专题01 发酵工程与基因工程（期末考题猜想）（9大题型）（原卷版+解析版）-高二生物下学期期末考点大串讲（人教版2019）

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【题型1 传统发酵技术的应用】
【题型2 微生物的培养与应用】
【题型3 酶的研究与应用】
【题型4 基因工程的基本工具】
【题型5基因工程的基本操作程序】
【题型6 基因工程的应用】
【题型7 蛋白质工程】
【题型8 发酵工程综合】
【题型9 基因工程综合】
01传统发酵技术的应用
【例1】下列关于微生物培养和利用的叙述，正确的是（ ）
A．培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利
B．接种前需对培养基、培养皿、接种环、操作者双手等进行严格的灭菌处理
C．接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单个菌落
D．腌制泡菜的过程中亚硝酸盐含量变化是先减少后增加
【答案】C
【分析】微生物的分离：①利用该分离对象对某一营养物质的“嗜好”，专门在培养基中加入该营养物质，使该微生物大量增殖。这些物质主要是一些特殊的碳源、氮源，如纤维素可用来富集纤维素分解微生物，尿素可用来富集尿素分解微生物。
②利用该分离对象对某种抑制物质的抗性，在混合培养物中加入该抑制物质，经培养后，由于原来占优势的它种微生物的生长受到抑制，而分离对象却可趁机大量增殖，使之在数量上占优势。如筛选酵母菌和霉菌，在培养基中加入青霉素，因青霉素可抑制细菌和放线菌的细胞壁的合成，从而抑制两类微生物的生长，而酵母菌和霉菌正常生长增殖。
【详解】A、培养基中的营养物质浓度越高，外界溶液渗透压越高，菌种失水过多影响其活性，故培养基中的营养物质浓度越高，并非对微生物的生长越有利，A错误；
B、操作者的双手只能使用消毒的方法，不能使用灭菌，B错误；
C、接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单个菌落，因此，每次划线从上一次划线的末端开始，C正确；
D、大白菜腌制泡菜的过程中会产生亚硝酸盐，发酵后期亚硝酸盐被分解，因此亚硝酸盐含量变化是先增加后减少，D错误。
故选C。
【变式1-1】南通某兴趣小组按下图流程制作苹果醋。相关叙述正确的是（ ）
A．菌种甲、乙都具有线粒体，都能进行有氧呼吸
B．加糖的目的是直接为菌种甲、乙提供碳源和能源
C．菌种甲、乙发酵过程中，发酵液pH下降、温度上升
D．发酵结束后取苹果醋加酸性重铬酸钾检测发酵效果
【答案】C
【分析】由题意可知，菌种甲是酵母菌，菌种乙是醋酸菌。
【详解】A、菌种乙是醋酸菌，醋酸菌为好氧细菌，为原核生物，没有线粒体，A错误；
B、加糖不能直接为菌种乙醋酸菌提供碳源和能源，糖应先经过菌种甲生成苹果酒，菌种乙再以苹果酒为碳源和能源，B错误；
C、菌种甲、乙发酵过程中，发酵液pH下降，果酒发酵产生二氧化碳，溶于水，果醋发酵产生醋酸，两种菌代谢过程会释放热能，使温度上升，C正确；
D、酸性重铬酸钾是检测酒精的，D错误。
故选C。
【变式1-2】酿造陈醋的主要原料是高粱、麸皮、谷糠等，还需要加入一些酿造用水，酿造流程如图所示。大曲是一种由糯米、小麦、大麦等多种谷物加工而成的发酵剂，其中富含发酵酵母和细菌。糖化主要是利用大曲中微生物产生的淀粉酶将原料中的淀粉分解成单糖。下列叙述正确的是（ ）
A．为了提高发酵效率，应在原料蒸熟后立即加入大曲
B．省略糖化的步骤，对陈醋的酿造不会产生影响
C．酒精发酵和醋酸发酵所需温度不同，但都会使发酵液的pH降低
D．各种微生物都适合在陈醋中生长，因此需通过杀菌来延长保质期
【答案】C
【分析】参与果醋制作的微生物是醋酸菌，其新陈代谢类型是异养需氧型。果醋制作的原理：当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
【详解】A、原料蒸熟后，应冷却至室温后再加入大曲，以免因温度太高使大曲中的酵母等失效，A错误；
B、酵母菌可利用单糖进行发酵，糖化主要是利用大曲中微生物产生的淀粉酶将原料中的淀粉分解成单糖，省略糖化的步骤，原料中的淀粉不能充分水解为单糖，会影响陈醋的酿造，B错误；
C、醋酸发酵比酒精发酵所需的温度高，醋酸发酵会产生醋酸，使发酵液的pH降低，酒精发酵会产生CO2，也会使发酵液的pH降低，C正确；
D、陈醋中的环境偏酸性，大部分微生物都不能在其中生长，但仍有少部分微生物能生长，因此需通过杀菌来延长保质期，D错误。
故选C。
【变式1-3】某研究小组设计了一个利用作物秸秆生产燃料乙醇的小型实验。其主要步骤是：先将粉碎的作物秸秆堆放在底部有小孔的托盘中，喷水浸润、接种菌T，培养一段时间后，再用清水淋洗秸秆堆（清水淋洗时菌T不会流失），在装有淋洗液的瓶中接种酵母菌，进行乙醇发酵（酒精发酵）。实验流程如图所示。下列选项不正确的是（ ）
A．菌T可能产生分解纤维素的酶，能够高效催化纤维素分解
B．淋洗液中还需要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是合成一些氨基酸、核苷酸等含氮物质
C．可采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌，在使用该方法时需要注意必须将冷空气充分排除再开始加压
D．将酵母菌接种到灭菌后的培养基中，拧紧瓶盖，置于适宜温度下培养、发酵。发酵过程中，要始终保持密封状态
【答案】D
【分析】果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，把糖分解成二氧化碳和水；在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。故果酒的制作原理是酵母菌无氧呼吸产生酒精，酵母菌最适宜生长繁殖的温度范围是18～30℃；生产中是否有酒精的产生，可用酸性重铬酸钾来检验，该物质与酒精反应呈现灰绿色。
【详解】A、菌T能够分泌纤维素酶，纤维素酶能将纤维素最终分解为葡萄糖，因此在粉碎的秸秆中接种菌T，培养一段时间后发现菌T能够将秸秆中的纤维素大量分解，A正确；
B、培养基的主要成分：水、碳源、氮源、无机盐，其中氮源主要为合成微生物的细胞结构提供原料（微生物细胞中的含氮物质，如核酸、蛋白质、磷脂），B正确；
C、高压蒸汽灭菌法的注意要把锅内的水加热煮沸，将其中原有的冷空气彻底排除后，将锅密闭，如果高压锅内的空气未排除或未完全排除，则蒸汽不能达到饱和，蒸汽的温度未达到要求的高度，结果导致灭菌的失败，C正确；
D、果酒的制作原理是酵母菌无氧呼吸产生酒精，将酵母菌接种到灭菌后的培养基中进行酒精发酵，酒精发酵需要在无氧的条件下进行，此时拧紧瓶盖的主要目的是制造无氧环境。酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳，在发酵过程中密闭，所以需要根据发酵进程适时拧松瓶盖放出二氧化碳，D错误。
故选D。
02 微生物的培养与应用
【例2】采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上。下列叙述错误的是（ ）
A．由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物
B．平板划线法用到的接种环和稀释涂布平板法用到的涂布器均要灭菌处理
C．平板划线法操作过程中每次划线前都需要蘸取菌液
D．稀释涂布平板法统计得到的菌落数往往比活菌的实际数目要少
【答案】C
【分析】1、平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体 ，这就是菌落。
2、稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释 ，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
【详解】A、由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，A正确；
B、平板划线法用到的接种环和稀释涂布平板法用到的涂布器均要灭菌处理，防止杂菌污染，B正确；
C、平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，每次划线前不需要蘸取菌液，应灼烧灭菌，操作期间灼烧接种环的目的是保证划线时菌种来自上一次划线的末端，C错误；
D、当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以稀释涂布平板法统计得到的菌落数往往比活菌的实际数目要少，D正确。
故选C。
