2024届高三二轮复习生物：基因工程-限制酶，基因表达载体的构建、引物课件

这是一份2024届高三二轮复习生物：基因工程-限制酶，基因表达载体的构建、引物课件，共21页。PPT课件主要包含了限制酶，基因工程基本操作程序，与载体拼接，棉花细胞，抗虫基因，重组DNA分子，基因工程基本工具，原核生物，双链DNA分子，每一条链等内容，欢迎下载使用。
普通棉花（无抗虫特性）
抗虫棉 （有抗虫特性）
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
（①用什么方法将外源基因导入受体细胞?)（②如何保证外源基因在受体细胞内稳定存在并表达?) (③目的基因在受体细胞的哪些部位可以稳定存在并发挥作用?) (④目的基因在受体细胞中的表达产物是否发生变化?)
【限制性核酸内切酶(限制酶)]p71（1）来源:主要是从 中分离纯化出来的。（2）功能:能够识别的 某种特定的核苷酸序列，并且使 中特 定部位的两个核苷酸之间 的断开。（3）结果:形成黏性末端或平末端
【DNA连接酶](1)作用:将双链DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 。(2)常见种类:E·cli DNA连接酶( )T4 DNA连接酶( )。
是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
用于鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞
质粒有___个游离的磷酸基团
【最常用的载体运载体——质粒]p72
标记基因通常有:①抗生素的抗性基因，如: 抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)②荧光蛋白基因，如: 绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)
★载体作为载体所具备的条件及原因（p72）
①有一个至多个限制酶切割位点
供外源DNA片段（基因）插入其中
②在受体细胞中稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制
使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量
便于重组DNA分子的筛选
【最常用的载体运载体——质粒]
①作为运输工具，将外源基因导入受体细胞。
②质粒携带外源DNA片段在细胞内大量复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的
基因表达载体构建——核心p80
基因表达载体的作用（2点p80）
基因表达载体除含有目的基因外，还必须有复制原点、启动子、终止子、标记基因等。
（1）本质：有特殊序列结构的DNA片段 （2）位置：目的基因的上游 （3）功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因开始转录，进而合成出相应的mRNA
控制特定性状或表达特定产物。
基因表达载体构建——核心
（1）本质：有特殊序列结构的DNA片段 （2）位置：目的基因的下游 （3）功能：使转录在需要的地方终止 初步鉴定和筛选出含有目的基因的受体细胞。
要能与特定的受体细胞相匹配使外源基因在受体细胞中能稳定复制并遗传
问题:目的基因该插入什么位置？
目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
注意：区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。
同一种限制酶切（单酶切）
质粒重新环化目的基因自身环化质粒与目的基因反向连接(后果)
同两种限制酶切（双酶切）
防止质粒重新环化防止质粒与目的基因反向连接防止目的基因自身环化
如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SamⅠ。
所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；
为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接）可选择PstⅠ和EcRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。
（1）据图1可得到含有多个限制酶切位点的S蛋白基因序列，若要在短时间内获得大量的S蛋白基因，可采取的方法是__________，该方法的实质是进行__________。该过程需要人工合成部分核苷酸片段，合成的该片段具有的特点是_______________（答两点）；若合成的该部分核苷酸片段过短，可能带来的影响是____________________。 （2）获得足够量的S蛋白基因后须构建基因表达载体，其目的是____________________。如图2是相关的质粒，要保证S蛋白基因的正确表达，需选用___________和HindⅢ酶进行切割，且不破坏标记基因。
（2）某真菌的 W基因可编码一种高效降解纤维素的酶，已知图中 W基因转录方向为从左往右。为使放线菌能产生该酶，以图中质粒为载体进行转基因。表中是几种限制酶识别序列和切割位点。
①为了将目的基因与质粒重组且避免质粒和目的基因自身环化，最好选择________处理质粒，用________处理目的基因。②将重组质粒导入放线菌时，需要用________处理放线菌，目的是________。初步筛选导入目的基因的放线菌，可以将放线菌置于含________的培养基中培养。
①概念：②作用：③特点：④为什么要用引物？⑤设计不合理的结果：不能特异性扩增目的基因⑥引物结合到模板链的 端；DNA聚合酶与引物 端结合；脱氧核苷酸结合到引物的 端。子链的延伸方向 。⑦常见修饰加到引物的 端：
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
a.通常20-30个核苷酸序列b.两种引物之间不发生碱基互补配对c.同一种引物之间不发生碱基互补配对d.与目的基因两端的序列互补
a.加入限制酶切位点； b.放射性同位素、荧光标记物； c.增添、缺失或替换碱基（定点突变）
是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
耐高温DNA聚合酶不能从头开始DNA，只能从3’端延伸DNA链。