2024届高三生物二轮复习专项练习课件：PCR中引物专题

这是一份2024届高三生物二轮复习专项练习课件：PCR中引物专题，共27页。PPT课件主要包含了目的基因的反向连接，短单链核酸，引物A，引物B，第1次，第2次，第3次，“最长原则”，目的基因，基因表达载体的构建等内容，欢迎下载使用。
突破一、引物存在的必要性
1.DNA复制为什么需要引物？
课前反馈：（1）PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式________（能、不能）正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为_______。
（2）若用PCR技术扩增HMA3基因，需要在PCR扩增仪中加入_________种引物，其作用是_______________________。利用PCR技术扩增基因HMA3时，设计引物序列的主要依据是___________。
（1）不能 DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸结合到已有的引物链（核酸单链）上 （2）2 使耐高温的DNA聚合酶从引物的3´端开始连接脱氧核苷酸 HMA3基因两端的部分核苷酸序列。
优化P142 1.(2023·浙江卷)某研究小组利用转基因技术,将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端,如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只,交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型,设计了引物1和引物2用于PCR扩增,PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是(　　)A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达B.翻译时先合成Gata3蛋白,再合成GFP蛋白C.2号条带的小鼠是野生型,4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子D.若用引物1和引物3进行PCR,能更好地区分杂合子和纯合子
例1、为研究水稻D基因的功能，研究者将T-DNA插入到D基因中，致使该基因失活，失活后的基因记为d。（1）运用农杆菌转化法时，为鉴定筛选出的(农杆菌）菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是________________________。
小结：利用PCR鉴定目的基因是否插入到质粒上时，一个引物与质粒DNA互补结合，另一个引物与目的基因DNA互补结合，这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物。
实验思路：随机选取F2植株若干，提取各植株的总DNA。分别用引物“Ⅰ+Ⅲ”组合及 “Ⅱ+Ⅲ”组合进行PCR，检测是否扩增。预期结果：若两种引物组合均可完成扩增，则相应植株的基因型为Dd； 若只有“Ⅰ+Ⅲ”组引物可完成扩增，则相应植株的基因型为dd; 若只有“Ⅱ+Ⅲ”组引物可完成扩增，则相应植株的基因型为DD;
（2）（改编题）现以野生植株和突变植株作为亲本进行杂交实验，为探究F2植株基因型。研究者根据D基因，T-DNA的序列，设计了3种引物，如图所示。请利用PCR技术设计实验，写出实验思路和预期试验结果。（提示：完整的T-DNA过大，不能完成PCR）
思维拓展1：1.若构建基因表达载体时，基因反接，可抑制相关基因的表达，简述其原理。2.选择下图中的引物__________组合可扩增出两侧的未知序列。
转录出的mRNA与原mRNA碱基互补配对，抑制基因的翻译过程
优化P130 10.设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图),请分别说明理由。
提示 引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效,引物Ⅰ'自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
突破二、引物的设计与应用
引物设计一般要遵循以下原则：（1）典型的引物长度为18-30个碱基。短的引物（15个核苷酸以下）能非常高效地结合---但是它们的专一性 。非常长的引物能提高专一性，但是复性效率 ，从而导致PCR产物量 。（2）引物设计应避免两个引物互补结合。（3）引物本身不能折叠配对
优化P144 (2022·山东卷)(1)为构建重组载体,需先设计引物,通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是______________________________________　　　　　　　　。为使PCR产物能被限制酶切割,需在引物上添加相应的限制酶识别序列,该限制酶识别序列应添加在引物的　　　　(填“3'端”或“5'端”)。 
能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、
原则（4）引物的延伸是从 端开始的，不能进行任何修饰。
若想在DNA两侧添加限制酶识别序列，可利用PCR技术对DNA进行扩增时，在 引物A、B的 端分别添加限制酶识别序列。
1．（2023·浙江·二模）下列有关生物技术与工程中所用技术操作与原理的叙述，错误的是（ ）A．动物细胞培养——应用酶的专一性原理可对所需材料用胰蛋白酶进行处理B．制备单克隆抗体——应用细胞膜流动性原理对脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合C．PCR技术的退火（复性）——应用碱基互补配对原理使引物结合在DNA模板链的5'端D．细胞核移植——细胞质可调控细胞核基因表达，选用卵细胞质使重组细胞表现出全能性
专题突破练P218 4.(2)①为保证双功能醇醛脱氢酶基因(Adh)能通过双酶切以正确方向插入质粒,需设计引物1和引物2,其中引物1的序列为5'-　　　　　 　　　　　　　-3'。 
GGTACCGTACCTTTGT
考前增分练P237 1.(1)研究者进行PCR扩增前根据epEGF基因设计了一对引物,据图1分析,该对引物序列的设计要求是_________________________________________________________________________________________________________________和____________________________________________________________________。  
引物之间以及引物自身不能发生碱基互补配对,
为了防止出现非特异性扩增片段,其长度不能过短,通常为20~30个核苷酸序列