【变式2-1】下表为培养某种微生物的培养基配方，下列相关叙述错误的是（ ）
A．依物理性质划分，该培养基属于液体培养基
B．由培养基的原料可知，所培养微生物的同化作用类型是异养型，培养的微生物可以是酵母菌
C．若用该培养基培养筛选能分解纤维素的细菌，则应除去（CH2O），再添加纤维素作为唯一碳源
D．培养基中的唯一碳源是（CH2O），唯一氮源是NaNO3
【答案】C
【分析】微生物的营养物质主要包括碳源、氮源、水和无机盐等，有些微生物还需要特殊的营养物质，如维生素、生长因子等；培养基中含有琼脂的一般为固体培养基；选择培养基是指通过培养混合的微生物，仅得到或筛选出所需要的微生物，而其他不需要的种类在这种培养基上是不能生存的。
【详解】A、该培养基配方中没有凝固剂琼脂，依物理性质划分，该培养基属于液体培养基，A正确；
B、由培养基的原料可知，（CH2O）属于有机碳源，因此所培养微生物的同化作用类型是异养型，酵母菌是异养型微生物，B正确；
C、细菌对青霉素敏感，含青霉素的培养基不能培养细菌，因此用该培养基培养纤维素分解菌，则应除去（CH2O）和青霉素，再添加纤维素，C错误；
D、碳源是指能为微生物提供碳元素的物质，氮源是指能为微生物提供氮元素的物质，培养基中的唯一碳源是（CH2O），唯一氮源是NaNO3，D正确。
故选C。
【变式2-2】自然界中微生物种类庞杂，要对其中的某种微生物进行研究，就必须获得具纯净培养物。下列关于微生物分离和培养的叙述，错误的是（ ）
A．培养基中加入牛肉膏和蛋白胨可以同时为微生物提供碳源和氮源
B．以尿素作为唯一氮源的培养基可以分离得到能分解尿素的细菌
C．可以采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌
D．在培养霉菌时一般需要将培养基调至中性或弱碱性
【答案】D
【分析】牛肉膏、蛋白胨以为微生物提供碳源、氮源、磷酸盐和维生素等营养物质，其中牛肉膏主要提供碳源，蛋白胨主要提供氮源。不同的微生物适宜的PH值不同，菌生长繁殖所需要的pH是中性或弱碱性，霉菌适宜的pH是酸性。
【详解】A、牛肉膏和蛋白胨的主要成分是蛋白质，含有碳、氮元素，可以为微生物同时提供碳源和氮源，A正确；
B、以尿素作为唯一氮源的培养基为选择培养基，只有能分解尿素的细菌才能在该培养基上生长繁殖，B正确；
C、灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子），可以采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌，C正确；
D、培养霉菌时要将培养基的pH调至酸性，霉菌在碱性环境下不易繁殖，甚至会导致霉菌死亡，D错误。
故选D。
【变式2-3】某科研小组用如图所示方法统计1g土壤中淀粉分解菌的数量。下列叙述正确的是（ ）
A．该种方法的计数结果通常比显微镜直接计数法的结果小
B．平板中应以淀粉为唯一碳源，应选择稀释106倍的平板计数
C．应将涂布好的平板立即倒置放入30～37℃恒温箱中培养
D．经计算可知1g土壤中有5×107个淀粉分解菌
【答案】A
【分析】微生物常见的接种的方法：
（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养，在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【详解】A、题图中使用的方法为稀释涂布平板法，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此用稀释涂布平板法计数时，结果通常比实际值偏小，用显微镜直接计数法计数时，不能区分细胞死活，活菌和死菌都会被计数，因此结果通常比实际值偏大，A正确；
B、为了统计1g土壤中淀粉分解菌的数量，平板中应以淀粉为唯一碳源，为了保证结果准确，一般选择菌落数是30～300的平板计数，因此应选择稀释105倍的平板计数，B错误；
C、待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃恒温箱中培养，C错误；
D、应选择稀释105倍的平板计数，1g土壤中淀粉分解菌的数量为（59+68+62）÷3÷0.1×105=6.3×107个，D错误。
故选A。
03 酶的研究与应用
【例3】加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉。某同学通过实验比较了几种洗衣粉的去渍效果（“+”越多表示去渍效果越好），实验结果见下表。
下列叙述错误的是（ ）
A．通常用清水洗涤衣服上的新鲜血迹时，不应该使用开水
B．加酶洗衣粉A、B中添加的酶分别是蛋白酶、脂肪酶
C．表中加酶洗衣粉B和加酶洗衣粉C不宜用于洗涤蚕丝织物
D．相对于无酶洗衣粉，加酶洗衣粉去渍效果好
【答案】C
【分析】碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有的大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分子的肽，使污迹从衣物上脱落。脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶也能分别将大分子的脂肪、淀粉和纤维素水解为小分子物质，使洗衣粉具有更好的去污能力。
【详解】A、新鲜血迹含有蛋白质，开水使血中的蛋白质变性而沉淀，难以清洗，因此通常用清水洗涤衣服上的新鲜血迹时，不应该使用开水，A正确；
B、由于“+”越多表示去渍效果越好，因此据表可知，加酶洗衣粉A对血渍的洗涤效果更好，加酶洗衣粉B对油渍的洗涤效果更好，故加酶洗衣粉A、B中添加的酶分别是蛋白酶、脂肪酶，B正确；
C、蚕丝织物主要成分是蛋白质，加酶洗衣粉B对油渍的洗涤效果更好，对血渍的洗涤效果差，说明不含蛋白酶，可用于洗涤蚕丝织物，C错误；
D、“+”越多表示去渍效果越好，据表可知，相对于无酶洗衣粉，加酶洗衣粉去渍效果好，主要是因为加酶洗衣粉中的酶可以将污渍中的大分子物质分解为小分子物质，使污渍易从衣物上脱落，D正确。
故选C。
【变式3-1】酶制剂在人们的生活实践中有着广泛的应用，下列对酶的应用的叙述，正确的是（ ）
A．加酶洗衣粉中的酶在结构上比较稳定，一般直接来自生物体
B．运用果胶酶可提高果汁的产量，并使果汁变得清亮
C．由于消化酶是蛋白质，故服用多酶片辅助消化食物时，效果并不理想
D．胃蛋白酶随食糜进入小肠后可继续发挥作用
【答案】B
【分析】酶是由活细胞产生的具有催化作用的有机物，大多数酶是蛋白质，少数酶是RNA；酶的特性：专一性、高效性、作用条件温和；酶促反应的原理：酶能降低化学反应所需的活化能。
【详解】A、加酶洗衣粉中的酶不是直接来自生物体，而是经过酶工程改造，稳定性强，A错误；
B、果胶酶能分解果肉细胞壁中的果胶，使果汁变得澄清，提高果汁产量，B正确；
C、多酶片含有多种消化酶，口服进入消化道，可治疗消化不良，C错误；
D、胃蛋白酶适宜pH为1.5左右，小肠内环境为碱性，故其进入小肠后会失活，无法发挥作用，D错误。
故选B。
【变式3-2】纺织厂常用枯草芽孢杆菌生产的α-淀粉酶除去织物中的淀粉。为探究α-淀粉酶的最适温度，某科研小组在适宜条件下进行了实验，棉花初始质量为5g，每组在各自温度下保温20min后测量棉花减重，结果如下表所示。下列相关叙述错误的是（ ）
A．该实验应保证每组的α-淀粉酶浓度、体积及棉花的初始质量相同且适宜
B．每组应先将α-淀粉酶与棉花混合，再在相应温度条件下保温处理
C．图中实验结果表明α-淀粉酶的最适温度范围为55℃-75℃，具体温度还需要进一步探究
D．0℃左右时，酶的活性很低，但酶的空间结构稳定，因此酶制剂适宜在低温下保存
【答案】B
【分析】1、酶是由活细胞产生的具有催化活性的有机物，其中大部分是蛋白质、少量是RNA；
2、酶的特性：
①高效性：酶的催化效率大约是无机催化剂的107～1013倍；
②专一性：每一种酶只能催化一种或者一类化学反应；
③酶的作用条件较温和：在最适宜的温度和pH条件下，酶的活性最高；温度和pH偏高或偏低，酶的活性都会明显降低。
【详解】A、分析题意，本实验的目的为探究α-淀粉酶的最适温度，故本实验中自变量为温度，该实验中加入的α-淀粉酶的浓度、体积及棉花的初始质量等属于无关变量，应保证相同且适宜，A正确；
B、每组应先将α-淀粉酶和棉花分别预热到设置温度，再进行混合，B错误；
C、在本实验中，温度为65℃的实验组棉花减重量最大，说明其分解淀粉的效果最好，故α-淀粉酶的最适温度范围为55℃～75℃，C正确；
D、0℃左右时，酶的活性很低，是因为低温抑制了酶的活性，但未破坏酶的空间结构，因此酶制剂适宜在低温下保存，D正确。
故选B。
