泳鉴定的结果应该是____条条带。如图所示，该片段大小约为________ bp。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。②在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。③电泳时，DNA的相对分子量越大，迁移速率越慢；DNA的相对分子量越小，迁移速率越快。
(1)DNA鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色。(2023·广东卷，11D)( )提示 需沸水浴加热。(2)粗提取DNA时的过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。(2022·山东卷，13A)( )(3)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行。(2022·湖北卷，5)( )提示 动、植物细胞的DNA提取不需要在无菌条件下进行。
(4)PCR技术中的DNA延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制。(2022·辽宁卷，12C)( )提示 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA链，只能催化单个的脱氧核苷酸添加到已有的核酸片段的3′端，故延伸过程需要引物参与。(5)用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近。(2019·江苏卷，10A)( )提示 哺乳动物(如兔)成熟的红细胞中无细胞核和众多细胞器，不能提取到DNA，而鸡属于鸟类，其红细胞内有细胞核和众多细胞器。
考向1 结合DNA的粗提取与鉴定，考查科学探究能力1.(2023·广东卷，11)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是( )A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
解析 裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 ml/L的NaCl溶液，将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确；将DNA溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。
2.(2024·广东深圳调研)下列对DNA相关实验的叙述，错误的是( )A.可利用DNA不溶于酒精的特点来提取DNAB.可利用洋葱研磨液离心后的沉淀物来提取DNAC.PCR中通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合D.琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物时，需将核酸染料加入琼脂糖溶液中解析 洋葱研磨液离心后的上清液中含DNA，B错误。
考向2 结合DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查科学探究3.(2024·广东肇庆调研)在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，错误的是( )
A.该载体最可能为环形DNA分子B.两种限制酶在载体上各有一个酶切位点C.限制酶R1与R2的切割位点最短相距200 bpD.限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂
解析 单用限制酶R1或R2切割均只得到一段序列(两种限制酶切割产生的DNA片段等长)，可知载体可能是环状DNA分子，当用两种限制酶R1和R2同时切割载体时，产生两种长度的DNA片段，则这两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，两种限制酶同时切割可得到200 bp和600 bp的DNA分子片段，可知限制酶R1和R2的酶切位点最短相距200 bp，A、B、C正确；限制酶是切割DNA的工具，能够特异性识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，D错误。
4.(2024·山东烟台模拟)PCR是以模拟体内DNA复制的方式在体外选择性地将DNA某个特殊区域进行扩增的技术。DNA扩增过程的产物有长产物片段和短产物片段两种，其形成过程如图1所示。请回答下列问题：
(1)DNA复制时子链延伸的方向是 (填“5′→3′”或“3′→5′”)。由于DNA聚合酶不能直接催化两个单核苷酸之间的反应，因此DNA复制需要一段单链DNA或RNA作为 。(2)如果扩增序列为图2所示的两段序列之间的DNA片段，请从表中列出的引物中选出一对合适的引物 。5′—GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG—3′3′—CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC—5′图2
(3)下面为某同学利用PCR仪进行PCR的操作步骤，请完善相关步骤内容。a.按配方准备好各组分。b.用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分：模板DNA、4种脱氧核糖核苷三磷酸、 、引物、缓冲液等。c. 使反应液聚集在微量离心管底部。d.将微量离心管放入PCR仪，设定好PCR仪的循环程序。e.进行PCR。(4)PCR的产物片段中，只有 才是符合要求的目标产物。
解析 (1)DNA复制时子链延伸的方向是5′→3′。由于DNA聚合酶不能直接催化两个单核苷酸之间的反应，因此DNA复制需要一段单链DNA或RNA作为引物，当引物与模板链结合后，单个的脱氧核苷酸才能结合上来。(2)引物与DNA的模板链的3′端能够配对，如果扩增序列为图2所示的两段序列之间的DNA片段，则根据碱基互补配对原则，最合适的引物为甲和D。(3)PCR是在体外进行DNA复制的技术。该过程需要模板、原料、引物、耐高温的DNA聚合酶等。离心使反应液聚集在微量离心管底部。(4)DNA是双链，PCR的产物片段中，只有双链短产物片段才是符合要求的目标产物。
1.(2023·重庆卷，12)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基，短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(如下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是( )
A.实验所用引物，其中一个序列为5′－TGCGCAGT－3′B.步骤①所用酶是SpeⅠ和CfⅠC.用步骤①的酶对载体进行酶切至少获得了2个片段D.酶切片段和载体连接时可使用E.cli连接酶或T4连接酶
解析 根据扩增所得DNA片段可知，实验所用的两种引物序列为5′－TGCGCAGT－3′和5′－AGCTAGCA－3′，A正确；根据酶切后得到的黏性末端判断，步骤①所用酶是NheⅠ和CfⅠ，B错误；步骤①用两种酶切割载体(质粒)，质粒上至少有两个切口，至少产生2个片段，C正确；目的基因片段和质粒经酶切后产生的均为黏性末端，可用E.cli连接酶或T4连接酶连接，D正确。
2.(2023·湖北卷，22)某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
回答下列问题：(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫脾细胞(含能产生特定抗体的B淋巴细胞) (填“需要”或“不需要”)通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是_____________________________________________________________。
使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基(如HAT培养基)，该培养基对 和 生长具有抑制作用。(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是___________________________________________________________________。