在两个引物的5'端分别添加上限制酶BamHⅠ和XhⅠ的识别序列
考前增分练P238 2.(2)培育“超级菌”。对菌株WZ改造后的CD3D基因进行研究,把CD3D基因和His标签基因(His标签由6个组氨酸组成)连接起来构建融合基因,并构建重组基因表达载体,下图为载体、CD3D基因的结构、不同限制酶的识别序列及切割位点,欲将标签基因连接在CD3D基因编码区的末端,已知组氨酸的密码子为CAU,终止密码子为UAG。①写出His的基因编码链的碱基序列5‘-　　　　　　　 　　　 　　-3'。②为构建融合基因并将其插入载体,科研人员设计了一对与CD3D基因编码区两端序列互补配对的引物,设计时需在引物　　　　(填“A”或“B”)的5'端增加相应的限制酶识别序列和His基因的编码序列,请写出该引物开头的12个碱基序列:5'-　　　　　　　　-3'。
CATCATCATCATCATCATTAG
CTCGAGCTAATG
考前增分练P238 3.(1)为使甘蓝具有抗除草剂能力,科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入甘蓝植株,获得抗草甘膦转基因甘蓝。(1)草甘膦抗性基因一条链的两端序列如下,采用PCR技术获取和扩增草甘膦抗性基因,应选用的引物组合为(　　)A.5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TCTGTTGAAT-3'B.5'-CTTGGATGAT-3'和5'-TAAGTTGTCT-3'C.5'-ATTCAACAGA-3'和5'-ATCATCCAAG-3'D.5'-ATTCAACAGA-3'和5'-GAACCTACTA-3'
突破三 引物的选择和互补链的判断
优化P142 3.(2023·福建厦门模拟)下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况,①②③④表示相关物质,L、R表示方向。下列叙述正确的是(　　)A.②链从L到R的方向为3'→5',①②链均可作为子链合成的模板B.PCR过程需要通过解旋酶断开氢键,且为边解旋边复制C.以1个DNA为模板经3次循环需消耗8个引物③D.物质③的5'端添加了某序列,至少需经2次循环才可获得该序列的双链产物
突破四 PCR循环时与引物相关的计算
Q1：在DNA扩增过程中，由于半保留复制，至少经过 次循环，才有可能获取与目的基因等长的片段。
若目的基因在DNA片段中间，则在DNA扩增过程中，由于半保留复制，至少经过 次循环，才有可能获取与目的基因等长的片段。
每次都选长度最短的DNA单链作为PCR模板 “最短原则”
若目的基因在DNA片段一侧，则在DNA扩增过程中，由于半保留复制，至少经过 次循环，才有可能获取与目的基因等长的片段。
2．（2024·黑龙江牡丹江·一模·节选）“中天杨”是由我国科学家采用生物转基因技术，历经8年时间培育成功的抗盐碱、耐干旱的杨树新品种。如图为培育“中天杨”的操作流程，①～⑥表示操作过程，该过程中可能用到的限制酶如表所示。回答下列问题。
注：Ti质粒中的 Tetr为四环素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因
(3)采用PCR技术扩增目的基因时，在PCR反应体系中需加入引物，引物的作用是 ，至少经过 次循环，可获取与目的基因等长的DNA单链。PCR完成以后，常采用 法来鉴定PCR的产物。(4)培育转基因杨树的核心工作是 ，在进行该工作时，应在mtl-D基因的两侧添加限制酶 的识别序列。
使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
琼脂糖凝胶 电泳
突破五 PCR定点突变技术
PCR定点突变技术是最常用的基因定点突变技术，通过设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入产物中。PCR定点突变技术具有突变回收率高、可在任何位点引入突变、材料和试剂容易获得、操作简单等优点，它又可以分为重叠延伸PCR、大引物PCR等。
金版 2．(2022·辽宁东北育才学校)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景。下图是利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列分析不正确的是(　　)
A．第一阶段过程中的产物是依赖引物1、引物2和引物3、引物4扩增的结果B．引物2和引物3上均含有与模板链不能互补的碱基C．PCR过程中需要先加热至90 ℃以上后再冷却至72 ℃左右D．第三阶段需要利用引物1和引物4获得目的基因
否则引物2和引物3会发生互补，导致引物失效
重叠延伸PCR是发展最早的PCR定点突变技术。该技术要使用四条引物。其中引物2和3的×处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。
专题突破练P219 2.(1)在定点诱变获取突变基因时,PCR1中使用的引物有　　 ,PCR2中使用的引物有　　　　 。PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行,原因是  　。
引物之间能结合,会干扰引物和模板链的结合,影响PCR过程
大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程如图所示。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段
专题突破练P219 2.(2)(2)PCR在第一个循环之前通常将DNA样品加热至95 ℃数分钟进行预变性处理,其目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。由于大引物较长,含C与G的碱基较多,为减少非目标基因的获得,在PCR2复性过程中应采取的措施是　　　　　　　　　　　　　。
增加大分子模板DNA彻底变性的概率
引物复性的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成、引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度。一般当引物中GC含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高复性温度。 DNA的双链主要是靠氢键联系在一起。复性温度越高，断开氢键的热能越大，引物与模板越不易结合，反之，复性温度越低，越容易形成氢键，进行复性。所以当温度高时，只有碱基匹配程度高的，也就是模板与引物形成配对数越多的引物，才能结合到模板上，这样扩增出来的条带最少，甚至只有一条，也就是引物和目的序列的完美匹配，因此特异性越高。GC碱基对含三个氢键，当GC含量高时，由于氢键作用力强，温度如果不够高的话，就很容易出现非特异性结合（由于GC比例高，虽然没法全配对，但也足够让引物和模板链结合了），因此需要提高适当复性温度。