【变式3-3】酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，在细胞代谢中起着重要作用，在食品生产中，酶的应用非常广泛，下列说法错误的是（ ）
A．溶菌酶能够溶解细菌的细胞壁，具有抗菌消炎作用
B．酶都需在核糖体中才能合成，且只能在胞内起作用
C．果胶酶能分解果胶，提高果汁产量和澄清度
D．工业化生产啤酒时，ɑ－淀粉酶可以增强糖化作用
【答案】B
【分析】酶促反应的原理：酶能降低化学反应的活化能。酶具有专一性、高效性和作用条件温和的特性。
【详解】A、溶菌酶能够溶解细菌的细胞壁，具有抗菌消炎的作用，A正确；
B、绝大多数酶是蛋白质，需在核糖体中才能合成，少数是RNA，其合成场所不是核糖体；酶发挥作用的场所可以是细胞内，细胞外甚至是体外均可，B错误；
C、果胶酶可将果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸。因此生产果汁时，加入果胶酶可以提高果汁产量，还能提高果汁的澄清度，C正确；
D、工业化生产啤酒时，ɑ－淀粉酶可以增强糖化作用，D正确。
故选B。
04 基因工程的基本工具】
【例4】研究人员将玉米的光敏色素基因A（256bp）导入到棉花体内，对获得的1~4号转基因棉花进行基因A的检测，电泳结果如图。下列叙述错误的是（ ）
A．转基因技术用到的工具有限制酶、DNA连接酶和载体
B．可采用花粉管通道法使基因A进入棉花的胚囊
C．PCR反应过程中每次循环都要经历目的不同的两次升温和一次降温
D．由电泳结果可知，1、3和4号棉花均导入基因A且培育成功
【答案】D
【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、转基因技术需借助基因工程才能实现，因此操作过程中需要用到的工具有限制性内切核酸酶（限制酶）、DNA连接酶和载体，A正确；
B、棉花是植物，所以可以可采用花粉管通道法使基因A进入棉花的胚囊，B正确；
C、PCR反应过程中每次循环都要经历目的各不相同的两次升温（第一次使目的基因变性，第二次使目的基因延伸）和一次降温（使目的基因复性），C正确；
D、光敏色素基因A含大约256个碱基对，由图丙电泳结果可知，1、3、4号均导入光敏色素基因A成功，但转基因棉花是否培育成功还需要进行生物个体水平上的鉴定，D错误。
故选D。
【变式4-1】基因工程需要三种工具——限制酶、DNA连接酶和载体。下列相关叙述错误的是（ ）
A．不同限制酶切割后产生的DNA片段可能被某种DNA连接酶“缝合”
B．常用载体质粒的基本单位是脱氧核糖核酸，另外两种工具的基本单位是氨基酸
C．T4DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，不具有专一性
D．限制性核酸内切酶主要从原核生物中分离获得，具有识别特定核酸序列的能力
【答案】C
【分析】关于限制酶，考生可以从以下几方面把握：（1）来源：主要从原核生物中分离纯化出来。（2）特异性：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。（3）结果：形成黏性末端或平末端。
【详解】A、不同限制酶切割后产生的DNA片段可被DNA连接酶连接，A正确；
B、在三种工具中最常用载体——质粒的化学本质是DNA，其基本单位是脱氧核糖核苷酸；另外两种工具酶的化学本质是蛋白质，其基本单位是氨基酸，B正确；
C、限制酶切割产生的DNA末端有黏性末端和平末端，其中T4DNA连接酶既可以连接黏性末端，又可以连接平末端，具有特异性（专一性），C错误；
D、限制性核酸内切酶主要从原核生物中分离获得，具有识别特定核普酸序列的能力，即具有专一性，D正确。
故选C。
【变式4-2】下列关于载体的叙述中，错误的是（ ）
A．基因工程中所用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等
B．质粒DNA上要至少有一个限制酶切割位点
C．质粒是一种裸露的、结构简单、能自我复制的单链DNA分子
D．质粒上要有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选
【答案】C
【分析】运载体：
（1）常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。（质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。）
（2）作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点； ②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。
（3）天然的质粒不能直接作为载体，基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
【详解】A、基因工程常用的运载体包括质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等，A正确；
B、质粒DNA上具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接，B正确；
C、质粒是一种裸露的、结构简单、能自我复制的双链DNA分子，C错误；
D、作为载体的质粒存在特殊的标记基因，以便对重组DNA分子的筛选，D正确。
故选C。
【变式4-3】下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是（ ）
A．DNA和蛋白质都不溶于酒精
B．DNA能溶于2ml/L的NaCl溶液
C．提取DNA时，加入的酒精溶液应预冷
D．可用二苯胺试剂鉴定DNA
【答案】A
【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
【详解】A、DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，因此可初步分离DNA与蛋白质，A错误；
B、DNA可以溶于2ml/L的NaCl溶液，B正确；
C、由于DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，故在DNA粗提取与鉴定的实验中， 95%的冷酒精可提取出含杂质较少的DNA分子，C正确；
D、在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，D正确。
故选A。
05 基因工程的基本操作程序
【例5】常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段，要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列，可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述错误的是（ ）
A．对M、N段酶切时要破坏4个磷酸二酯键，获得3个DNA片段
B．可以对M、N采用不同酶切，但要形成相同的黏性末端
C．图中引物，应选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对
D．PCR仪设置温度时，一个循环依次是高温变性、中温复性、低温延伸
【答案】D
【分析】PCR只能扩增两端序列已知的基因片段，反向PCR可扩增中间一段已知序列，而两端序列未知的基因片段。酶切时用限制酶，环化时用DNA连接酶，再用引物和DNA聚合酶扩增。在环化后，通过一对方向相反的引物实现已知序列两侧基因序列的扩增。
【详解】A、每一次酶切都需要断开DNA分子的两条链，破坏两个磷酸二酯键，则对M、N段酶切时要破坏4个磷酸二酯键，获得3个DNA片段，A正确；
B、如图可知，酶切后的片段能够首尾相连，则可以对M、N采用不同酶切，但要形成相同的黏性末端，B正确；
C、PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合，为保证延伸的是已知序列两侧的未知序列，应该选择引物1和引物4，且二者间不能互补配对，C正确；
D、PCR技术的操作步骤依次是高温使DNA变性、低温复性（使DNA单链与引物结合）、中温延伸，D错误。
故选D。
【变式5-1】某二倍体动物种群有100个个体，其常染色体上某基因有A1、A2、A3三个等位基因。对这些个体的基因AA2、A3进行PCR扩增，凝胶电泳及统计结果如图所示。该种群中A3的基因频率是（ ）
A．52%B．27%C．32%D．2%
【答案】B
【分析】基因频率是指在一个种群基因库中，某个基因占全部等位基因数的比率。群体中某一特定基因的频率可以从基因型频率来推算。