融合的具有同种核的细胞
通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞
(4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是 。
解析 (1)一种B淋巴细胞只能分泌一种抗体，为了获得更多分泌特定抗体的B淋巴细胞，需要通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物质PEG可使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原－抗体杂交技术，抗体检测呈阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。(4)DNA连接酶能连接DNA片段，脱氧核苷酸的磷酸基团位于5′端，－OH位于3′端，①②③脱氧核苷酸链的两端基团有误；DNA连接酶能催化合成磷酸二酯键，即将一条脱氧核苷酸链的5′端的磷酸基团与另一条脱氧核苷酸链的3′端的－OH相连，④符合题意。
3.(2023·江苏卷，22)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。(2)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用 。EGFP基因序列：5′ATGGTGAGCAAGGGC—GACGAGCTGTACAAG3′AnB1基因序列：5′CATGTCCAGCTGCAG—CCAAAACCACAACCA3′图2A.ATGGTG——CAACCA B.TGGTTG——CACCATC.GACGAG——CTGCAG D.CTGCAG——CTCGTC
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有 。A.稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
限制性内切核酸酶(限制酶)
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是___________________________________________________________________________________________________________________________________。
琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列
解析 (1)PCR反应进行的条件：引物、酶、4种脱氧核苷酸、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。(2)由图1可知，引物F2-F的部分序列能与F1片段(EGFP)进行碱基互补配对，引物F1-R的部分序列能与F2片段(AnB1)进行碱基互补配对，B选项中5′－CACCAT－3′能与EGFP中的5′－ATGGTG－3′进行碱基互补配对，因此引物F2-F选用B。C选项中5′－CTGCAG－3′能与AnB1中的5′－CTGCAG－3′进行碱基互补配对，因此引物F1-R选用C。
(3)传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在DNA连接酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)。(4)用稀释涂布平板法培养计数时，为了使结果更准确，应选择有30～300个菌落数的平板，A正确；培养基温度太高将接种的菌落杀死，会导致抗性平板上未长出菌落，B正确；转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。故选C。
(5)EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总大小为720 bp＋390 bp＝1 110 bp，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
(1)阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。(2)阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。(3)DNA的粗提取与鉴定实验。(4)利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
重组DNA技术的基本工具
基因工程的基本操作程序
DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
考点一 重组DNA技术的基本工具
生物类型
2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)
①将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
(1)请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过程。提示 限制性内切核酸酶Ⅰ：
(2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶？请说明理由。提示 用限制酶Ⅱ切割目的基因，用限制酶Ⅰ切割质粒。限制酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的识别序列，因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点，故使用限制酶Ⅱ时，可在目的基因两端同时作切割，从而切出“目的基因”，但若使用限制酶Ⅱ切割质粒，会同时破坏质粒中的两个“标记基因”，故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择Sma Ⅰ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择Sma Ⅰ。(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcR Ⅰ两种限制酶。
2.标记基因的作用标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞：
考向 结合基因工程的基本工具，考查科学探究1.(2023·新课标卷，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.cli DNA连接酶连接B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.cliDNA连接酶连接
解析 酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。
2.(2024·广东珠海调研)大肠杆菌pUC118质粒是基因工程中常用的一种载体，具有氨苄青霉素抗性基因，该质粒中某限制酶的唯一切点位于lacZ基因中。在特定的选择培养基中，若lacZ基因没有被破坏，则大肠杆菌菌落呈蓝色；若lacZ基因被破坏，则菌落呈白色。关于图中操作的叙述正确的是( )
A.试管1中应加入限制酶和DNA连接酶B.试管2中将重组质粒导入大肠杆菌，需用Ca2＋处理大肠杆菌C.能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落均呈现白色D.试管3应选择蓝色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养
解析 分析题图可知，在加入试管1之前，质粒和目的基因已经被切割，故试管1中应加入DNA连接酶，A错误；试管2中用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于感受态，B正确；能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落呈现蓝色或白色，C错误；若大肠杆菌的菌落为蓝色，则导入大肠杆菌的是普通质粒，试管3应选择白色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养，D错误。