【详解】据图可知，该动物种群中基因型为A3A3的有2个，A2A2的有8个，A1A1的有9个，A1A3的有15个，A1A2的有31个，A2A3的有35个，A3的基因数为2×2+15+35=54，则种群中A3的基因频率为54÷200×100%=27%，B正确、ACD错误。
故选B。
【变式5-2】当苹果削好皮或切开后放置一会儿，切口面的颜色就会由浅变深，最后变成深褐色。发生色变反应主要是因为这些植物体内存在着酚类化合物。酚类化合物易被氧化成醌类化合物，即发生变色反应变成黄色，随着反应的量的增加颜色就逐渐加深，最后变成深褐色。氧化反应的发生是由于与空气中的氧接触和细胞中酚氧化酶的释放。下图是培育抗褐变的转基因苹果的过程，下列叙述不正确的是（ ）
A．要想获得抗褐变的转基因苹果，目的基因可选择抑制酚氧化酶表达的基因
B．实施步骤①是需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与
C．步骤④阶段使用的MS培养基中要加入植物激素和卡那霉素等物质
D．为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果，可与导入含pBI121质粒的植株作对照
【答案】B
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】A、褐变是细胞中的酚氧化酶催化酚类化合物生成黄色所致，故要想获得抗褐变的转基因苹果，可选择抑制酚氧化酶表达的基因作为目的基因，A正确；
B、步骤①是目的基因表达载体的构建，该过程中需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶的参与，B错误；
C、步骤④是脱分化阶段，该阶段使用的MS培养基中要加入植物激素(影响细胞的发育方向)和卡那霉素(将含有目的基因的细胞筛选出来)，C正确；
D、为了评估目的基因抑制苹果褐变的效果，可与导入不含 目的基因质粒的植株作对照，本实验设计的目的是排除质粒导入本身对实验结果的影响，同时也能检测导入目的基因的效果，D正确。
故选B。
【变式5-3】为了获得未知序列的碱基序列，可以通过利用已知序列设计的引物对未知序列进行扩增，再对其扩增产物进行测序，其过程如图。下列叙述错误的是（ ）
A．图示过程中需要用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶
B．以环化的DNA为模板进行PCR时，应选择引物2和引物3
C．第三轮循环产物中只含有一种引物的DNA片段所占的比例为
D．常采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，产物的相对分子质量比环化DNA小
【答案】A
【分析】基因工程又叫DNA重组技术，是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，如采用基因工程技术将抗病基因导入玉米细胞，获得抗病玉米植株。
【详解】A、将含抗病基因的重组DNA导入玉米细胞，经组织培养获得抗病植株，该过程需要采用基因工程技术和植物组织培养技术，A正确；
B、抗虫小麦与矮秆小麦杂交，通过基因重组获得抗虫矮秆小麦，该过程采用的是杂交育种的方法，没有应用基因工程技术，B错误；
C、水稻F1花药经培养和染色体加倍，获得基因型纯合新品种，该过程采用的是单倍体育种的方法，没有应用基因工程技术，C错误；
D、用射线照射大豆使其基因结构发生改变，获得种子性状发生变异的大豆，该过程采用的是诱变育种的方法，没有应用基因工程技术，D错误。
故选A。
06 基因工程的应用
【例6】下列实践活动包含基因工程技术的是（ ）
A．将含抗病基因的重组DNA导入玉米细胞，经组织培养获得抗病植株
B．抗虫小麦与矮秆小麦杂交，通过基因重组获得抗虫矮秆小麦
C．水稻F1花药经培养和染色体数目加倍，获得基因型纯合新品种
D．用射线照射大豆使其基因结构发生改变，获得种子性状发生变异的大豆
【答案】B
【分析】图中涉及已知序列的切割（用到限制酶），DNA的环化（用到DNA连接酶），PCR（用到耐高温聚合酶）。PCR的原理是DNA的半保留复制。
【详解】A、图示的酶切过程需要用到限制酶，环化的过程需要用到DNA连接酶，PCR的过程需要用到耐高温的DNA聚合酶，A正确；
B、需添加方向相对的引物1和4以便DNA聚合酶从引物的3'端延伸子链，从而获得未知序列的PCR产物，B错误；
C、DNA复制为半保留复制，第三轮循环即DNA复制3次，共形成2³=8个DNA分子，其中含有最初模板链的2个DNA分子只含有引物1或引物4，其余6个DNA分子均含有引物1和引物4，所以第三轮循环产物中只含有一种引物的DNA片段所占的比例为2/8＝1/4，C正确；
D、常采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，该过程使用引物1和4对未知序列进行扩增，因此PCR产物的相对分子质量比环化DNA小，D正确。
故选B。
【变式6-1】据悉多基因编辑猪皮移植手术已获成功，下列叙述错误的是（ ）
A．为防止免疫排斥反应，应该把患者的抗体基因进行删除
B．皮肤在人体的免疫中发挥重要作用，它属于人体免疫的第一道防线
C．器官移植中的免疫排斥反应既有细胞免疫也有体液免疫
D．更多的人加入到自愿捐献器官行列中，有助于缓解供体器官的短缺
【答案】A
【分析】免疫排斥是机体对移植物（异体细胞、组织或器官）通过特异性免疫应答使其破坏的过程。一般是指移植术后，受者可识别移植物抗原并产生应答，移植物中免疫细胞也可识别受者抗原组织并产生应答。
【详解】A、为防止免疫排斥反应，应该把猪器官上的抗原基因敲除，A错误；
B、皮肤在人体的免疫中发挥重要作用，属于物理屏障，它属于人体免疫的第一道防线，B正确；
C、器官移植中的免疫排斥反应既有细胞免疫也有体液免疫，其主要是细胞免疫，C正确；
D、器官移植是将异体器官转移到受体中，更多的人加入到自愿捐献器官行列中，有助于缓解供体器官的短缺，D正确。
故选A。
【变式6-2】下列关于基因工程及其应用的叙述，正确的是（ ）
A．农杆菌转化法中农杆菌可以直接将目的基因转移到植物染色体的任意位置
B．用PCR技术检测转基因棉花Bt基因的表达情况来判断转基因抗虫棉培育是否成功
C．建构乳腺生物反应器时将特定基因导入到乳腺细胞中
D．通过基因工程获得工程菌，可用于生产人源胰岛素
【答案】D
【分析】基因工程的基本操作程序是：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。动物基因工程的应用：用于提高动物的生长速度、用于改善畜产品的品质、用转基因动物生产药物等。
【详解】A、农杆菌转化法中农杆菌可以直接将目的基因转移到植物染色体的特定位置，A错误；
B、用PCR技术检测转基因棉花Bt基因的表达情况来判断目的基因是否转入受体细胞，B错误；
C、建构乳腺生物反应器时将特定基因导入到受精卵中，C错误；
D、将人类的胰岛素基因转入微生物细胞中，获得工程菌，可用于生产人源胰岛素，D正确。
故选D。
【变式6-3】人乳铁蛋白（hLF）是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，具有抑菌、抗肿瘤等多种生理功能，被认为是一种极具开发潜力的食品添加剂。某科研团队将人乳铁蛋白（hLF）基因转入到山羊体内，从山羊的乳液中获得hLF，可以解决天然乳铁蛋白资源短缺的问题，下列有关叙述错误的是（ ）
A．可用PCR直接扩增乳铁蛋白的基因转录产物
B．重组载体中人乳铁蛋白基因的启动子是乳腺蛋白基因启动子
C．将目的基因导入山羊受精卵中一般应用的技术是显微注射法
D．检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用抗原—抗体杂交技术
【答案】A
【分析】要利用基因工程将人乳铁蛋白基因导入牛的受精卵中，从牛分泌的乳汁中提取乳铁蛋白，则将人的乳铁蛋白基因导入牛的受精卵之前，需先构建基因表达载体，这一过程需要的工具有限制（或限制性核酸内切）酶、DNA连接酶和运载体；基因表达载体上的位于基因首端的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，是目的基因在受体细胞内进行转录的起点。
【详解】A、不可以直接用PCR扩增mRNA，需将mRNA逆转录成cDNA再进行扩增，A错误；
B、为保证在供体山羊的乳汁中提取到人乳铁蛋白，需要将人乳铁蛋白基因与山羊乳腺蛋白基因的启动子等调控元件重组在一起，B正确；
C、一般用显微注射法将目的基因导入山羊受精卵中，C正确；
D、为检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译成蛋白质，检测方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若出现相应现象，则表明目的基因已翻译形成蛋白质，D正确。
故选A。
07 蛋白质工程
【例7】T4溶菌酶（A0）在温度较高时易失去活性。研究人员通过蛋白质工程对T4溶菌酶第3位上的异亮氨酸改成半胱氨酸，该处半胱氨酸可与第97位半胱氨酸之间形成一个二硫键，获得了热稳定性高的T4溶菌酶（A1）。下列说法正确的是（ ）
A．蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异
B．A0和A1空间结构的差异是二者热稳定性不同的直接原因
C．检测A1活性时可先将A1与底物混合，再置于高温环境中
D．热稳定性高的T4溶菌酶（A1）是一种直接制造出的新蛋白质，需要进行功能的鉴定
【答案】B
【分析】1、蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求；（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）
2、基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）以上是蛋白质工程特有的途径。
【详解】A、蛋白质工程和基因工程都要对基因进行操作，其操作对象相同，A错误；
B、分析题意可知，和A0相比，A1不仅仅是氨基酸的序列不同，同时还增加了一个二硫键，导致空间结构也有差异，是二者热稳定性不同的直接原因，B正确；
C、检测A1活性时应先将A1与底物分别置于高温环境，保温一段时间再混合，C错误；
D、耐热的T4溶菌酶（A1）是通过改造相应的基因而后借助基因工程的受体生产出的新蛋白质，需要进行功能的鉴定，D错误。
故选B。
【变式7-1】蛋白质工程取得的进展向人们展示出了诱人的前景，下列关于蛋白质工程应用的叙述，错误的是（ ）
A．经蛋白质工程改造后的抗体可以降低诱发免疫反应的强度
B．通过蛋白质工程改造的胰岛素类似物能抑制胰岛素的聚合
C．利用膀胱生物反应器生产人的生长激素不属于蛋白质工程
D．通过蛋白质工程制造出了一种能降解石油的“超级细菌”
【答案】D
【分析】蛋白质工程就是通过对蛋白质化学、蛋白质晶体学和蛋白质动力学的研究，获得有关蛋白质理化特性和分子特性的信息，在此基础上对编码蛋白质的基因进行有目的的设计和改造，通过基因工程技术获得可以表达蛋白质的转基因生物系统，这个生物系统可以是转基因微生物、转基因植物、转基因动物，甚至可以是细胞系统。
【详解】A、经蛋白质工程改造后的抗体可以降低诱发免疫反应的强度，A正确；
B、通过蛋白质工程改造的胰岛素类似物能抑制胰岛素的聚合，可以在临床上广泛应用，B正确；
C、科学家将人的生长激素基因插入小鼠基因组内制成膀胱生物反应器，使小鼠膀胱可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。该过程利用了基因工程的技术，即利用膀胱生物反应器生产人的生长激素，属于基因工程的应用，C正确；
D、制造出了一种能降解石油的“超级细菌”是转基因工程的产物，D错误。
故选D。
【变式7-2】研究发现，天然胰岛素制剂进入血液循环后容易形成二聚体或六聚体，皮下注射胰岛素后需要经历一个解离为单体的过程，这延缓了疗效。科研人员借助蛋白质工程改变了胰岛素中的某些氨基酸，有效抑制了胰岛素的聚合，提高了胰岛素的作用效果。下列有关叙述错误的是（ ）
A．蛋白质工程的实质是在DNA分子水平上进行设计和改造
B．氨基酸序列的差异是影响胰岛素在患者体内是否聚合的原因之一
C．改造胰岛素应首先从设计胰岛素基因中的脱氧核苷酸序列出发
D．蛋白质工程难度很大，主要是因为蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构
【答案】C
【分析】蛋白质工程的基本流程：根据中心法则逆推以确定目的基因的碱基序列：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列（基因）→DNA合成，最终还是回到基因工程上来解决蛋白质的合成。
【详解】A、蛋白质工程的基本流程为：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→据氨基酸序列推出脱氧核苷酸序列（基因）→DNA合成，最终要利用基因工程上来解决蛋白质的合成，因此蛋白质工程的实质是在 DNA 分子水平上进行设计和改造蛋白质，A正确；
B、氨基酸序列差异，导致胰岛素的空间结构有所改变，即氨基酸序列的差异是影响胰岛素在患者体内是否聚合的原因之一，B正确；
C、胰岛素属于蛋白质，改造胰岛素应首先从设计预期的蛋白质结构出发，进而根据氨基酸序列推测出基因中的脱氧核苷酸序列对原有的基因进行修饰和改造，C错误；
D、多数蛋白质除具有一级结构（即氨基酸顺序）外，还具有复杂的高级结构，即空间结构，而很多蛋白质的空间结构是人们目前还不清楚的，因此实施蛋白质工程的难度很大，D正确。
故选C。
【变式7-3】干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，在临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸（密码子：UGU、UGC）变成丝氨酸（密码子：UCU、UCC、UCA、UCG），就可以延长干扰素的体外保存时间。现采用以下方法对干扰素进行改造。下列相关叙述，错误的是（ ）
A．预期新的干扰素的功能以干扰素基因的结构和功能的关系为基础
B．对干扰素基因进行定点突变（C→G）来实现碱基的替换
C．新的干扰素基因必须插入到载体的启动子和终止子之间才能表达
D．以上过程属于蛋白质工程，实质是改造干扰素基因的结构
【答案】A
【分析】蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因来改造现有蛋白质，或者制造一种新的蛋白质，以满足人类生产生活的需求，它是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。
【详解】A、蛋白质工程的目的是根据人们对蛋白质的功能需求改造或制造蛋白质，理论基础是蛋白质的结构与功能相适应，A错误；
B、比较半胱氨酸和丝氨酸的密码子，若第二个碱基由G替换为C，就可引起氨基酸的替换，所以基因上发生定点突变（C→G），可实现基因的改造，B正确；
C、基因的表达需要启动子和终止子，新的干扰素基因必须插入到载体的启动子和终止子之间才能表达，C正确；
D、蛋白质工程的实质是对基因进行操作，操作简单，且能违传给后代，即图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结 构，D正确。
故选A。
08 发酵工程综合
【例8】苹果醋富含果胶、维生素以及多种矿物质等营养成分，具有开胃护肝、排毒养颜、减肥降脂等多种功效，是近年来的流行饮品。图甲和图乙分别表示苹果醋的基本制作流程和简易制作装置，请分析回答
(1)酵母菌是制作苹果酒的重要发酵菌种，从代谢类型看，酵母菌属于 生物；酵母菌在无氧条件下利用葡萄糖进行酒精发酵的反应式是 。酵母菌与醋酸菌细胞结构的主要区别是 。
(2)先用图乙所示装置制作苹果酒，加入鲜苹果汁总量不要超过发酵瓶体积的 。在果酒发酵过程中，气阀a、b应保持的状态分别是 、 。（填“定期开放”或“关闭”）
(3)继续用图乙所示装置制作苹果醋，除打开气阀a、b以外，还需要从气阀 处不断通入无菌空气，并将发酵温度适当 （填“升高”或“降低”）。
(4)图丙表示果酒发酵过程中，发酵液的糖度和酒精度随时间变化的关系曲线图。发酵的前24小时酒精度较低，原因是此阶段酵母菌主要进行 呼吸，大量繁殖；96小时后酒精度基本维持稳定的原因有 消耗殆尽，高浓度酒精和代谢废物会 酵母菌的代谢而影响发酵。
【答案】(1)异养兼性厌氧型 有无核膜（包被的细胞核）
(2)2/3 关闭 定期开放
(3)a 升高
(4)有氧 营养物质 抑制
【分析】1、果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，把糖分解成二氧化碳和水；在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。故果酒的制作原理是酵母菌无氧呼吸产生酒精，酵母菌最适宜生长繁殖的温度范围是18～30℃；生产中是否有酒精的产生，可用酸性重铬酸钾来检验，该物质与酒精反应呈现灰绿色。