3.(2021·全国乙卷，38)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：(1)常用的DNA连接酶有E.cliDNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中_________________酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA连接酶连接。上图中___________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
EcR Ⅰ、Pst Ⅰ
EcR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcR Ⅴ
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。(3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能 ；质粒DNA分子上有 ，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是______________________________________________________________________________________________________________________________。
用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞
(4)表达载体含有启动子，启动子是指______________________________________________________________________________________________________。
RNA聚合酶识别、结合和驱动转录的一段DNA序列
解析 (1)由题图可以看出，EcR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcR Ⅴ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E.cli DNA连接酶可用于连接黏性末端，T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。(2)DNA连接酶催化DNA链的5′端与另一DNA链的3′端生成磷酸二酯键。(3)复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中进行自我复制。质粒上有限制酶切割位点，该位点可被限制酶切开并使外源目的基因插入其中。若质粒DNA分子上有某种抗生素抗性基因，则可以用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。(4)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
考点二 基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(2)利用PCR获取和扩增目的基因
耐高温的DNA聚合酶
①在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。②引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。③复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。④真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。
2.基因表达载体的构建——核心
受体细胞中是否含有目的基因
提醒 启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别
3.将目的基因导入受体细胞只有该步骤没涉及碱基互补配对原则
(1)农杆菌特点①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。 ②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。(2)农杆菌转化法中的两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的TDNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。(3)导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中，造成“基因污染”。
4.目的基因的检测与鉴定
1.设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。
①第1组：__________________________________________________________；②第2组：_________________________________________________________。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
2.若一个DNA分子在PCR中经过n轮循环，理论上需要消耗多少个引物？第n轮循环需要消耗多少个引物数？提示 经过n轮循环需要消耗引物数为(2n＋1－2)个，第n轮循环需要消耗的引物数为2n个。
考向 围绕基因工程的操作程序，考查科学探究1.(2023·湖北卷，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
解析 若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
2.(2023·全国乙卷，38改编)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题：
(1)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如图所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为 ；②为 ，其作用是____________________________________________________________________；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是____________________________________________________________________。
提供RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动GFP突变基因转录出mRNA
将含有表达载体的细胞筛选出来
(2)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________(答出1点即可)。
GFP基因虽然发生了突变，但由于存在密码的简并现象(密码子的简并)，突变基因所编码的氨基酸序列并未改变
(3)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是_________________________________________________________________________________________________________。
将YFP基因插入表达载体，再将构建成功的重组表达载体导入不能发黄色荧光的真核细胞中，观察黄色荧光是否出现
解析 (1)从图中可以知道，转录方向是顺时针，所以①为终止子，②为启动子，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因的转录。而标记基因是为了鉴别受体细胞中是否含有表达载体，从而将含有表达载体的细胞筛选出来。(2)基因突变，但是性状不改变的情况，有多种可能，如因为非编码区改变，但是编码区不变导致mRNA不变，或者由于密码子的简并导致的氨基酸序列不变等等。(3)用基因工程将目的基因导入真核细胞，检测是否发黄色荧光即可。如以酵母菌为受体菌，以YFP为目的基因，通过基因工程技术，观察导入基因表达载体后的受体酵母菌是否可以发黄色荧光。
3.(2023·全国甲卷，38改编)接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题：(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是_________________________________________________________________。
疫苗中不含乙肝病毒DNA
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因(目的基因)导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。
用于筛选含有重组表达载体的细胞
(3)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。______________________________________________________________________________________________________________________________________。
从酵母细胞中提取蛋白质，再用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测是否出现杂交带
解析 (1)重组乙肝疫苗的主要成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。蛋白质注入人体后，无法完成病毒遗传物质的复制与蛋白质的合成，无法独立增殖。(2)抗生素抗性基因作为标记基因，用于重组表达载体的筛选。RNA聚合酶识别目的基因启动子并驱动转录。(3)检测目的蛋白在宿主细胞中是否表达。要从细胞表达的众多蛋白中检测目的蛋白，通常采用抗原—抗体杂交的实验方法。因此，要检测目的蛋白在酵母细胞中是否表达，首先需要提取酵母细胞的总蛋白，然后用特异性抗体进行杂交，若出现杂交带，则说明酵母细胞表达了目的蛋白。
如何筛选出含有目的基因的受体细胞(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如下图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。(2)被转化的细菌有三种：含自身环化目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。
(3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含重组质粒的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
考点三 DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定
①加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成丝状沉淀。②本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和其他细胞器(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)实验基础
(2)PCR实验操作步骤
(3)电泳鉴定：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为______________的紫外灯下被检测出来。①成功扩增出DNA片段的判断依据是____________________________________。②进行电泳鉴定的结果应该是____条条带。如图所示，该片段大小约为________ bp。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。②在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换，避免试剂的污染。③电泳时，DNA的相对分子量越大，迁移速率越慢；DNA的相对分子量越小，迁移速率越快。
(1)DNA鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色。(2023·广东卷，11D)( )提示 需沸水浴加热。(2)粗提取DNA时的过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解。(2022·山东卷，13A)( )(3)动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行。(2022·湖北卷，5)( )提示 动、植物细胞的DNA提取不需要在无菌条件下进行。
(4)PCR技术中的DNA延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制。(2022·辽宁卷，12C)( )提示 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA链，只能催化单个的脱氧核苷酸添加到已有的核酸片段的3′端，故延伸过程需要引物参与。(5)用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近。(2019·江苏卷，10A)( )提示 哺乳动物(如兔)成熟的红细胞中无细胞核和众多细胞器，不能提取到DNA，而鸡属于鸟类，其红细胞内有细胞核和众多细胞器。
考向1 结合DNA的粗提取与鉴定，考查科学探究能力1.(2023·广东卷，11)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是( )A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
解析 裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破，释放出DNA等物质，A正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2 ml/L的NaCl溶液，将溶液过滤，即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离，B正确；DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以反复多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA纯度，C正确；将DNA溶解于NaCl，加入二苯胺试剂，沸水浴五分钟，待冷却后，能呈现蓝色，D错误。
2.(2024·广东深圳调研)下列对DNA相关实验的叙述，错误的是( )A.可利用DNA不溶于酒精的特点来提取DNAB.可利用洋葱研磨液离心后的沉淀物来提取DNAC.PCR中通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合D.琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物时，需将核酸染料加入琼脂糖溶液中解析 洋葱研磨液离心后的上清液中含DNA，B错误。
考向2 结合DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查科学探究3.(2024·广东肇庆调研)在基因工程操作中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图所示。以下相关叙述中，错误的是( )
A.该载体最可能为环形DNA分子B.两种限制酶在载体上各有一个酶切位点C.限制酶R1与R2的切割位点最短相距200 bpD.限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂
解析 单用限制酶R1或R2切割均只得到一段序列(两种限制酶切割产生的DNA片段等长)，可知载体可能是环状DNA分子，当用两种限制酶R1和R2同时切割载体时，产生两种长度的DNA片段，则这两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，两种限制酶同时切割可得到200 bp和600 bp的DNA分子片段，可知限制酶R1和R2的酶切位点最短相距200 bp，A、B、C正确；限制酶是切割DNA的工具，能够特异性识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，D错误。