2、果醋制作中起到主要作用的微生物是醋酸菌，醋酸菌是一种好氧细菌，只有当氧气充足时，才能进行旺盛的生理活动，其代谢类型属于异养需氧型。当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解为醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。醋酸菌的最适生长温度为30～35℃。
3、分析题图：图示表示苹果醋的制作流程图，其中①表示果酒发酵，②表示果醋发酵。
【详解】（1）果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是异养兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，把糖分解成二氧化碳和水；在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。酵母菌在无氧条件下利用葡萄糖进行酒精发酵的反应式是C6H12O62C2H5OH +能量。酵母菌为真核生物，醋酸菌为原核生物，酵母菌与醋酸菌细胞结构的主要区别是有无核膜包被的细胞核。
（2）先用图乙所示装置制作苹果酒，加入鲜苹果汁总量不要超过发酵瓶体积的2/3，在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵，发酵过程中会产生二氧化碳，因此在果酒发酵的生产过程中，应给发酵罐保持无氧环境、同时定时排出酵母菌产生的二氧化碳，以平衡瓶内气压，即气阀a关闭，气阀b定期开放。
（3）制作果醋利用的是醋酸菌，醋酸菌是好氧菌，其最适生长温度为30~35℃，若继续用图乙所示装置制作苹果醋，则需要改变的条件是①打开气阀a，不断通入无菌空气（氧气）；②将温度升高到30~35℃。
（4）依据图丙可知，随着发酵的进行，发酵液的糖度逐渐降低，酒精度逐渐升高然后保持相对稳定。发酵前24h，酵母菌主要进行有氧呼吸，大量增殖，消耗葡萄糖较少，因此糖度变化很小，酒精度上升很慢。随着发酵的进行，酵母菌进行无氧呼吸消耗葡萄糖产生酒精，96h后，营养物质消耗殆尽，高浓度的酒精和代谢废物会抑制酵母菌的代谢而影响发酵，导致酒精度和糖度的变化都趋于平缓。
【变式8-1】某生态研究小组为了从纤维素分解菌中获取纤维素酶，以便将农作物秸秆作为酿酒工业的原料，设计了如下操作流程分离提取较纯的纤维素分解菌。请分析回答问题：
①土壤取样→②选择培养→③梯度稀释→④将样品接种到鉴别（加入刚果红）纤维素分解菌的培养基上→⑤挑选菌落
(1)纤维素分解菌选择培养的培养基该如何设计 。
(2)在培养基中还要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是 。
(3)图甲所示接种方法常用的接种工具是接种环，对其通常用 法灭菌。
(4)若选择培养后预估锥形瓶中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在鉴别平板上涂布0.1ml稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落不超过200个，则至少应将锥形瓶中的菌液稀释 倍。在鉴别培养基中含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用是： （写两点）。
(5)图乙中出现的无透明带的菌落，其代谢类型（同化作用类型）最可能是 。
(6)流程图中步骤⑤的操作中，应挑选产生了 的菌落。
【答案】(1)以纤维素作为唯一的碳源
(2)参与蛋白质、核酸和磷脂等化合物的合成
(3)灼烧灭菌
(4)104 为细菌生长提供无机盐、维持培养基pH的相对稳定
(5)自养型
(6)透明圈
【分析】分解纤维素的微生物分离的实验原理：①土壤中存在着大量纤维素分解菌，包括真菌、细菌和放线菌等，它们可以产生纤维素酶。纤维素酶是一种复合酶，可以把纤维素分解为纤维二糖，进一步分解为葡萄糖使微生物加以利用，故在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长。②在培养基中加入刚果红，可与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，红色复合物不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，从而可筛选纤维素分解菌。
【详解】（1）纤维素分解菌能够产生纤维素酶，从而利用纤维素，为了分离出纤维素分解菌，应以纤维素作为唯一的碳源，这样纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长，从而达到分离的目的。
（2）氮源的主要作用是参与蛋白质、核酸和磷脂等化合物的合成。
（3）接种环常用灼烧灭菌法灭菌。
（4）要保证每个平板上长出的菌落数不超过200，假设稀释倍数为a，在每个平板上涂布0.1mL稀释后的菌液，则根据计算公式（C÷V）×M可知，至少应将锥形瓶中的菌液稀释2×107÷200×10=104倍，即至少应将锥形瓶中的菌液稀释104倍。KH2PO4和Na2HPO4是两种无机盐，其可作为缓冲物质，因此在鉴别培养基中含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有：为细菌生长提供无机盐、保持细菌生长过程中pH的稳定等。
（5）该选择培养基是以纤维素为唯一碳源的培养基，只有纤维素分解菌能生存，将该菌接种到加有刚果红的鉴别纤维素分解菌的培养基上会出现透明圈，而图乙中出现了无透明带的菌落，说明它可以利用空气中的二氧化碳合成自身需要的有机物，推测其代谢类型最可能是自养型。
（6）该选择培养基是以纤维素为唯一碳源的培养基，只有纤维素分解菌能生存，将该菌接种到加有刚果红的鉴别纤维素分解菌的培养基上会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，故流程图中步骤⑤的操作中，应挑选产生了透明圈的菌落。
【变式8-2】蒽（C14H10）是石油化工领域常见的一种多环芳烃化合物，对生物有毒且难以降解，会带来严重的环境问题，因此从土壤中分离和筛选出蒽降解菌有非常重要的意义。研究人员进行如下图实验，成功地从环境样品中分离得到蒽降解菌。已知蒽在水中溶解度低，含过量蒽的固体培养基不透明。请分析回答：
(1)蒽降解菌富集培养基含有K2HPO4、NH4Cl、CaCl2、MgSO4、FeC3、MnSO4、水等，需再加入 作为唯一碳源，该培养基属于 （填“固体”或“液体”）培养基。
(2)配制培养基时，应在灭菌 （填“前”或“后”）调pH，对配制好的培养基应采用 法进行灭菌处理。
(3)上图所示的分离、纯化、计数蒽降解菌的方法是 ，使用该方法计算得到的细菌数量与待测样品中实际的细菌数量相比往往偏 （填“多”或“少”），其主要原因是一个菌落可以来源于 个细胞。
(4)实验中若在每个平板上涂布0.1mL稀释了105倍后的菌液，且每个平板上长出的菌落数约为150个，则初步估测A中细菌细胞数为 个/mL。
(5)研究人员为了进一步筛选出高降解能力的菌种，对上图得到的菌株再次进行纯化培养，测量不同菌株形成的菌落及透明圈直径，结果见下表：
根据表中数据，可推断其中降解蒽能力最高的菌株是 。
【答案】(1)蒽 液体
(2)前 高压蒸汽灭菌（或湿热灭菌）
(3)稀释涂布平板法 少 2个或多
(4)1.5×108
(5)菌株Ⅱ
【分析】1、培养基的基本组成成分：碳源（提供能源）、氮源（参与代谢）、水（溶剂）、无机盐（保持渗透压、调节pH）。
2、微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。该方法能够分离微生物，但是不能计数。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。该方法既可以分离微生物，也可以对微生物进行计数。
【详解】（1）蒽降解菌富集培养基含有K2HPO4、NH4Cl、CaCl2、MgSO4、FeC3、MnSO4、水等，因为需要从土壤中分离和筛选出蒽降解菌，所以需再加入蒽作为唯一碳源，该培养基没有加琼脂，属于液体培养基。
（2）配制培养基时，应在灭菌前调pH，防止后续调pH造成污染，对配制好的培养基应采用高压蒸汽灭菌（或湿热灭菌）法进行灭菌处理。
（3）上图所示最后培养基中为单个菌落，所以分离、纯化、计数蒽降解菌的方法是稀释涂布平板法，使用该方法计算得到的细菌数量与待测样品中实际的细菌数量相比往往偏少其主要原因是一个菌落可以来源于2个或多个细胞。
（4）实验中若在每个平板上涂布0.1mL稀释了105倍后的菌液，且每个平板上长出的菌落数约为150个，则初步估测A中细菌细胞数为C/V×m=150/0.1×105=1.5×108。
（5）根据表中数据，可推断其中降解蒽能力最高的菌株是菌株Ⅱ，因为菌株Ⅱ的透明圈直径比菌落直径的值最高。