4.(2024·山东烟台模拟)PCR是以模拟体内DNA复制的方式在体外选择性地将DNA某个特殊区域进行扩增的技术。DNA扩增过程的产物有长产物片段和短产物片段两种，其形成过程如图1所示。请回答下列问题：
(1)DNA复制时子链延伸的方向是 (填“5′→3′”或“3′→5′”)。由于DNA聚合酶不能直接催化两个单核苷酸之间的反应，因此DNA复制需要一段单链DNA或RNA作为 。(2)如果扩增序列为图2所示的两段序列之间的DNA片段，请从表中列出的引物中选出一对合适的引物 。5′—GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG—3′3′—CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC—5′图2
(3)下面为某同学利用PCR仪进行PCR的操作步骤，请完善相关步骤内容。a.按配方准备好各组分。b.用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分：模板DNA、4种脱氧核糖核苷三磷酸、 、引物、缓冲液等。c. 使反应液聚集在微量离心管底部。d.将微量离心管放入PCR仪，设定好PCR仪的循环程序。e.进行PCR。(4)PCR的产物片段中，只有 才是符合要求的目标产物。
解析 (1)DNA复制时子链延伸的方向是5′→3′。由于DNA聚合酶不能直接催化两个单核苷酸之间的反应，因此DNA复制需要一段单链DNA或RNA作为引物，当引物与模板链结合后，单个的脱氧核苷酸才能结合上来。(2)引物与DNA的模板链的3′端能够配对，如果扩增序列为图2所示的两段序列之间的DNA片段，则根据碱基互补配对原则，最合适的引物为甲和D。(3)PCR是在体外进行DNA复制的技术。该过程需要模板、原料、引物、耐高温的DNA聚合酶等。离心使反应液聚集在微量离心管底部。(4)DNA是双链，PCR的产物片段中，只有双链短产物片段才是符合要求的目标产物。
1.(2023·重庆卷，12)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基，短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(如下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是( )
A.实验所用引物，其中一个序列为5′－TGCGCAGT－3′B.步骤①所用酶是SpeⅠ和CfⅠC.用步骤①的酶对载体进行酶切至少获得了2个片段D.酶切片段和载体连接时可使用E.cli连接酶或T4连接酶
解析 根据扩增所得DNA片段可知，实验所用的两种引物序列为5′－TGCGCAGT－3′和5′－AGCTAGCA－3′，A正确；根据酶切后得到的黏性末端判断，步骤①所用酶是NheⅠ和CfⅠ，B错误；步骤①用两种酶切割载体(质粒)，质粒上至少有两个切口，至少产生2个片段，C正确；目的基因片段和质粒经酶切后产生的均为黏性末端，可用E.cli连接酶或T4连接酶连接，D正确。
2.(2023·湖北卷，22)某病毒对动物养殖业危害十分严重。我国学者拟以该病毒外壳蛋白A为抗原来制备单克隆抗体，以期快速检测该病毒，其主要技术路线如图所示。
回答下列问题：(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫脾细胞(含能产生特定抗体的B淋巴细胞) (填“需要”或“不需要”)通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是_____________________________________________________________。
使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基(如HAT培养基)，该培养基对 和 生长具有抑制作用。(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是___________________________________________________________________。
融合的具有同种核的细胞
通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞
(4)构建重组质粒需要使用DNA连接酶。下列属于DNA连接酶底物的是 。
解析 (1)一种B淋巴细胞只能分泌一种抗体，为了获得更多分泌特定抗体的B淋巴细胞，需要通过原代培养扩大细胞数量。脂溶性物质PEG可使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。(2)在杂交瘤细胞筛选过程中，用特定的选择培养基进行筛选，在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。(3)单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，是运用了抗原－抗体杂交技术，抗体检测呈阳性的细胞，即为所需的杂交瘤细胞。(4)DNA连接酶能连接DNA片段，脱氧核苷酸的磷酸基团位于5′端，－OH位于3′端，①②③脱氧核苷酸链的两端基团有误；DNA连接酶能催化合成磷酸二酯键，即将一条脱氧核苷酸链的5′端的磷酸基团与另一条脱氧核苷酸链的3′端的－OH相连，④符合题意。
3.(2023·江苏卷，22)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。(2)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用 。EGFP基因序列：5′ATGGTGAGCAAGGGC—GACGAGCTGTACAAG3′AnB1基因序列：5′CATGTCCAGCTGCAG—CCAAAACCACAACCA3′图2A.ATGGTG——CAACCA B.TGGTTG——CACCATC.GACGAG——CTGCAG D.CTGCAG——CTCGTC
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有 。A.稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
限制性内切核酸酶(限制酶)
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是___________________________________________________________________________________________________________________________________。
琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列
解析 (1)PCR反应进行的条件：引物、酶、4种脱氧核苷酸、模板和缓冲液(其中需要Mg2＋)。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。(2)由图1可知，引物F2-F的部分序列能与F1片段(EGFP)进行碱基互补配对，引物F1-R的部分序列能与F2片段(AnB1)进行碱基互补配对，B选项中5′－CACCAT－3′能与EGFP中的5′－ATGGTG－3′进行碱基互补配对，因此引物F2-F选用B。C选项中5′－CTGCAG－3′能与AnB1中的5′－CTGCAG－3′进行碱基互补配对，因此引物F1-R选用C。
(3)传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在DNA连接酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性内切核酸酶(限制酶)。(4)用稀释涂布平板法培养计数时，为了使结果更准确，应选择有30～300个菌落数的平板，A正确；培养基温度太高将接种的菌落杀死，会导致抗性平板上未长出菌落，B正确；转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。故选C。
(5)EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总大小为720 bp＋390 bp＝1 110 bp，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
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