【变式8-3】北京传统小吃“豆汁”是一种以绿豆为原料，经过一系列制作工艺流程（如下图）得到的一种以酸味为主、掺杂着些许臭味的糊状流体食品。混浆操作通常是将老浆直接倒入绿豆乳中，混合浆的沉淀与酸化过程实际属于乳酸发酵，其主要产酸微生物为乳酸菌。回答下列问题：
(1)混合浆发酵时所需乳酸菌主要来自 。乳酸是由乳酸菌在 氧条件下产生的，其产生量是影响豆汁风味的重要因素之一。乳酸发酵过程中，能为乳酸菌同时提供碳源和能源的物质主要是 。
(2)欲测定混合浆中乳酸菌的含量多少，研究小组可采用的接种方法是 （填“平板划线法”或“稀释涂布平板法”），该方法测得的结果通常比实际值 （填“更高”、“更低”或“相同”），原因是 。
(3)为了筛选出产酸能力强的乳酸菌菌种，研究小组将不同稀释倍数的酸豆汁液接种到MRS固体（添加 ）培养基（添加质量分数1.5%碳酸钙，遇酸发生反应会出现透明圈）上，培养基常用的灭菌方法是 法，此外，实验室灭菌方法还有 。在适宜条件下培养一段时间后，应挑取 （“有”或“没有”）透明圈的菌落，进行进一步纯化。
【答案】(1)老浆 无 （绿豆乳中的）糖类
(2)稀释涂布平板法 更低 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
(3)琼脂 高压蒸汽灭菌/湿热灭菌 干热灭菌/灼烧灭菌 有
【分析】1、微生物在琼脂固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落。
2、稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。该方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
3、传统发酵食品的制作离不开各种各样的微生物。乳酸菌是厌氧细菌，在无氧的情况下能将葡萄糖分解成乳酸，可用于乳制品的发酵、泡菜的腌制等。乳酸菌种类很多，在自然界中分布广泛，空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道内都有乳酸菌分布。常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。
【详解】（1）根据题干信息：混浆操作通常是将老浆直接倒入绿豆乳中，则混合浆发酵时所需的乳酸菌主要来自老浆；乳酸菌为厌氧生物，故乳酸是由乳酸菌在无氧条件下产生的，糖类是细胞生命活动的重要能源物质，乳酸发酵过程中，（绿豆乳中的）糖类能为乳酸菌同时提供碳源和能源的物质。
（2）稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。欲测定混合浆中乳酸菌的含量多少，研究小组可采用的接种方法是稀释涂布平板法。稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目更低，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
（3）培养基常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌（或湿热灭菌），根据题干信息：碳酸钙遇酸发生反应会出现透明圈，而产酸能力强的乳酸菌，则透明圈越大，故研究小组将不同稀释倍数的酸豆汁液接种到MRS固体培养基（添加了质量分数1.5%碳酸钙，遇酸发生反应会出现透明圈）上，在适宜条件下培养一段时间后，应挑取有透明圈的菌落，进行进一步纯化。
09 基因工程综合
【例9】结球甘蓝是我国重要的蔬菜品种，危害甘蓝生长的主要是菜青虫等鳞翅目害虫。为使结球甘蓝获得抗虫性状，科研人员将苏云金芽孢杆菌中的BT毒蛋白基因导入结球甘蓝。回答下列问题：
(1)转运肽能引导细胞质中合成的蛋白质进入叶绿体。为构建BT 毒蛋白基因和转运肽基因的融合基因（见图1），需用限制酶 处理相关的DNA片段，再用 连接。
图1
注： El、 E2、 E3、E4为限制酶。
(2)构建基因表达载体时，应将融合基因插入Ti质粒的 区。用Ca2+处理农杆菌后，使细胞处于一种 的生理状态，将其与基因表达载体混合完成转化后，在添加 的培养基中，经筛选1得到含基因表达载体的农杆菌。
（注：GUS基因表达产物经染色能由无色变成蓝色）
(3)鉴定愈伤组织中是否含有目的基因，可以用分子水平检测中的 等技术，还可以通过肉眼观察选择 的愈伤组织，以确定目的基因是否 。
(4)为获得具有抗性的转基因结球甘蓝，还需要进行个体生物学水平的签定。请设计实验方案 。
【答案】(1)E1、E3、E4 DNA连接酶
(2)T-DNA 感受态 潮霉素
(3)DNA分子杂交 蓝色 表达
(4)选取长势相似的野生型和转基因结球甘蓝，分别进行抗虫接种实验，一段时间后，统计被害虫啃食的叶面积比例
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【详解】（1）由图1可知：BT毒蛋白基因和转运肽基相邻，介于启动子与终止子之间，为构建BT毒蛋白基因和转运肽基因的融合基因，需用限制酶E1、E3、E4处理相关的DNA片段，再用DNA连接酶连接。
（2）农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此构建基因表达载体时，应将融合基因插入Ti质粒的T-DNA区。用Ca2+处理农杆菌后获得感受态细胞，感受态细胞法是一种利用经过特殊处理的细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态，从而吸收周围环境中的DNA分子的方法。将其与基因表达载体混合完成转化后，由于重组质粒中含有潮霉素的抗性基因，故在添加潮霉素的培养基中，经筛选1得到含基因表达载体的农杆菌。
（3）为鉴定愈伤组织中是否含有目的基因，可利用碱基互补配对的原理，用分子水平的DNA分子杂交技术进行鉴定，也可以通过肉眼观察选择蓝色的愈伤组织，以确定目的基因是否表达。
（4）为获得具有抗性的转基因结球甘蓝，还可以通过选取长势相似的野生型和转基因结球甘蓝，分别进行抗虫接种实验，一段时间后，统计被害虫啃食的叶面积比，进行个体水平的检测。
【变式9-1】毕赤酵母（能以甲醇为唯一碳源）可作为生产抗原蛋白的工程菌。研究人员以pPIC9K质粒为载体，构建含乙型肝炎病毒表面抗原蛋白基因HBsAg的重组质粒，酶切后导入毕赤酵母，经同源重组整合到其染色体DNA上并实现复制与表达，部分过程如下图。其中5'AOX1为AOX1基因启动子（一种甲醇诱导型启动子），3'AOX1（TT）为AOX1基因终止子，3'AOX1为AOX1基因的部分序列（同源重组的重要位点之一），Bg1Ⅱ、SacⅠ、SnaBⅠ和AyrⅡ为限制酶酶切位点，HBsAg基因中“→”表示基因转录方向。回答下列问题。
(1)过程①PCR除需要加入Taq酶、dNTP、缓冲液、Mg2+外，还需加入 和 。
(2)为了后续将目的基因定向插入质粒，在进行过程①时应在HBsAg基因两侧的A和B端分别添加的碱基序列是 、 。
(3)过程③需用一定浓度的 处理大肠杆菌使其成为感受态细胞，将重组质粒导入大肠杆菌的目的是 。
(4)若用限制酶SnaBⅠ、Bg1Ⅱ联合酶切pPIC9K质粒，获得的DNA片段的长度分别是38kb、27kb、67kb用限制酶BgⅢ、AvrⅡ联合酶切pPIC9K质粒，得到的DNA片段的长度分别是38kb、40kb、54kb：已知HBsAg基因长度是55kb。则过程⑤应选用的限制酶是 ，获得的重组DNA的长度为 。
(5)转化的酵母菌需在培养基中加入甲醇，其目的是 。
【答案】(1)模板 引物
(2)TACGTA CCTAGG
(3)CaCl2（Ca2+溶液） 使重组质粒在大肠杆菌中复制得以扩增
(4)Bg1Ⅱ 136kb
(5)诱导HBsAg基因表达，同时也为毕赤酵母提供能量
【分析】据图分析：①为PCR扩增获得目的基因；②为重组DNA分子的构建；③将重组DNA分子导入受体细胞；④利用大肠杆菌扩增重组质粒；⑤酶切获得重组DNA分子。
【详解】（1）过程①PCR除需要加入Taq酶、dNTP、缓冲液、Mg2+外，还需加入模板和引物。
（2）题干信息“5'AOX1为AOX1基因启动子，3'AOX1（TT）为AOX1基因终止子，3'AOX1为AOX1基因的部分序列（同源重组的重要位点之一）”，分析可知HBsAg基因应该插入到5'AOX1和3'AOX1之间。结合质粒分析5'AOX1和3'AOX1之间存在SnaBI和AyrⅡ两种限制酶酶切位点，且HBsAg基因转录方向是由A到B，因此为了保证PCR扩增产物定向插入质粒，应选择在HBsAg基因两侧的A和B位置添加的碱基序列分别是TACGTA和CCTAGG。
（3）过程③是将重组质粒导入大肠杆菌，因此需要一定浓度的CaCl2（Ca2+溶液）处理大肠杆菌，增大其细胞膜的通透性，使其成为感受态细胞，有利于重组质粒的导入。据图分析，④大肠杆菌扩增后产生了大量的重组质粒，因此将重组质粒导入大肠杆菌的目的是使重组质粒在大肠杆菌中复制得以扩增。
（4）据图中的重组DNA分析（5'AOX1端是黑色标注，3'AOX1为斜线标注），3'AOX1即AOX1基因终止子是位于卡拉霉素抗性基因后，因此过程⑤应选用的限制酶是BglⅡ。结合题干信息和质粒上的酶切位点分析：以顺时针方向统计，BglⅡ和SnaBI之间的长度为27Kb，SnaBI和AyrⅡ之间的长度为23Kb，AyrⅡ和BglⅡ之间的长度为54Kb，BglⅡ和BglⅡ之间的长度为38Kb。已知HBsAg基因长度是55kb，因此获得的重组DNA的长度为27+54+55=136Kb。
（5）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入甲醇，其目的是诱导HBsAg基因表达，同时也为毕赤酵母提供能量。
【变式9-2】T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，但是它在温度较高时容易失去活性。科研人员借助PCR技术对T4溶菌酶的基因进行改造，使T4溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱氨酸，并将改造的基因与质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐热型的T4溶菌酶，改造后的T4溶菌酶基因如图所示，其中①～④表示引物。回答下列问题：
(1)为了使扩增后的T4溶菌酶基因中含有改造后的序列，要选择的图中的引物组合最好是 。
(2)PCR扩增时需要使用耐高温的DNA聚合酶，这种酶的作用是 ；同时需要通过控制温度使DNA复制在体外反复进行，图中两种引物能够与两条单链DNA结合的温度是 ℃左右。
(3)为了使扩增后的T4溶菌酶基因能够与下图中的质粒A正确连接，设计引物时需要在两种引物的 （填“3'”或“5'”）端连接上限制酶 识别和切割的序列。
(4)将重组质粒A导入大肠杆菌之前一般要先用 处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态。初步筛选含有重组质粒A的大肠杆菌的方法是 。
【答案】(1)②③
(2)催化合成DNA子链 50
(3)5' SalⅠ和BamHⅠ
(4)Ca2＋ 将大肠杆菌接种到含有氨苄青霉素的培养基上进行培养，从而初步将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来
【分析】PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术。
【详解】（1）根据T4溶菌酶基因的编码序列可知，替换的碱基在编码序列中，要选择的引物应该把编码序列全部扩增在内，故所用的引物是②③。
（2）PCR扩增时需要使用耐高温的DNA聚合酶，DNA聚合酶能够催化合成DNA子链，两种引物与两条单链DNA的结合发生在复性阶段，复性时的温度是50℃左右。
（3）在对T4溶菌酶基因进行PCR扩增时，须在引物的5'端添加限制酶的切割位点，根据图中结构可知，不能选择EcRⅠ来切割，以免将氨苄青霉素抗性基因破坏，因此需要选择SalⅠ和BamHⅠ两种限制酶，这两种限制酶的识别序列连接在引物的5′端。
（4）为了使重组DNA能够进入大肠杆菌，一般要先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态。由于重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，导入了重组质粒的大肠杆菌能够抗氨苄青霉素，因此可将大肠杆菌接种到含有氨苄青霉素的培养基上进行培养，从而初步将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来。
【变式9-3】人胰岛素原基因（insulin）在大肠杆菌中表达时易形成不溶性、无活性的包涵体，增加了胰岛素的生产成本。以NusA蛋白作为N端标签时可提高融合蛋白的可溶性。若让大肠杆菌表达出带有NusA蛋白标签的人胰岛素原融合蛋白（His—NusA—insulin），再经蛋白酶酶切，即得到可溶性人胰岛素原，为降低胰岛素生产成本提供基础。下图为构建重组质粒pHis—NusA—insulin的基本流程，Ampr为氨苄青霉素抗性基因。Taq为四环素抗性基因，几种限制酶的酶切位点已在图中标注。人胰岛素原基因中不含这几种限制酶的识别序列，实验所用大肠杆菌对氨苄青霉素和四环素均敏感。回答下列问题：
(1)经过程①，即PCR可大量扩增人胰岛素原基因，该过程中除了需要向反应体系内添加引物1、2和人胰岛素原基因外，还要添加 （答两点）等，图中引物1、2的 （填“3'”或“5'”）端应分别添加 的识别序列。除限制解外，过程②还需要用到 酶。
(2)先将重组载体1导入经 处理后的大肠杆菌，为便于筛选，该大肠杆菌培养基中应添加 。
(3)重组载体1和2在构成表达调控元件上的区别在于前者 。欲获得重组载体2，则载体2的 （填“A”“B”或“A和B”）区域应具有EcRⅠ和HindⅢ的识别序列。含有重组载体2的大肠杆菌，在含有四环素的培养基中 （填“能”或“不能”）生存并大量增殖。
(4)若要从个体水平鉴定合成的胰岛素是否具有生物活性，则实验组的操作是 。
【答案】(1)4种脱氧核苷酸、Taq酶（或耐高温的DNA聚合酶）、缓冲液等 5' EcRⅠ、HindⅢ DNA连接
(2)Ca2+ 氨苄青霉素
(3)不含启动子和终止子 B 能
(4)给实验动物（如2型糖尿病小鼠）静脉注射合成的胰岛素，并监测其血糖变化
【分析】基因工程技术的基本步骤：
1、目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
2、基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
3、将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
4、目的基因的检测与鉴定：
（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--PCR技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--PCR技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。
（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）利用PCR扩增目的基因时，除了需要向反应体系内添加两种引物、目的基因外，还要添加4种脱氧核苷酸、Taq酶（耐高温的DNA聚合酶）、缓冲液等。据图可知，经PCR获得的目的基因要插入经EcRⅠ、HindⅢ切割的载体中，且启动子在EcRⅠ切口端。目的基因的转录方向由左向右，因此，引物1、2的应分别构建EcRⅠ、HindⅢ的识别序列。子链的延长由引物5'端向3'端，限制酶切割时，不能切割到目的基因片段，因此，限制酶识别序列应添加在引物1、2的5'端。过程②，即构建重组表达载体时还需要使用到DNA连接酶。
（2）导入重组载体前可先用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于易于吸收周围环境中DNA分子的状态。为便于筛选，该大肠杆菌培养基中应添加氨苄青霉素。
（3）据图可知，重组载体1和2在构成表达调控元件上的区别在于前者不含启动子和终止子。若欲获得重组载体2，则载体2的B区域应具有EcRⅠ和HindⅢ的识别序列。含有重组载体2的大肠杆菌，能在含有四环素的培养基中生存并大量增殖。
（4）若要从个体水平鉴定合成的胰岛素是否具有生物活性，则实验组的操作可以是给实验动物静脉注射合成的胰岛素，并监测其血糖变化。
成分
NaNO3
K2HPO4
KCl
MgSO4•7H2O
FeSO4
（CH2O）
H2O
青霉素
（可杀死细菌）
含量
3g
1g
0.5g
0.5g
0.01g
30g
1L
0.1万单位
加酶洗衣粉A
加酶洗衣粉B
加酶洗衣粉C
无酶洗衣粉（对照）
血渍
+++
+
+++
+
油渍
+
+++
+++
+
组别
1
2
3
4
5
6
棉花减重/g
0
0.12
0.16
0.22
0.23
0.15
温度/℃
25
35
45
55
65
75
编号
菌落直径（C，mm）
透明圈直径（H，mm）
H/C
菌株I
8.1
13.0
1.6
菌株Ⅱ
5.1
11.2
2.2
菌株Ⅲ
9.5
17.1
1.8